塞來昔布減低HL-60和HL-60A細(xì)胞活力、誘導(dǎo)凋亡及抑制自噬*

陸 英， 劉相富， 劉玲玲， 林哲生， 陳玉嬋， 馮寶瑩， 張祥忠△

(中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院 1輸血科， 2血液科，廣東 廣州 510630)

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塞來昔布減低HL-60和HL-60A細(xì)胞活力、誘導(dǎo)凋亡及抑制自噬*

陸 英1, 2， 劉相富1▲， 劉玲玲2， 林哲生1， 陳玉嬋1， 馮寶瑩1， 張祥忠2△

(中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院1輸血科，2血液科，廣東 廣州 510630)

目的： 探討塞來昔布對急性髓細(xì)胞白血病(AML) HL-60細(xì)胞和HL-60A細(xì)胞的活力、凋亡及自噬的影響。方法: 用不同濃度的(0、20、40、60、80和100 μmol/L)塞來昔布作用于HL-60細(xì)胞和HL-60A細(xì)胞， 24 h、48 h和72 h后用MTT法檢測細(xì)胞活力。用流式細(xì)胞術(shù)檢測塞來昔布作用HL-60細(xì)胞和HL-60A細(xì)胞24 h后的凋亡率。用Western blot法檢測凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase-3、cleaved PARP，自噬相關(guān)蛋白LC3、P62，以及mTOR信號途徑相關(guān)蛋白。結(jié)果: 塞來昔布作用于HL-60細(xì)胞24 h、48 h和72 h的 IC50分別為49.4 μmol/L、32.0 μmol/L和25.1 μmol/L，對于HL-60A細(xì)胞，相應(yīng)的 IC50分別是69.1 μmol/L、42.5 μmol/L和29.6 μmol/L。塞來昔布作用24 h后，流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示HL-60細(xì)胞中Annexin-Ⅴ+PI-、Annexin-Ⅴ+PI+及Annexin-Ⅴ-PI+細(xì)胞的比例增多； HL-60A細(xì)胞中Annexin-Ⅴ+PI-及Annexin-Ⅴ+PI+細(xì)胞的比例增多。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示塞來昔布作用后，cleaved caspase-3和cleaved PARP的蛋白水平增高，提示該凋亡作用是通過caspase途徑的。自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ及P62的表達(dá)均增加，mTOR、p-mTOR以及下游的4-EBP、p-4-EBP的蛋白水平?jīng)]有變化，說明塞來昔布能夠抑制AML細(xì)胞自噬，該作用與mTOR途徑無關(guān)。 結(jié)論: 塞來昔布對HL-60細(xì)胞和HL-60A細(xì)胞活力的抑制作用呈濃度以及時(shí)間依賴性，該作用與塞來昔布誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及壞死有關(guān)。塞來昔布能夠通過非mTOR依賴途徑抑制AML細(xì)胞自噬，有望聯(lián)合應(yīng)用于AML的治療，有助于增強(qiáng)某些引起保護(hù)性自噬的化療藥物的細(xì)胞毒作用。

塞來昔布； 急性髓細(xì)胞白血?。?細(xì)胞凋亡； 自噬

急性髓細(xì)胞白血病(acute myeloid leukemia，AML)是一種造血系統(tǒng)的惡性克隆性疾病，是成人急性白血病中最常見的類型。近30年來，AML的標(biāo)準(zhǔn)治療方案為傳統(tǒng)的“ 3+7”方案，即3 d的蒽環(huán)類藥物加上7 d的阿糖胞苷。近年來隨著新藥的出現(xiàn)和治療方法的改進(jìn)，白血病的完全緩解率有了明顯提高，但其多藥耐藥性以及較高的復(fù)發(fā)率仍是目前治愈白血病的主要障礙[1]。許多基礎(chǔ)以及臨床的研究報(bào)道了AML對蒽環(huán)類藥物以及阿糖胞苷耐藥[2-3]，因此探索新的治療方法以克服白血病細(xì)胞耐藥是AML研究的重要課題。

塞來昔布(celecoxib)是由Searle制藥廠研發(fā)的一種新型抗炎藥，1998年12月31日在美國上市，商品名為西樂葆，用于治療骨關(guān)節(jié)炎和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。近年來發(fā)現(xiàn)其具有抗腫瘤作用，美國FDA在2009年批準(zhǔn)了塞來昔布治療家族性腺瘤性息肉病(familial adenomatous polyposis，F(xiàn)AP)，用于減少結(jié)腸和直腸癌的發(fā)病率[4]。另有研究表明塞來昔布對其它實(shí)體腫瘤包括肝癌、乳腺癌以及肺癌等均有增殖抑制作用[5-7]。有關(guān)塞來昔布對血液系統(tǒng)腫瘤作用的研究相對較晚，報(bào)道也相對較少。2004年研究者發(fā)現(xiàn),與正常志愿者的淋巴組織相比，淋巴瘤組織細(xì)胞的COX-2水平增高2.2～4.3倍，選擇性COX-2抑制劑塞來昔布能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，此作用呈時(shí)間和劑量依賴性[8]。2005年血液學(xué)權(quán)威雜志《Blood》發(fā)表了一項(xiàng)塞來昔布衍生物OSU03012治療慢性淋巴細(xì)胞白血病的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，此復(fù)合物可以同時(shí)通過線粒體依賴以及非依賴途徑促進(jìn)白血病細(xì)胞的凋亡，而且此凋亡作用與Bcl-2無關(guān)[9]。此后相繼研究表明塞來昔布能促進(jìn)多種AML細(xì)胞包括HL-60、NB4、MR2細(xì)胞的凋亡[10-12]。

細(xì)胞自噬(autophagy)是真核細(xì)胞利用溶酶體對自身細(xì)胞器及蛋白質(zhì)進(jìn)行降解的生物學(xué)過程[13]，是真核生物對細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)進(jìn)行周轉(zhuǎn)的重要形式。自噬在腫瘤細(xì)胞中的作用非常復(fù)雜，因其能夠同時(shí)抑制腫瘤的發(fā)生以及促進(jìn)其存活而被喻為腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的雙刃劍，這種看似矛盾的作用與腫瘤類型、疾病分期及治療手段有關(guān)[14]。目前尚未見塞來昔布對血液系統(tǒng)腫瘤自噬作用的相關(guān)報(bào)道。本研究以HL-60細(xì)胞和HL-60A細(xì)胞為研究對象，首次探索塞來昔布對耐阿霉素的HL-60A細(xì)胞的生長抑制作用，以及其對AML細(xì)胞株自噬的影響。

材 料 和 方 法

1 試劑和儀器

塞來昔布購自Pfizer；RPMI-1640培養(yǎng)基購自Gibco；胎牛血清購自杭州四季青公司；氯喹、MTT、碘化丙啶(propidium iodide, PI)及RNase A購自Sigma。抗LC3、P62、mTOR、p-mTOR、4-EBP、p-4-EBP、cleaved caspase-3、cleaved PARP和GAPDH單克隆抗體均購自Cell Signaling Technology。細(xì)胞培養(yǎng)箱和酶標(biāo)儀購自Bio-Rad；流式細(xì)胞儀購自BD。

2 細(xì)胞培養(yǎng)

HL-60細(xì)胞和HL-60A 細(xì)胞為中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院血液實(shí)驗(yàn)室保存。細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，2～3 d換液1次。

3 方法

3.1 MTT法檢測細(xì)胞活力 取生長良好的HL-60細(xì)胞和HL-60A細(xì)胞，用新鮮培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，接種于96孔板，每孔的細(xì)胞為10 000個(gè)，設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每孔加入不同濃度的阿霉素或者塞來昔布。24 h、48 h和72 h后用MTT法檢測細(xì)胞活力，每孔加入5 g/L的MTT 20 μL，細(xì)胞培養(yǎng)4 h后棄去上清，加DMSO后，用酶標(biāo)儀在490 nm波長處檢測吸光度(A)。細(xì)胞活力 (%)=實(shí)驗(yàn)組A值/對照組A值×100%。

3.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 收集藥物處理過的細(xì)胞懸液，離心去上清，用結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，使細(xì)胞濃度為1×108/L。 取100 μL細(xì)胞加入5 μL 異硫氰酸熒光素(FTIC)標(biāo)記的Annexin-Ⅴ 和5 μL PI，充分混勻，避光室溫孵育15 min。加入400 μL結(jié)合緩沖液，轉(zhuǎn)移至5 mL玻璃管，即刻用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。Annexin-Ⅴ+PI-為早期凋亡細(xì)胞；Annexin-Ⅴ+PI+為晚期凋亡細(xì)胞;Annexin-Ⅴ-PI+為壞死細(xì)胞。

3.3 Western blot法檢測相關(guān)蛋白 收集處理后的細(xì)胞，離心去上清，PBS洗滌1次，加入適量蛋白裂解液提取蛋白， 測定蛋白濃度，根據(jù)濃度計(jì)算出一定質(zhì)量的蛋白所需體積，取等量蛋白，按比例加入loa-ding buffer，離心后100 ℃加熱10 min使之變性，保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?配制好SDS-PAGE膠，加上等質(zhì)量的蛋白樣本，蓋上電泳槽蓋子電泳2 h，然后轉(zhuǎn)膜，再將含目的蛋白條帶的PVDF膜放入封閉液中室溫振蕩1 h，將封閉的PVDF膜裝入雜交袋中，然后加入配好的Ⅰ抗，封好膜后4 ℃孵育過夜，洗膜、封閉后Ⅱ抗室溫孵育1 h，發(fā)光液發(fā)光后顯影、定影。用ImageJ 2x軟件分析蛋白條帶的灰度。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

SPSS 16.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。兩組間的比較用t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 塞來昔布對HL-60細(xì)胞和HL-60A細(xì)胞的增殖抑制作用

為驗(yàn)證HL-60A細(xì)胞對阿霉素的耐藥性，首先檢測了阿霉素對HL-60細(xì)胞和HL-60A細(xì)胞活力的影響。利用 MTT法檢測不同濃度的阿霉素(0、0.1、0.2、0.4和0.8 mg/L)對2種細(xì)胞株的活力抑制作用。從圖 1可見，0.8 mg/L 阿霉素作用 24 h、48 h和72 h 后，HL-60細(xì)胞的活力分別為 23.4%±2.9%、17.7%±0.5%及12.2%±4.4%，HL-60A細(xì)胞的活率則分別為63.8%±4.6%、28.6%±4.4%和14.8%±4.7%，阿霉素作用于HL-60細(xì)胞24 h的IC50是0.28 mg/L，而對于HL-60A細(xì)胞，相應(yīng)的 IC50是2.23 mg/L。以上結(jié)果證實(shí)了HL-60A細(xì)胞對阿霉素的耐藥性。

然后用不同濃度的塞來昔布(0、20、40、60、80和100 μmol/L)處理HL-60細(xì)胞和HL-60A細(xì)胞，分別在 24 h、48 h和72 h 后檢測2種細(xì)胞株的活力。從圖1可見，塞來昔布作用于HL-60細(xì)胞24 h、48 h和72 h的 IC50分別是49.4 μmol/L、32.0 μmol/L和25.1 μmol/L，而對于HL-60A細(xì)胞，相應(yīng)的 IC50分別是69.1 μmol/L、42.5 μmol/L和29.6 μmol/L。由此可見，塞來昔布作用24 h及48 h時(shí)對HL-60A細(xì)胞活力的抑制作用低于HL-60細(xì)胞，而藥物作用時(shí)間延長至72 h，塞來昔布對2種細(xì)胞活力的抑制作用接近。

Figure 1.Celecoxib inhibited the viability of HL-60 cells and HL-60A cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 mg/L doxorubicin;#P<0.05,##P<0.01vs0 μmol/L celecoxib.

圖1 塞來昔布抑制HL-60細(xì)胞和HL-60A細(xì)胞活力

2 塞來昔布對HL-60細(xì)胞和HL-60A細(xì)胞凋亡率的影響

利用流式細(xì)胞術(shù)檢測不同濃度塞來昔布(0、20、40、60和80 μmol/L)對HL-60細(xì)胞和HL-60A細(xì)胞凋亡的影響。如圖2所示，隨著塞來昔布濃度的增加，24 h后死亡細(xì)胞的比例均逐漸上升，不同濃度塞來昔布處理的HL-60細(xì)胞的凋亡率為分別為7.22%±1.74%、12.83%±2.84%、24.91%±1.33%、27.33%±3.01%和23.01%±3.31%，壞死率分別為1.82%±0.07%、4.18%±0.40%、12.40%±1.69%、50.10%±4.03%和63.45%±8.55%；HL-60A細(xì)胞的凋亡率為分別為1.61%±0.49%、12.17%±1.91%、25.67%±4.66%、16.44%±3.90%和15.39%±3.23%，壞死率分別為0.87%±0.04%、2.03%±0.24%、2.55%±0.55%、3.47%±1.39%和8.12%±2.65%。

Figure 2.Celecoxib induced apoptosis of HL-60 cells and HL-60A cells and induced HL-60 cell necrosis. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L.

圖2 塞來昔布促進(jìn)HL-60細(xì)胞和HL-60A細(xì)胞凋亡以及促進(jìn)HL-60細(xì)胞壞死

3 塞來昔布對凋亡相關(guān)蛋白的影響

用Western blot法檢測了細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase-3和cleaved PARP的蛋白水平。從圖3可見，隨著塞來昔布濃度的增加，HL-60和HL-60A細(xì)胞的cleaved caspase-3及cleaved PARP的蛋白水平也逐漸增加，總PARP 的蛋白水平降低。

4 塞來昔布對HL-60細(xì)胞和HL-60A細(xì)胞自噬的影響

4.1 塞來昔布作用于HL-60細(xì)胞和HL-60A細(xì)胞后LC3和P62的變化 隨著塞來昔布濃度的增加(0、20、40和80 μmol/L)，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及P62蛋白水平均增加，見圖4。

4.2 塞來昔布對mTOR途徑的影響 從圖4可見，隨著塞來昔布濃度的增加，AML細(xì)胞株中mTOR、p-mTOR以及下游的4-EBP、p-4-EBP蛋白水平?jīng)]有變化。

4.3 氯喹作用于HL-60細(xì)胞后LC3及P62的變化 由圖5可見，兩種AML細(xì)胞經(jīng)20 μmol/L氯喹處理24 h后LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ以及P62蛋白水平都增加。

Figure 3.The effects of celecoxib on the expression of apoptosis-related proteins in HL-60 cells and HL-60A cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L.

圖3 塞來昔布對HL-60和HL-60A細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響

討 論

本研究表明隨著塞來昔布藥物濃度的增加以及作用時(shí)間的延長，HL-60細(xì)胞、HL-60A細(xì)胞活力逐漸降低，說明在一定藥物濃度以及作用時(shí)間范圍內(nèi)，塞來昔布對HL-60細(xì)胞和HL-60A細(xì)胞活力的抑制作用呈時(shí)間以及劑量依賴性。與HL-60A細(xì)胞對阿霉素耐藥不同，當(dāng)塞來昔布的藥物濃度提高到60～100 μmol/L，作用時(shí)間延長到72 h時(shí)，塞來昔布對2株細(xì)胞具有相似的細(xì)胞活力抑制作用。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示塞來昔布有望用于治療對阿霉素耐藥的AML。

研究進(jìn)一步證實(shí)了塞來昔布能夠促進(jìn)HL-60細(xì)胞和HL-60A細(xì)胞的凋亡。值得一提的是除凋亡這一經(jīng)典的細(xì)胞死亡途徑外，塞來昔布還誘導(dǎo)AML細(xì)胞的壞死，這一作用在HL-60細(xì)胞中尤為突出，隨著塞來昔布藥物濃度的增加，HL-60細(xì)胞壞死數(shù)量明顯遞增，然而對HL-60A而言，不同濃度塞來昔布作用24 h后，壞死的細(xì)胞沒有明顯增加。由此可見，塞來昔布作用AML細(xì)胞24 h后，HL-60細(xì)胞活力遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于HL-60A細(xì)胞的原因之一是塞來昔布促HL-60A壞死的能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于HL-60細(xì)胞。此外，實(shí)驗(yàn)還從蛋白水平檢測了凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase-3以及cleaved PARP。在本研究中，塞來昔布作用于HL-60細(xì)胞和HL-60A細(xì)胞后，cleaved caspase-3以及cleaved PARP蛋白的水平均明顯升高，說明塞來昔布對白血病細(xì)胞的促凋亡作用是通過caspase途徑的，這與Zhang等[15]的研究一致。

本研究的重點(diǎn)是在塞來昔布對AML細(xì)胞的自噬作用的影響。細(xì)胞自噬是一個(gè)非常復(fù)雜而且神秘的過程，至今其中的機(jī)制尚未完全研究清楚。細(xì)胞自噬過程由自噬體的形成到自噬體與溶酶體的結(jié)合，最后到溶酶體的降解，因此自噬的過程又被稱為自噬流[16]。本研究用Western blot法檢測不同濃度塞來昔布作用于HL-60細(xì)胞和HL-60A細(xì)胞后LC3的變化。LC3是目前發(fā)現(xiàn)的唯一定位于自噬泡膜上的調(diào)節(jié)蛋白，因此常用作自噬形成的標(biāo)志[17]。隨著塞來昔布濃度的增加，LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ逐漸增多，提示自噬體的增加。P62又稱SQSTM1，是參與自噬體降解的重要蛋白，隨著自噬體的降解，P62逐漸減少[18]， 因此P62的降低提示自噬增加，相反P62增加提示自噬被抑制。隨著塞來昔布濃度的增加，P62逐漸增加。 LC3及P62的結(jié)果提示塞來昔布能夠抑制HL-60細(xì)胞和HL-60A細(xì)胞自噬，其并不是抑制自噬體的形成，而是抑制自噬體的降解。自噬的調(diào)節(jié)是非常復(fù)雜的過程，有多種信號通路包括mTOR、Beclin 1、PI3K及Ca2+等的參與。其中mTOR是ATP和氨基酸的感受器，在自噬過程中發(fā)揮著門控作用，是自噬體形成、成熟的關(guān)鍵[19]。

Figure 4.The effects of celecoxib on the expression of autophagy-related proteins in the HL-60 cells and HL-60A cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L.

圖4 塞來昔布對HL-60和HL-60A細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白的影響

Figure 5.The effects of chloroquine (CQ) on the expression of autophagy-related proteins in the HL-60 cells and HL-60A cells. Mean±SD.n=3. *P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L.

圖5 氯喹對HL-60和HL-60A細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白的影響

實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測mTOR途徑相關(guān)蛋白，mTOR、p-mTOR以及下游的4-EBP、p-4-EBP蛋白水平?jīng)]有變化，進(jìn)一步支持了的LC3Ⅱ的增加并非是自噬體的生成增多引起的。本研究還比較了塞來昔布以及氯喹對2株AML細(xì)胞的作用。氯喹是一種常用的自噬抑制劑，它能夠通過抑制溶酶體的功能以及抑制自噬體與溶酶體的結(jié)合而抑制細(xì)胞自噬過程[20]。氯喹能夠增加HL-60細(xì)胞和HL-60A細(xì)胞LC3 Ⅱ和P62水平，這與塞來昔布對HL-60細(xì)胞和HL-60A細(xì)胞的作用一致，因此進(jìn)一步證實(shí)了塞來昔布與氯喹一樣，能夠抑制白血病細(xì)胞的自噬，這是一個(gè)新的發(fā)現(xiàn)。

特別值得一提的是在白血病的治療中，細(xì)胞自噬被看作是一種非常重要的能影響各種藥物治療效果的機(jī)制[21-23]。在某些治療藥物中，自噬呈現(xiàn)出細(xì)胞毒作用促進(jìn)細(xì)胞死亡[21-22]，然而，在另外一些治療方法中，自噬作為一種調(diào)節(jié)機(jī)制能夠促進(jìn)白血病細(xì)胞的存活，亦被稱作保護(hù)性細(xì)胞自噬[23]。有1期臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，羥氯喹聯(lián)合硼替佐米治療14例復(fù)發(fā)/難治的多發(fā)性骨髓瘤患者，3例(14%)取得較好緩解(very good partial remission，VGPR)， 3例(14%)獲得微小緩解(minor remission，MR)，10例(45%)疾病穩(wěn)定(stable disease，SD)[24]。以上結(jié)果表明化療或者其它小分子物質(zhì)聯(lián)合自噬抑制劑將會(huì)是靶向血液系統(tǒng)惡性腫瘤的一種有前途的治療手段。本實(shí)驗(yàn)表明塞來昔布能夠抑制白血病細(xì)胞株HL-60細(xì)胞和HL-60A的細(xì)胞自噬，因此，塞來昔布作為可選擇的自噬抑制劑，有望聯(lián)合應(yīng)用于AML的治療過程，有助于增強(qiáng)某些引起保護(hù)性自噬的化療藥物的細(xì)胞毒作用。我們的后期實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步探索塞來昔布聯(lián)合阿霉素等化療藥物作用于白血病細(xì)胞的效果，檢測2類藥物聯(lián)用能否增強(qiáng)化療藥物的細(xì)胞毒作用以及該作用與細(xì)胞自噬的關(guān)系。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Celecoxib inhibits viability, induces apoptosis and inhibits autophagy in acute myeloid leukemia cell lines HL-60 and HL-60A

LU Ying1, 2, LIU Xiang-fu1, LIU Ling-ling2, LIN Zhe-sheng1, CHEN Yu-chan1, FENG Bao-ying1, ZHANG Xiang-zhong2

(1DepartmentofBloodTransfusion,2DepartmentofHematology,TheThirdAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China.E-mail:bradzxz@126.com)

AIM: To investigate the effects of celecoxib on viability, apoptosis and autophagy in acute myeloid leukemia (AML) cell lines HL-60 and HL-60A. METHODS: The HL-60 cells and HL-60A cells were cultured with various concentrations (0, 20, 40, 60, 80 and 100 μmol/L) of celecoxib. The inhibitory effect of celecoxib on the cell viability was evaluated by MTT assay. Apoptosis was analyzed by Annexin-V/PI staining. Apoptosis-related and autophagy-related proteins were determined by Western blot. RESULTS: IC50of celecoxib were 49.4 μmol/L, 32.0 μmol/L and 25.1 μmol/L for HL-60 cells treated with celecoxib for 24 h, 48 h and 72 h, respectively. For HL-60A cells, the corresponding IC50were 69.1 μmol/L, 42.5 μmol/L and 29.6 μmol/L, respectively. The results of flow cytometry analysis showed the proportions of Annexin-Ⅴ+PI-, Annexin-Ⅴ+PI+and Annexin-Ⅴ-PI+cells were increased in the HL-60 cells, and those of Annexin-Ⅴ+PI-and Annexin-Ⅴ+PI+cells were increased in the HL-60A cells treated with celecoxib for 24 h. After treated with celecoxib, the induction of apoptosis was observed, the apoptosis-related proteins cleaved caspase-3 and cleaved PARP were upregulated, the autophagy-related proteins LC3 II and P62 were both increased, and mTOR, p-mTOR, 4-EBP and p-4-EBP were not changed, indicating that celecoxib inhibited autophagy in the AML cells without the mTOR pathway involvement. CONCLUSION: Celecoxib inhibits the viability of HL-60 cells and HL-60A cells in a time- and dose-dependent manner by its effects of inducing apoptosis and necrosis. Celecoxib inhibits mTOR-independent autophagy in AML cells, indicating a possible way of using celecoxib for enhancing the antitumor activity of therapeutic agents to induce cytoprotective autophagy in the AML cells.

Celecoxib; Acute myeloid leukemia; Apoptosis; Autophagy

1000- 4718(2017)01- 0018- 08

2016- 07- 07

2016- 10- 26

廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 2014A030313138)；廣東省自然科學(xué)基金博士啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目(No. 2014A030310292)

R733．72

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.01.004

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