高海拔地區(qū)視網(wǎng)膜靜脈阻塞氣虛血瘀證患者外周血VEGF及ET-1表達(dá)的差異

楊艷 ，王仁嬡 ，吳萍 ，黃寧斌 ，尚虎虎 ，馬錫玲

視網(wǎng)膜靜脈阻塞 （retinal vein occlusion,RVO）是高原地區(qū)常見眼底疾病，屬中醫(yī)“暴盲”范疇，是眼科典型的血瘀證候，但是臨床大多數(shù)患者，又兼有氣虛的表現(xiàn)[1]，從中醫(yī)理論角度研究低氧環(huán)境對機(jī)體的影響是一項(xiàng)重要的研究課題。血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）和內(nèi)皮素-1（endothelin-1,ET-1）均為血管活性物質(zhì)，在調(diào)節(jié)血管舒縮及血管重建中起重要作用，已日益被人們所重視。本課題通過對不同海拔環(huán)境下氣虛血瘀證RVO患者VEGF以及ET-1的檢測，研究其表達(dá)水平的變化及差異，探討高原氣虛血瘀的本質(zhì)，為以后更加深入的研究高原氣虛血瘀證打下基礎(chǔ)。

1 對象與方法

1.1 研究對象

2012年1月—2015年1月，經(jīng)青海大學(xué)附屬醫(yī)院眼科門診或病房收集確診為氣虛血瘀證的單眼RVO患者60例，分屬于兩個(gè)不同的海拔地區(qū)。西寧地區(qū) （平均海拔2000 m）RVO患者30例，男性16例，女性14例；年齡最小41歲，最大75歲，平均（56±1.2） 歲；CRVO 19 例，BRVO 11 例； 缺血型 12例，非缺血型18例；合并有高血壓病者15例。格爾木市（平均海拔2800 m，患者居住地在海拔3000 m以上）選取RVO患者30例，男性21例，女性9例；年齡最小 45 歲，最大 81 歲，平均（51±2.3）歲；CRVO 13例，BRVO 17例；缺血型16例，非缺血型14例；合并有高血壓者19人。同期收集西寧地區(qū)及格爾木市的正常人各30例。所有被納入者均為世居人群，經(jīng)門診或住院確診。研究方案已通過醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，對所有受試者均進(jìn)行知情同意并簽署知情同意書。

RVO診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照人民衛(wèi)生出版社出版的十二五規(guī)劃教材《眼科學(xué)》[2]中的診斷標(biāo)準(zhǔn)。（1）視力減退，或眼前黑影飄動(dòng)；（2）眼底檢查，視網(wǎng)膜靜脈擴(kuò)張迂曲，視網(wǎng)膜表層火焰狀或片狀出血，棉絨斑，水腫，絮狀滲出，或伴有玻璃體積血、黃斑水腫等；（3）熒光素眼底血管造影（FFA）：視網(wǎng)膜靜脈充盈時(shí)間延遲，管壁滲漏，并出現(xiàn)視網(wǎng)膜毛細(xì)血管缺血無灌注區(qū)。

氣虛血瘀證標(biāo)準(zhǔn) 參照普通高等教育中醫(yī)藥類十二五行業(yè)規(guī)劃教材《中西醫(yī)結(jié)合眼科學(xué)》[1]相關(guān)內(nèi)容制定。面色淡白或晦滯，身倦乏力，氣少懶言，疼痛如刺，常見于胸脅，痛處不移，拒按，舌淡暗或有紫斑，脈沉澀。

氣虛血瘀證RVO納入標(biāo)準(zhǔn) （1）同時(shí)符合RVO診斷標(biāo)準(zhǔn)以及氣虛血瘀證辨證標(biāo)準(zhǔn)；（2）當(dāng)?shù)厥谰尤巳?，單眼首次發(fā)病，年齡不限。

氣虛血瘀證RVO排除標(biāo)準(zhǔn) （1）妊娠或哺乳期婦女；（2）心、肝、腎功能明顯異常者，或惡性腫瘤患者；（3）青光眼，糖尿病視網(wǎng)膜病變（DR），葡萄膜炎，視網(wǎng)膜脫離等疾病患者。

正常人納入標(biāo)準(zhǔn) 當(dāng)?shù)厥谰尤巳?，眼底正?！?/p>

正常人排除標(biāo)準(zhǔn) 新入高原的外來人口。

1.2 觀察指標(biāo)

血清ET-1：住院患者于入院后次日清晨空腹抽取靜脈血5 ml，門診患者于診斷清楚后次日清晨空腹抽取靜脈血5ml。乙二胺四乙酸鈉抗凝，3000 r/min離心10 min，取血清置于EP管中，-20℃冰箱保存待測。檢測前室溫下復(fù)溫，所有標(biāo)本均凍融一次。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法 （enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）檢測ET-1，用純化的人ET-1抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入ET-1，再與辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）標(biāo)記的羊抗人抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物四甲基聯(lián)苯胺（3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine,TMB）顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的ET-1呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定吸光度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中人ET-1濃度。

血清VEGF：取血方法同上，ELISA法檢測血清VEGF。

試驗(yàn)儀器：低溫冰箱（-80℃），TG16-WS高速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司），恒溫箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），酶標(biāo)定量測定儀（深圳雷杜生命科學(xué)有限公司），游標(biāo)卡尺（桂林可立德量器有限公司）。ELISA試劑盒（北京久峰潤達(dá)生物技術(shù)有限公司提供）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，計(jì)量資料以xˉ±s表示，不同人群組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

在西寧以及格爾木地區(qū)，RVO氣虛血瘀證患者的ET-1及VEGF水平均明顯高于本地區(qū)的正常組（P＜0.05）。不同地區(qū)間比較，格爾木地區(qū)RVO氣虛血瘀證患者的ET-1及VEGF數(shù)值高于西寧地區(qū)患者（P＜0.05），兩地區(qū)正常組間的 ET-1、VEGF 水平則均無明顯差異（P＞0.05），具體見表 1、表 2。 RVO 氣虛血瘀證者ET-1、VEGF水平的普遍升高，以及該兩項(xiàng)指標(biāo)數(shù)值隨海拔升高而增加的結(jié)果，提示外環(huán)境低氧參與了氣虛血瘀證視網(wǎng)膜靜脈阻塞的形成，并且加劇了靜脈阻塞后的局部缺血缺氧。

3 討論

外環(huán)境低氧損傷是高原醫(yī)學(xué)、航天醫(yī)學(xué)等學(xué)科領(lǐng)域面臨的共性問題，高原氣虛證系由外環(huán)境低氧引發(fā)并且具有較典型氣虛證的病理改變和臨床表現(xiàn)的一種中醫(yī)證型，由氣虛導(dǎo)致血瘀是許多高原常見疾病發(fā)病的病理機(jī)制[4]。RVO是高原地區(qū)常見眼底疾病，屬中醫(yī)“暴盲”范疇，是眼科典型的血瘀證候，但是臨床大多數(shù)患者，又兼有氣虛的表現(xiàn)[1]。從中醫(yī)角度研究外環(huán)境低氧對機(jī)體的影響是一項(xiàng)重要的研究課題。

表1 不同海拔地區(qū)RVO氣虛血瘀證者及正常人血清 ET-1 比較（xˉ±s，ng/l）

表2 不同海拔地區(qū)RVO氣虛血瘀證者及正常人血清 VEGF 比較（xˉ±s，pg/ml）

ET-1是血管內(nèi)皮損傷的分子標(biāo)志物之一[5]。內(nèi)皮損傷是增加ET-l釋放的重要機(jī)制，有研究發(fā)現(xiàn)低氧能以時(shí)間依賴的方式誘導(dǎo)微血管周細(xì)胞ET-l的分泌，缺氧狀態(tài)下，血管內(nèi)皮細(xì)胞生成各種活性物質(zhì)的比例失衡，ET-1的產(chǎn)生增加，內(nèi)皮細(xì)胞凋亡亦增加。視網(wǎng)膜靜脈阻塞后由于靜脈血管的栓塞，導(dǎo)致了局部的缺血缺氧，誘導(dǎo)ET-1升高[6]。VEGF是多功能的細(xì)胞因子，是生理?xiàng)l件下和病理生理適應(yīng)過程中血管生長的主要調(diào)節(jié)因子[7]，缺血缺氧是該因子表達(dá)的強(qiáng)烈誘導(dǎo)因素。研究顯示，血栓在動(dòng)靜脈交叉或篩板處形成后，可使視網(wǎng)膜發(fā)生缺氧，視網(wǎng)膜毛細(xì)血管在結(jié)構(gòu)和功能上隨即發(fā)生改變，血-視網(wǎng)膜屏障發(fā)生破壞使大分子物質(zhì)和離子等從毛細(xì)血管進(jìn)入視網(wǎng)膜組織，從而發(fā)生視網(wǎng)膜水腫，視網(wǎng)膜缺氧缺血時(shí)，可誘發(fā)VEGF表達(dá)增加，血管通透性增加，黃斑水腫形成。

本研究中發(fā)現(xiàn)，同一海拔人群，患病人群的ET-1及VEGF的表達(dá)明顯升高，提示視網(wǎng)膜靜脈阻塞氣虛血瘀證的ET-1及VEGF的表達(dá)確實(shí)產(chǎn)生增加，參與了血管病變的發(fā)生；不同海拔正常人群ET-1及VEGF的水平未見統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異，但是在患病人群中，高海拔地區(qū)者ET-1及VEGF的表達(dá)明顯升高，這也從另外一個(gè)側(cè)面提示外環(huán)境低氧參與了氣虛血瘀證視網(wǎng)膜靜脈阻塞的形成，并且加劇了靜脈阻塞后的局部缺血缺氧，從而誘導(dǎo)高表達(dá)。

高原低氧、低氣壓、寒冷的自然環(huán)境造成了生活在高原的人群身體狀況、疾病特點(diǎn)等方面都與平原地區(qū)的人群有很大差別[8]。高原低氧環(huán)境對人體臟腑功能、能量物質(zhì)代謝等諸多方面具有廣泛的影響[9]?！皻鉃檠畮?，血為氣之母。”氣旺，則可推動(dòng)血液運(yùn)行周身；若氣虛，則氣不行血，導(dǎo)致血瘀。氣虛血瘀證的病機(jī)是氣虛為本，在先；血瘀是標(biāo)，生于后。高原氣虛血瘀證是指由于高原地區(qū)空氣稀薄，清氣化源不足，宗氣匱乏，不能助肺以行呼吸，貫心脈，導(dǎo)致人體機(jī)能下降，加之高原寒冷的氣候特點(diǎn)，易使血液出現(xiàn)“濃、黏、稠、聚”等氣虛血瘀證的表現(xiàn)。高原寒冷可使血流緩慢，進(jìn)一步加重缺氧，使氣虛血瘀證更加嚴(yán)重，從而形成具有高原特點(diǎn)的“氣虛血瘀證”[10]。ET-1及VEGF的水平與視網(wǎng)膜靜脈阻塞的范圍以及程度有沒有直接關(guān)系，在靜脈阻塞的不同階段如何變化，另外其他證型有無如此的表現(xiàn)，外周血的水平與視網(wǎng)膜組織中的表達(dá)有無差異都值得進(jìn)一步探索。因而，深入探討微血管變化的調(diào)控機(jī)制成為尋找阻塞后改善微循環(huán)障礙的切人點(diǎn)，這些對于深入研究高原疾病以及對于中醫(yī)在高原病領(lǐng)域的探究意義重大。