青光安Ⅱ號(hào)方對(duì)慢性高眼壓大鼠視網(wǎng)膜熱休克蛋白的影響

劉悅，周亞莎，徐劍，彭俊，張又葦，戴宗順，覃艮艷，王英，彭清華，陳向東

青光眼（glaucoma）是指當(dāng)眼壓超過(guò)眼內(nèi)組織、特別是視神經(jīng)所能承受的限度，引起視杯凹陷，視神經(jīng)萎縮及視野缺損的眼病[1]。其損害機(jī)制目前尚不明確，大量研究表明，異常升高的眼壓是導(dǎo)致青光眼性視神經(jīng)損害的最主要因素。流行病學(xué)研究表明，青光眼總發(fā)病率1%，45歲以后，發(fā)病率上升到2%，根據(jù)世界衛(wèi)生組織收集的資料統(tǒng)計(jì)，21世紀(jì)初全球青光眼患者已達(dá)7280萬(wàn)，其中超過(guò)10%的患者最終失明。關(guān)于青光眼的治療，目前主要是通過(guò)藥物及手術(shù)的方法將眼壓降至安全的靶眼壓范圍，但是目前仍然沒(méi)有一種藥物可以有效的恢復(fù)由高眼壓造成的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞死亡而導(dǎo)致的視力喪失、視野缺損等視功能損害。因此，青光眼的治療不僅要重視降眼壓，同時(shí)也要注重保護(hù)視功能[2]。熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）是一種因熱休克、生理逆境、組織損傷、病原體感染等應(yīng)激條件下表達(dá)提高的應(yīng)激蛋白。大量研究表明[3-6]，HSP在抗凋亡中有非常重要的作用，在視神經(jīng)損傷時(shí)，其在視網(wǎng)膜中的表達(dá)量會(huì)應(yīng)激性上升，起到保護(hù)視神經(jīng)的作用。

本實(shí)驗(yàn)采用烙閉上鞏膜靜脈的方法建立大鼠慢性高眼壓模型，運(yùn)用青光眼Ⅱ號(hào)方對(duì)實(shí)驗(yàn)性慢性高眼壓（elevated intraocular pressure,EIOP）大鼠進(jìn)行干預(yù)，觀察慢性EIOP大鼠視網(wǎng)膜中HSP表達(dá)的變化，為中醫(yī)藥治療視網(wǎng)膜視神經(jīng)疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物藥物試劑及儀器

質(zhì)量檢驗(yàn)合格 （合格證編號(hào)：43004700016136）的雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量180～200 g，SPF級(jí)，遠(yuǎn)交系，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。青光安Ⅱ號(hào)方：由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科提供。加水提取2次。一煎加8倍量水提取1.5 h；二煎加6倍量水提取1 h；合并提取液，過(guò)濾，濃縮，制成浸膏，4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｒ婷}康分散片：湖南湘雅制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字：Z20080073。HSP27抗體由美國(guó)bioworld公司提供，HSP60、HSP70抗體均由美國(guó)proteintech公司提供。接觸式眼壓筆Tono-Pen，由美國(guó)Reichert公司提供，型號(hào)：AVIA。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組、模型建立及給藥

將40只大鼠隨機(jī)抽取6只作為空白組，剩余34只采用燒灼鞏膜表淺靜脈法建立大鼠慢性高眼壓模型。造模前1 d，除空白組外，其余所有大鼠術(shù)前8 h禁水禁食。選用對(duì)眼壓無(wú)明顯影響的1%苯巴比妥鈉3.5 mL/kg腹腔注射麻醉。麻醉滿意后，用眼壓計(jì)測(cè)得雙眼基礎(chǔ)眼壓并記錄。參照文獻(xiàn)方法[7]，選擇大鼠雙眼鼻側(cè)鞏膜表淺靜脈2條及顳側(cè)鞏膜表淺靜脈1條，將其與周圍眼組織分離后，使用眼科一次性燒灼器燒灼此3條表淺靜脈，直至血流中斷，術(shù)中需小心細(xì)致操作，以免損傷臨近眼部組織。術(shù)畢術(shù)眼涂復(fù)方妥布霉素（典必舒）眼膏，術(shù)后第2天開始，每日滴復(fù)方妥布霉素（典必舒）滴眼液3次，每次1滴，持續(xù)1周預(yù)防感染。術(shù)后眼壓連續(xù)56 d均持續(xù)在25 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）以上視為造模成功。若術(shù)后眼壓未見上升，或上升后回降，則進(jìn)行二次造模，方法為：再一次燒灼2根鞏膜表面靜脈。若第二次造模也失敗，則將造模失敗鼠剔除本次實(shí)驗(yàn)研究范圍。將造模成功的大鼠30只按隨機(jī)數(shù)字表法分為5組，每組6只，分別為：模型組、青光安Ⅱ號(hào)方低、中、高劑量組、益脈康組。

給藥方法：根據(jù)人和動(dòng)物間按體表面積折算的等效劑量比值表，折算系數(shù)為0.018，計(jì)算出灌胃劑量為：空白組、模型組：生理鹽水 12 mL/（kg·d）；青光安Ⅱ號(hào)方低、中及高劑量組：青光安Ⅱ號(hào)方浸膏6.75g/（kg·d）（相當(dāng)于成人等效劑量）、13.5g/（kg·d）（相當(dāng)于成人 2 倍等效劑量）及 27g/（kg·d）（相當(dāng)于成人 4 倍等效劑量）。益脈康組：益脈康分散片 0.22 g/（kg·d）。每只大鼠根據(jù)體重，按以上灌胃量每日灌胃1次。所有實(shí)驗(yàn)大鼠每周稱1次體重，重新計(jì)算給藥劑量以免因大鼠體重的增加影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.3 取材及HE染色

分別于造模后14、28 d進(jìn)行取材：1%苯巴比妥鈉腹腔注射麻醉（麻醉劑量同前），麻醉滿意后摘除雙眼眼球，斷頸處死。每組隨機(jī)選取1只眼球，行常規(guī)病理切片，光鏡下觀察視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)改變。將行病理切片的眼球保存于4%多聚甲醛溶液中固定待用，余下眼球摘除后在解剖顯微鏡下去除眼前節(jié)組織，用顯微鑷仔細(xì)剝離出視網(wǎng)膜組織（注意盡量保存視網(wǎng)膜的完整性），保存于-80℃的冰箱中待用。

HE染色：從固定液中取出視網(wǎng)膜標(biāo)本，梯度酒精脫水，二甲苯浸泡，浸蠟，包埋，切片成5 μm厚，烘干，脫蠟，然后行常規(guī)HE染色，400倍光學(xué)顯微鏡下觀察HE染色標(biāo)本視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)變化。

1.4 檢測(cè)HSP27、HSP60及HSP70的表達(dá)

Western blot法：（1）樣品制備：剪取0.25 g組織，勻漿，裂解，離心后取上清液。（2）蛋白濃度檢測(cè)：根據(jù)BCA蛋白定量試劑盒的使用說(shuō)明書進(jìn)行操作，測(cè)定樣品的蛋白濃度。（3）western blot：電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗孵育，二抗孵育后將ECL化學(xué)發(fā)光液與膜孵育3 min，用吸水紙把液體吸盡，用保鮮膜包裹雜交膜，在暗盒中和X膠片曝光幾秒至數(shù)分鐘；顯影沖洗。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±s）表示。原始計(jì)量資料進(jìn)行正態(tài)性分布及方差齊性檢驗(yàn)，若滿足正態(tài)性和方差齊性，多組比較采用方差分析；不滿足正態(tài)性和方差齊性時(shí)，則用 Dunnett’s T3比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 眼壓

造模后第56天，68只鼠眼中有13只眼眼壓正常，55只眼維持高眼壓，造模成功率為81%。造模前6組大鼠眼壓組間比較，P＞0.05，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。造模后第1天，各組大鼠眼壓與空白組比較，P＜0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明手術(shù)后第1天，各組大鼠眼壓均有明顯上升。造模后第56天，各組大鼠眼壓值與空白組比較，P＜0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明術(shù)后第56天，各組大鼠眼壓值仍持續(xù)在較高水平。手術(shù)后不同時(shí)期各組眼壓值與該組術(shù)前比較：除空白組外，其余各組大鼠眼壓值在術(shù)后第1天和術(shù)后第56天與術(shù)前比較，P＜0.01，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；術(shù)后第56天和術(shù)后第1天比較，P＞0.05，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明除空白組外，各組大鼠造模后第1天及造模后第56天眼壓均較手術(shù)前明顯上升，且維持在高眼壓狀態(tài)（表1）。

表1 手術(shù)前后不同時(shí)間各組大鼠眼壓平均值(xˉ±s,mm Hg)

2.2 HE染色

空白組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)外核層等各層結(jié)構(gòu)排列有序，形態(tài)規(guī)則（圖1）。灌胃后第14天：模型組視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層水腫，排列疏松，形態(tài)欠規(guī)則，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層及內(nèi)核層細(xì)胞減少（圖2A）。青光安Ⅱ號(hào)方高、中、低劑量組及益脈康組視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層稍有水腫，排列較疏松，形態(tài)尚規(guī)則，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層及內(nèi)核層細(xì)胞較空白組有所減少（圖2B~2E）。灌胃后第28天：模型組視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層水腫加重，排列疏松，形態(tài)不規(guī)則，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層及內(nèi)核層萎縮，細(xì)胞明顯減少（圖3A）。青光安Ⅱ號(hào)方低及中劑量組視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層水腫稍有減輕，排列較整齊，形態(tài)較規(guī)則，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層及內(nèi)核層未見明顯萎縮，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量較2周前無(wú)明顯減少（圖3B~3C）；而高劑量組視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層水腫明顯減輕，視網(wǎng)膜各層排列較整齊，形態(tài)較規(guī)則，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層及內(nèi)核層未見萎縮，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞較2周前未見減少（圖3D）。益脈康組視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層水腫未見明顯加重，視網(wǎng)膜各層排列較整齊，形態(tài)尚規(guī)則，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層及內(nèi)核層未見明顯萎縮，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞較14天前略有減少（圖 3E）。

圖1 空白組視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)，光鏡下可見視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)排列有序，形態(tài)規(guī)則 圖2 灌胃后14 d光鏡下各組視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)。2A模型組視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層水腫，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層及內(nèi)核層細(xì)胞減少。2B~2E為青光安Ⅱ號(hào)方高、中、低劑量組及益脈康分散片組，可見視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層稍有水腫，排列較疏松，形態(tài)尚規(guī)則，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層及內(nèi)核層細(xì)胞較空白組有所減少 圖3 成模后28 d光鏡下觀察視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)。3A模型組視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層水腫加重，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層及內(nèi)核層萎縮；3B~3C青光安Ⅱ號(hào)方低及中劑量組視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層水腫稍有減輕，而高劑量組（3D）視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層水腫明顯減輕。3E益脈康組視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層水腫未見明顯加重，視網(wǎng)膜各層排列較整齊，形態(tài)尚規(guī)則 HE染色 ×400

2.3 Western blot結(jié)果

將曝光后的底片掃描，并用quantity one專業(yè)灰度分析軟件進(jìn)行分析。三種熱休克蛋白無(wú)論是灌胃14 d還是28 d，各組與模型組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

視網(wǎng)膜HSP27表達(dá)的相對(duì)灰度值比較：灌胃14 d，青光安Ⅱ號(hào)方低、中劑量組與益脈康組比較，P低=0.365、P中=0.231，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而高劑量組與益脈康組比較，P=0.032，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。青光安Ⅱ號(hào)方低劑量組與中、高劑量組比較，P中=0.760、P高=0.180；中劑量組與高劑量組比較，P=0.292，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。灌胃28 d，青光安Ⅱ號(hào)方低、中及高劑量組與益脈康組比較，P低=0.018、P中=0.010、P高=＜0.001，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。青光安Ⅱ號(hào)方低、中劑量組與高劑量組比較，P低=0.002、P中=0.003，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；青光安Ⅱ號(hào)方低劑量組與中劑量組比較，P=0.764，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明青光安Ⅱ號(hào)方各濃度及益脈康灌胃均可促進(jìn)EIOP大鼠視網(wǎng)膜HSP27的表達(dá)，其中以青光安Ⅱ號(hào)方高劑量組效果最優(yōu)。

視網(wǎng)膜HSP60表達(dá)的相對(duì)灰度值比較：灌胃14 d，青光安Ⅱ號(hào)方低、中及高劑量組與益脈康組比較，P低=0.517、P中=0.116、P高=0.063， 差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。青光安Ⅱ號(hào)方低劑量組與中、高劑量組比較，P中=0.033、P高=0.017，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而中劑量組與高劑量組比較，P=0.745，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。灌胃28 d，青光安Ⅱ號(hào)方低、中及高劑量組與益脈康組比較，P低=0.025、P中=0.010、P高＜0.001， 差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。青光安Ⅱ號(hào)方低、中劑量組與高劑量組比較，P低=0014、P中=0.033，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而低劑量組與中劑量組比較，P=0.671，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明青光安Ⅱ號(hào)方各濃度及益脈康灌胃均可促進(jìn)EIOP大鼠視網(wǎng)膜HSP60的表達(dá)，其中以青光安Ⅱ號(hào)方高劑量組效果最優(yōu)。

視網(wǎng)膜HSP70表達(dá)的相對(duì)灰度值比較：灌胃14d，青光安Ⅱ號(hào)方低、中及高劑量組與益脈康組比較，P低=0.603、P中=0.794、P高=0.130，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。青光安Ⅱ號(hào)方低劑量組與高劑量組比較，P=0.048，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而低劑量組與中劑量組、中劑量組與高劑量組比較，P低=0.438，P中=0.202， 差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。灌胃28 d，青光安Ⅱ號(hào)方低、中及高劑量組與益脈康組比較，P低=0.012、P中＜0.001、P高＜0.001， 差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；青光安Ⅱ號(hào)方低劑量組與高劑量組比較，P=0.023，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而低劑量組與中劑量組、 中劑量組與高劑量組比較，P低=0.079、P中=0.542，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明青光安Ⅱ號(hào)方各濃度及益脈康灌胃均可促進(jìn)EIOP大鼠視網(wǎng)膜HSP70的表達(dá)，其中以青光安Ⅱ號(hào)方高、中劑量組效果最優(yōu)（表2）。

表2 各組大鼠視網(wǎng)膜HSP表達(dá)的相對(duì)灰度值(xˉ±s,%)

3 討論

青光眼屬于中醫(yī)學(xué) “五風(fēng)內(nèi)障”的范疇，公元752年的《外臺(tái)秘要》一書中，最早提出了“烏風(fēng)”“綠翳青盲”等概念。導(dǎo)師彭清華教授在數(shù)年的理論研究及臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，除神水淤積之外，脈絡(luò)瘀滯(血瘀)亦是其重要的病理改變，兩者互為因果、并相互影響，從而加重病情；而慢性高眼壓引起的視神經(jīng)損傷多發(fā)生在青光眼疾病的后期，病程較長(zhǎng)，久病多虛多瘀。流行病學(xué)調(diào)查表明，該病老年患者發(fā)病率較高，故多有肝腎虧虛、氣陰不足的病理機(jī)制，且肝腎的功能與眼病的發(fā)生有著密切的聯(lián)系，因此，導(dǎo)師認(rèn)為慢性高眼壓引起的視神經(jīng)損傷的病因病機(jī)為：肝腎虧虛，氣虛血瘀，治療上當(dāng)以滋補(bǔ)肝腎為主，兼以益氣活血，基于該治則創(chuàng)立了青光眼Ⅱ號(hào)方。

近年來(lái)，眾多的研究表明青光眼引起的視神經(jīng)損傷主要與視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（retinal ganglion cell,RGC）的凋亡有關(guān)，因此，阻斷或減少RGC凋亡的途徑成為了防治青光眼視神經(jīng)損傷的焦點(diǎn)。HSP是一個(gè)應(yīng)激性蛋白家族，其分子量為10-90kDa，常作為一種分子伴侶參與到蛋白質(zhì)的折疊、修復(fù)與退變中，它在抗凋亡中有非常重要的作用，在視神經(jīng)損傷時(shí)，其在視網(wǎng)膜中的表達(dá)量會(huì)應(yīng)激性上升，起到保護(hù)視神經(jīng)的作用。HSP主要通過(guò)以下幾個(gè)途徑來(lái)發(fā)揮抗凋亡的作用[8]：（1）對(duì)線粒體功能的保護(hù)作用；（2）對(duì)SAPK/JNKs激活的抑制作用；（3）抑制凋亡激活基因p53、Bax 的表達(dá)；（4）抑制自由基的生成；（5）抑制凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的蛋白水解酶。根據(jù)HSP分子量的大小， 可分為 HSP25、HSP27、HSP60、HSP70 和 HSP90等不同分子量的亞群。HSP27被證實(shí)在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞及視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層中有表達(dá)，且在實(shí)驗(yàn)性高眼壓大鼠模型中表達(dá)增加[9]。Tezel等[10]對(duì)正常人尸體眼睛視網(wǎng)膜中的HSP分布進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，HSP60主要存在于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中。Yamaguchi等[11]通過(guò)對(duì)大鼠視網(wǎng)膜中HSP70的分布進(jìn)行動(dòng)態(tài)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HSP70首先在視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，隨后開始在視神經(jīng)纖維中開始表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)主要研究青光安Ⅱ號(hào)方對(duì)慢性高眼壓大鼠模型視網(wǎng)膜中 HSP27、HSP60、HSP70的影響。

本實(shí)驗(yàn)成功建立了慢性EIOP大鼠模型，維持高眼壓狀態(tài)56 d后開始用青光安Ⅱ號(hào)方不同劑量及益脈康分散片進(jìn)行干預(yù)，并與模型組進(jìn)行比較，灌胃14d及28 d后分時(shí)段取材。結(jié)果表明：（1）正常大鼠視網(wǎng)膜中有HSP27、HSP60及HSP70的表達(dá)，造成慢性EIOP模型后，其表達(dá)增加，說(shuō)明造模后，該三種熱休克蛋白會(huì)應(yīng)激性增高，可能與RGC凋亡有關(guān)。（2）與EIOP模型組比較，青光安Ⅱ號(hào)方能促進(jìn)實(shí)驗(yàn)性EIOP大鼠HSP27、HSP60、HSP70的表達(dá)，說(shuō)明青光安Ⅱ號(hào)方可能對(duì)慢性EIOP大鼠視神經(jīng)損傷有保護(hù)作用。