大黃酸通過抑制miR-21而干預(yù)TGF-β1/Smad通路并減輕博萊霉素所致大鼠肺纖維化*

屈 艷， 張 崇， 賈巖龍， 宋 宇， 牛秉軒， 詹合琴

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院 1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 2藥學(xué)院， 河南 新鄉(xiāng) 453003)

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大黃酸通過抑制miR-21而干預(yù)TGF-β1/Smad通路并減輕博萊霉素所致大鼠肺纖維化*

屈 艷1， 張 崇2△， 賈巖龍2， 宋 宇2， 牛秉軒2， 詹合琴2

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，2藥學(xué)院， 河南 新鄉(xiāng) 453003)

目的： 觀察大黃酸(rhein，RH)對(duì)博萊霉素所致肺纖維化大鼠微小RNA-21(miR-21)表達(dá)以及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)/Smad通路的影響。方法: 博萊霉素一次性氣管內(nèi)注射復(fù)制大鼠肺纖維化模型，隨機(jī)分為RH低、中、高劑量組及模型(model)組；正常對(duì)照組大鼠氣管內(nèi)注射生理鹽水。用藥28 d后，HE染色觀察各組大鼠肺組織形態(tài)學(xué)的變化；測(cè)定肺系數(shù)、肺組織羥脯氨酸含量；real-time PCR檢測(cè)肺組織中miR-21和TGF-β1/Smad7 mRNA表達(dá)；Western blot法分析TGF-β1和Smad7 蛋白的表達(dá)。結(jié)果: 與model組相比，RH用藥組大鼠的肺泡炎及肺纖維化程度有明顯降低，肺系數(shù)及肺組織羥脯氨酸含量也顯著減少，肺組織中miR-21表達(dá)下降，TGF-β1的mRNA和蛋白表達(dá)水平也明顯下降，Smad7的mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯增高(P<0.05)。結(jié)論: RH抗肺纖維化的作用可能與抑制miR-21的表達(dá)，從而干預(yù)TGF-β1/Smad信號(hào)通路，減少細(xì)胞外基質(zhì)沉積有關(guān)。

大黃酸； 肺纖維化； 微小RNA-21； 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1； Smad7

大黃酸(rhein，RH)是一種天然的蒽醌衍生物，可以從蓼科植物，如大黃、虎杖、何首烏等多種中藥中分離提純得到，應(yīng)用歷史達(dá)千年以上，近些年研究表明RH還可發(fā)揮抗腫瘤[1-2]、抗菌[3]、抗炎[4]、抗病毒[5]等多種藥理作用。目前發(fā)現(xiàn)RH還可以干預(yù)多種器官組織的纖維化過程，例如腎臟纖維化[6]、胰腺纖維化[7]以及肝臟纖維化[8]均有研究，而在肺纖維中的具體作用尚不清楚。器官纖維化病理過程大都是纖維組織增生，細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)沉積所致，RH能否在肺纖維化中也能起到作用，國內(nèi)外未見報(bào)道，因此本研究擬采用博萊霉素復(fù)制肺纖維化大鼠模型，觀察RH的抗肺纖維化作用，并進(jìn)一步探討其作用機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物

雄性SD大鼠，體質(zhì)量(200±20)g，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(豫)2010-0002。

2 主要藥品和試劑

注射用鹽酸博萊霉素A5(Nippon Kayaku)；羥脯氨酸測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；RH(純度≥98%)(南京澤朗醫(yī)藥有限公司)，使用前用0.5%羧甲基纖維素鈉配制成不同濃度的混懸液；抗TGF-β1 單克隆抗體(Abcam)；抗Smad7 多克隆抗體(Santa Cruz)；PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒(TaKaRa)；All-in-OneTMmiRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit和All-in-OneTMmiRNA qPCR Kit(GeneCopoeia)。PCR引物由Invitrogen合成；實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)為Thermo Fisher Scientific產(chǎn)品。

3 主要方法

3.1 肺纖維化模型的制備、分組及給藥 大鼠麻醉后，鈍性分離暴露氣管，經(jīng)氣管軟骨環(huán)間隙向心端穿刺，一次性氣管內(nèi)滴入博萊霉素生理鹽水溶液0.2～0.3 mL(5 mg/kg)復(fù)制肺纖維化模型，正常對(duì)照(control)組以相同方法滴入等體積生理鹽水，立即將動(dòng)物直立并行旋轉(zhuǎn)使藥物分布均勻。造模后當(dāng)日將動(dòng)物隨機(jī)分成模型(model)組及RH-低(low, L)、中(medium, M)、高(high, H)劑量組，低、中、高劑量分別為25、50、100 mg/kg，每日上午采用灌胃方法進(jìn)行給藥，給藥劑量的選擇主要參考了文獻(xiàn)[4, 7]，并通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定，control組和model組以同樣方法給予等容量0.5 %羧甲基纖維素鈉溶液。給藥28 d后，股動(dòng)脈放血處死所有動(dòng)物，收集待測(cè)標(biāo)本

3.2 肺系數(shù)的檢測(cè) 處死大鼠后，完整分離出氣管和雙肺，吸干肺臟表面水分，稱量肺濕重，計(jì)算肺系數(shù) [肺系數(shù)=肺濕重(mg)/大鼠體重(g)]

3.3 肺組織羥脯氨酸含量的測(cè)定 取右肺中葉組織，稱重后剪碎、勻漿，測(cè)定方法按堿水解法羥脯氨酸試劑盒說明進(jìn)行。

3.4 病理組織學(xué)的觀察 取左肺，使用4%多聚甲醛先經(jīng)左主支氣管灌注固定30 min后完全投入4%多聚甲醛中繼續(xù)固定24 h，常規(guī)石蠟包埋切片、行HE染色，根據(jù)Szapiel等[9]提供的方法評(píng)價(jià)肺泡炎及纖維化程度，2種病變程度均分為4級(jí)：0級(jí)無明顯病理改變，肺泡結(jié)構(gòu)正常者評(píng)0分；1級(jí)輕度改變，病變范圍小于全肺的20%者評(píng)1分；2級(jí)中度改變，病變范圍占全肺的20%～50%者評(píng)2分；3級(jí)重度改變，病變范圍占全肺的50%以上者評(píng)3分。

3.5 Real-time PCR檢測(cè)各組肺組織中miR-21的表達(dá)及TGF-β1/Smad7的mRNA水平 用TRIzol提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行real-time PCR反應(yīng)，GAPDH作為內(nèi)參照，上游引物序列為5’-CGACTTCAACAGCAACTCCCACTCTTCC’， 下游引物序列為5’-TGGGTGGTCCAGGGTTTCTTACTCCTT-3’； TGF-β1的上游引物序列為5’- AGCGGACTACTATGCTAAAGAGGTCACCC-3’， 下游引物序列為5’-CCAAGGTAACGCCAGGATTGTTGCTATA-3’； Smad7的上游引物序列為5’-TTTTGAGGTGTGGTGGG-3’，下游引物序列為5’-GAGGCAGTAAGACAGGGATGA-3’。反應(yīng)體系(10 μL)包括SYBR Premix Ex TaqTMⅡ buffer 5 μL，上、下游引物各0.2 μL， cDNA模板0.2 μL，ddH2O 4.4 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。miRNA檢測(cè)采用miRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑轉(zhuǎn)錄為cDNA后，All-in-OneTMmiRNA qPCR Kit進(jìn)行real-time PCR反應(yīng)，U6作為內(nèi)參照，其引物序列為5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’；miR-21引物為：5’-CGGCTAGCTTATCAGACTGA-3’。反應(yīng)體系20 μL，包括qPCR Mix 10 μL、miRNA qPCR Primer 2 μL、Universal Adaptor PCR Primer 2 μL、cDNA模板2 μL、ROX reference dye 0.4 μL、ddH2O 3.6 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 10 s，45個(gè)循環(huán)；60～95 ℃熔解曲線分析，每個(gè)樣品重復(fù)3次。數(shù)據(jù)的收集和分析由PikoReal Software 2.0完成，研究采用2-ΔΔCt法計(jì)算目標(biāo)mRNA的含量。

3.6 Western blot法檢測(cè)TGF-β1和Smad7 蛋白的表達(dá) 用RIPA裂解約100 mg肺組織，提取裂解上清液，BCA法測(cè)蛋白濃度，采用SDS-PAGE分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，封閉，分別 加相應(yīng)的I 抗4 ℃孵育過夜后，加辣根過氧化物酶標(biāo)記 II 抗孵育2 h，ECL檢測(cè)試劑盒顯影，凝膠成像系統(tǒng)照相，ImageJ 1.43軟件分析灰度值，對(duì)各組蛋白表達(dá)差異進(jìn)行分析。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，等級(jí)資料比較用秩和檢驗(yàn)，多組總體比較采用Kruska-WallisH檢驗(yàn)分析，組間兩兩比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理；計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組總體比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，以P<0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 肺組織的病理組織學(xué)觀察

HE染色結(jié)果顯示，control組肺組織結(jié)構(gòu)正常，偶見炎性細(xì)胞，無間質(zhì)纖維組織增生；model組的肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，大量肺泡壁斷裂，肺泡腔塌陷，肺泡間隔顯著增寬，有大量纖維組織增生及膠原沉積，炎性細(xì)胞浸潤，多呈3級(jí)纖維化和2級(jí)肺泡炎改變，與control組相比，肺泡炎及肺纖維化評(píng)分顯著提高(P<0．01)；RH給藥組多數(shù)肺組織結(jié)構(gòu)較為清晰，肺泡間隔增寬不明顯，膠原組織增生降低，多呈1級(jí)纖維化改變，炎性細(xì)胞浸潤減少，評(píng)分均較model組明顯減輕(P<0．05)，結(jié)果見圖1、表1。

Figure 1. The effect of rhein on the pathological changes of pulmonary tissues in the rats with pulmonary fibrosis (HE staining, ×100).

圖1 RH對(duì)肺纖維化大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)的影響

表1 RH對(duì)大鼠肺泡炎及肺纖維化的影響

**P<0．01vscontrol group;△P<0．05,△△P<0．01vsmodel group.

2 RH對(duì)大鼠肺系數(shù)及肺組織羥脯氨酸含量的影響

與control組相比，model組大鼠肺系數(shù)及羥脯氨酸含量明顯增高(P<0．01)，RH給藥組肺系數(shù)及羥脯氨酸含量有顯著降低(P<0．05)，見表2。

3 RH對(duì)miR-21水平及TGF-β1/Smad7 mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

Real-time PCR檢測(cè)后的熔解曲線顯示，各基因擴(kuò)增產(chǎn)物均為單峰，無非特異性產(chǎn)物或引物二聚體出現(xiàn)。Model組的miR-21水平和TGF-β1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量均較control組有明顯增高(P<0．01)，而給予RH后，兩者的表達(dá)水平明顯降低；Smad7 mRNA在model組中表達(dá)下降，在RH-M和RH-H組則明顯升高(P<0．01)，見表3。

4 RH對(duì)TGF-β1和Smad7 蛋白表達(dá)的影響

與control組相比，model組大鼠TGF-β1蛋白的表達(dá)水平明顯升高，而RH給藥后TGF-β1蛋白明顯下降(P<0．05)， Smad7的蛋白表達(dá)量則相反，model組表達(dá)明顯降低，而給藥后能夠提高其表達(dá)水平，與mRNA的表達(dá)結(jié)果一致，見圖2。

表2 RH對(duì)大鼠肺系數(shù)及羥脯氨酸含量的影響

Table 2.The effecs of rhein on lung coefficient and hydroxyproline in rats (Mean±SD.n=10)

GroupDose(mg/kg)Lungcoefficient(mg/g)Hydroxyproline(mg/g)Control—4．65±0．580．75±0．09Model—8．24±1．18??1．06±0．10??RH?L257．14±0．65△0．94±0．12△RH?M506．75±0．69△△0．85±0．08△△RH?H1006．17±0．78△△0．81±0．09△△

**P<0．01vscontrol group;△P<0．05,△△P<0．01vsmo-del group.

討 論

目前，肺纖維化的發(fā)病機(jī)理仍然不清楚，尚無有效的治療方法[9]，主要病理基礎(chǔ)為成纖維細(xì)胞過度增殖， ECM沉積所致，膠原蛋白是ECM的主要成分，而羥脯氨酸是膠原蛋白中一種特有的氨基酸，當(dāng)膠原蛋白代謝發(fā)生異常時(shí)，組織內(nèi)羥脯氨酸含量會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化，因此測(cè)定肺組織羥脯氨酸含量，可以反映肺組織中膠原蛋白即ECM的含量，RH用藥后，羥脯氨酸含量有明顯降低，提示RH可以減少ECM的合成。在肺纖維化形成過程中，由于肺泡壁纖維結(jié)締組織增生和膠原蛋白的沉積，及大量炎性細(xì)胞浸潤等因素能使肺纖維化大鼠的肺重量增加，因此肺系數(shù)可間接反映肺組織纖維化的程度，RH可以降低肺系數(shù)，同時(shí)，從組織病理學(xué)觀察也發(fā)現(xiàn)，RH抑制了肺泡炎及肺纖維化的程度，也印證了其抗肺纖維化作用。

表3 RH對(duì)miR-21、TGF-β1/Smad7 mRNA表達(dá)的影響

**P<0．01vscontrol group;△P<0．05,△△P<0．01vsmodel group.

Figure 2.The effect of rhein on the protein expression of TGF-β1 and Smad7. Mean±SD.n=10.**P<0．01vscontrol group;△△P<0．01vsmodel group.

圖2 RH對(duì)TGF-β1和Smad7 蛋白表達(dá)的影響

TGF-β1是促進(jìn)肺纖維化的重要因子，TGF-β/Smad信號(hào)通路在其中具有重要的調(diào)控作用[10]，可促進(jìn)膠原蛋白等ECM過度沉積，而導(dǎo)致肺纖維化的產(chǎn)生[11]。本研究也表明model組大鼠TGF-β1增高明顯，而RH能使其mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯下降，He等[12]發(fā)現(xiàn)RH能夠抑制TGF-β的表達(dá)而發(fā)揮抑制腎間質(zhì)纖維化作用，與本研究結(jié)果相似。另外，有研究表明Smad7 在TGF-β/Smad信號(hào)通路中起非常重要的調(diào)節(jié)作用，它可沉默整個(gè)信號(hào)通路，從而抑制TGF-β的作用[13]。Smad7 能與細(xì)胞膜上TGF-β受體競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，阻斷TGF-β信號(hào)在胞漿內(nèi)的傳導(dǎo)，下游信號(hào)紊亂，在TGF-β信號(hào)中通路中起負(fù)性調(diào)節(jié)作用，是TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路失活的機(jī)制之一[14]，而超表達(dá)Smad7 能夠使過度激活的TGF-β/ Smad信號(hào)通路平衡恢復(fù)，發(fā)揮抗纖維化作用[15]。本研究也發(fā)現(xiàn)RH能提高Smad7 表達(dá)水平，證明RH能抑制促纖維化細(xì)胞因子TGF-β1表達(dá)，并通過上調(diào)Smad7，干擾TGF-β/smad信號(hào)通路，減少ECM的沉積。

MicroRNA參與基因的表達(dá)調(diào)控，導(dǎo)致mRNA的降解或翻譯抑制，近些年發(fā)現(xiàn)在多種病理生理學(xué)過程中發(fā)揮重要作用[16]。約10%的miRNA在肺纖維化過程中有明顯改變，其中被證實(shí)起重要作用有Let-7、miR-21、miR-29、miR-154等[17]，這些MicroRNA可能成為肺纖維化發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因子及藥物作用的新靶點(diǎn)。miR-21是miRNA轉(zhuǎn)錄的主要驅(qū)動(dòng)子，在腫瘤、心血管疾病等許多病理過程中表達(dá)上調(diào)[18]。Liu等[19]研究證明miR-21在博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化model中和特發(fā)性肺纖維化病人中，均呈高表達(dá)狀態(tài)，TGF-β1能增強(qiáng)miR-21的表達(dá)，反過來miR-21又能上調(diào)TGF-β1功能，促進(jìn)其誘導(dǎo)肺纖維作用。本研究發(fā)現(xiàn)miR-21在肺纖維化model組中表達(dá)明顯增高，與TGF-β1高表達(dá)同步，與前人研究相一致，證明miR-21與TGF-β1確實(shí)可能具有密切的聯(lián)系，并可能在肺纖維化發(fā)生發(fā)展過程中存在協(xié)同作用。另有研究認(rèn)為TGF-β是通過Smad途徑促進(jìn)miR-21表達(dá)，miR-21能夠抑制Smad-7表達(dá)，增加TGF-β促肝纖維化作用[20]，同樣腎纖維化中也有研究發(fā)現(xiàn)在TGF-β1能上調(diào)miR-21的表達(dá)，并成劑量及時(shí)間依賴性，采用siRNA方法沉默Smad7 能直接調(diào)節(jié)α-SMA和E-cadherin 表達(dá)，miR-21表達(dá)增強(qiáng)后可通過抑制靶基因Smad7 表達(dá)，增強(qiáng)TGF-β1導(dǎo)致ECM沉積而導(dǎo)致的纖維化作用[21]，因此過表達(dá)miR-21，Smad-7表達(dá)下調(diào)，通過Smad信號(hào)通路可增強(qiáng) TGF-β1誘導(dǎo)ECM過量沉積。在TGF-β1介導(dǎo)的肺纖維化中，針對(duì)miR-21進(jìn)行抑制可能是一個(gè)更好的選擇。本研究發(fā)現(xiàn)使用RH后，miR-21的表達(dá)受到了明顯的抑制，同時(shí)TGF-β1表達(dá)也同步降低，而Smad7 表達(dá)水平卻增加，ECM沉積被抑制，推測(cè)RH發(fā)揮抗肺纖維化作用可能與其抑制miR-21的表達(dá)，使Smad7 的表達(dá)增強(qiáng)，從而干預(yù)TGF-β1/Smad信號(hào)通路，減少了ECM沉積有關(guān)。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Rhein attenuates bleomycin-induced rats pulmonary fibrosis through TGF-β1/Smad pathway by inhibiting miR-21 expression

QU Yan1, ZHANG Chong2, JIA Yan-long2, SONG Yu2, NIU Bing-xuan2, ZHAN He-qin2

(1SchoolofBasicMedicine,2CollegeofPharmacy,XinxiangMedicalUniversity,Xinxiang453003,China.E-mail:chong29@126.com)

AIM: To investigate the effect of rhein on bleomycin-induced pulmonary fibrosis and the expression of microRNA-21 (miR-21) and transforming growth factor-β1 (TGF-β1)/Smad signaling molecules in rats. METHODS: A single dose of bleomycin was intratracheal injected into the SD rats to induce pulmonary fibrosis. After injection of bleomycin, the rats were randomly divided into low-, medium- and high-dose rhein treatment groups and model group. The rats that were instilled with normal saline intratracheally served as control group. After the treatment for 28 d, the pulmonary pathologic changes were observed under microscope with hematoxylin-eosin staining. The lung coefficient and hydroxyproline content were also measured. The expression of miR-21 and the mRNA levels of TGF-β1 and Smad7 in the lung tissues were detected by real-time PCR. The protein levels of TGF-β1 and Smad7 were determined by Western blot. RESULTS: Rhein significantly attenuated the experimental alveolitis, pulmonary fibrosis, lung coefficient and hydroxyproline contents in the rats. Rhein obviously decreased the expression of miR-21,and the mRNA and protein levels of TGF-β1, but significantly increased the mRNA and protein levels of Smad7 in the lung tissues. CONCLUSION: Rhein effectively prevents bleomycin-induced pulmonary fibrosis by inhibiting the expression of miR-21 and promoting the expression of Smad7, thus regulating the TGF/Smad signaling pathway to decrease extracellular matrix deposition.

Rhein; Pulmonary fibrosis; MicroRNA-21; Transforming growth factor-β1; Smad7

1000- 4718(2017)01- 0149- 05

2016- 06- 16

2016- 08- 22

河南省科技公關(guān)項(xiàng)目(No. 122102310200)；新鄉(xiāng)市經(jīng)濟(jì)社會(huì)發(fā)展重點(diǎn)科研項(xiàng)目(No. S10008)；新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第七批省級(jí)重點(diǎn)學(xué)科開放課題(No. ZD200903);新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院培育基金資助項(xiàng)目(No. 2014QN130)

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.01.025

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