桔梗皂苷D防御口腔黏膜上皮細胞感染白色念珠菌的作用

朱立芬， 王 冰

(重慶市中醫(yī)院口腔科，重慶 400010)

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桔梗皂苷D防御口腔黏膜上皮細胞感染白色念珠菌的作用

朱立芬， 王 冰△

(重慶市中醫(yī)院口腔科，重慶 400010)

目的： 探討桔梗皂苷D對白色念珠菌黏附口腔黏膜上皮細胞的影響。方法: MTT法檢測不同桔梗皂苷D對口腔上皮KB細胞存活率的影響；將白色念珠菌、KB細胞以及不同濃度的桔梗皂苷D共同培養(yǎng)，革蘭染色檢測白色念珠菌黏附數(shù)，臺盼藍排斥實驗檢測念珠菌活力和菌絲轉換率；ELISA法檢測上清液中IL-18與人β-防御素2 (HBD-2)的蛋白含量；實時熒光定量PCR和Western blot法分別檢測KB細胞中HBD-2 mRNA與蛋白表達的變化。結果: 桔梗皂苷D對KB細胞存活率無影響；隨著桔梗皂苷D濃度的增加，白色念珠菌的黏附數(shù)、菌活力和菌絲轉換率逐漸下降，上清液中IL-18與HBD-2的蛋白含量以及KB細胞中HBD-2 mRNA表達與蛋白水平逐漸降低。結論: 桔梗皂苷D具有抑菌作用，并參與了口腔黏膜上皮細胞防御白色念珠菌感染的免疫反應。

桔梗皂苷D； 口腔上皮細胞； 白色念珠菌

口腔念珠菌病是由于念珠菌屬感染所引起的口腔黏膜疾病。白色念珠菌(Candidaalbicans)是一種寄生在正常人群口腔、呼吸道、消化道以及生殖道等部分的機會性致病真菌。張程等[1]對118例口腔念珠菌進行病理研究，發(fā)現(xiàn)白色念珠菌感染占73.7%。由于廣譜抗生素的廣泛應用，導致許多患者的免疫力下降，破壞正常菌群平衡，使口腔中白色念珠菌的感染率明顯上升[2]。

桔梗皂苷D(platycodin D，PD)是從中藥桔梗提取分離的一種三萜單體，作為桔梗的主要有效成分之一，具有降血糖血脂、抗炎、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用[3-4]。付凱等[5]對桔梗皂苷元進行抑菌研究，發(fā)現(xiàn)其對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿假單胞菌和鼠傷寒沙門氏菌均有一定的抑制作用，其中對大腸桿菌及金黃色葡萄球菌的抑制作用較強，但并未對白色念珠菌進行相關的研究。

本實驗通過體外觀察不同濃度桔梗皂苷D對白色念珠菌黏附KB細胞的情況，為桔梗皂苷D臨床上用于治療口腔黏膜白色念珠菌感染提供實驗依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 實驗材料與試劑

KB細胞為永生化的口腔上皮細胞株，來源于口咽癌上皮細胞，是目前國際通用的口腔上皮細胞模型，購自中國醫(yī)學科學院天津血液病研究所；白色念珠菌(ATCC?10231TM)購自南京便診生物科技有限公司；沙氏培養(yǎng)基購自北京陸橋技術有限公司；桔梗皂苷D購自上海源葉生物科技有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)液和胎牛血清購自Solarbio；臺盼藍購自Sigma；抗人β-防御素2 (human β-defensin 2, HBD-2)及GAPDH抗體購自Santa Cruz。

2 方法

2.1 白色念珠菌菌懸液的制備 將白色念珠菌(ATCC?10231TM)菌株接種于沙氏液體培養(yǎng)基，37 ℃搖床培養(yǎng)48 h，150 r/min，當白色念珠菌生長至對數(shù)期，3 000 r/min離心15 min，溶于無血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，調(diào)整菌懸液濃度為1×109/L備用，臺盼藍排斥實驗證明活菌數(shù)大于95%。

2.2 KB細胞的培養(yǎng) 將KB細胞置于5% CO2培養(yǎng)箱，37 ℃培養(yǎng)24 h，當細胞長滿瓶底約90%時，換新鮮培養(yǎng)液。取處于對數(shù)生長期的細胞，加入0.25%胰酶消化，重懸計數(shù)，調(diào)整細胞密度至5×109/L，加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，制成細胞懸液，調(diào)整濃度為5×108/L備用。

2.3 MTT法檢測桔梗皂苷對KB細胞存活率的影響 將濃度為5×108/L的KB細胞置于96孔培養(yǎng)板，加入桔梗皂苷D使其在培養(yǎng)液中最終濃度為：0、10、20、40、80、160和500 mg/L(其中以0 mg/L作為正常對照組)，置于37 ℃、5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，加入MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)液，每孔加入二甲基亞砜150 μL終止反應，在波長570 nm處測定吸光度(A)值，每濃度設3個復孔，設空白對照組。計算各濃度對KB細胞的存活率，存活率(%)=實驗組平均A值/對照組平均A值×100%。

2.4 白色念珠菌的黏附與活力的測定 將上述KB細胞接種于培養(yǎng)皿中，置于5% CO2培養(yǎng)箱，37 ℃培養(yǎng)，待細胞鋪滿皿底約80%，加入濃度為1×109/L的白色念珠菌懸液4 mL，分別加入桔梗皂苷D溶液0、5、10、20 μmol/L，共同培養(yǎng)，并于24 h后取出蓋玻片，PBS洗滌，于無水乙醇中固定15 min，革蘭氏染色，倒置在顯微鏡下觀察，計算黏附在KB細胞的白色念珠菌數(shù)。臺盼藍排斥實驗檢測念珠菌活力和菌絲轉換率。

2.5 ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清液中IL-18與HBD-2的蛋白含量 取培養(yǎng)至對數(shù)生長期的KB細胞，制成細胞懸液，培養(yǎng)，使細胞貼壁，細胞形成單層后吸取培養(yǎng)液。實驗分為KB細胞對照(control，Con)組，加入1×109/L孢子相白色念珠菌及濃度為0、5、10、20 μmol/L的桔梗皂苷D溶液組，加入1×109/L菌絲相白色念珠菌及濃度為0、5、10、20 μmol/L的桔梗皂苷D溶液組。繼續(xù)培養(yǎng)12 h，取上清液，按照ELISA試劑盒說明書操作，于492 nm處測吸光值，計算IL-18與HBD-2的相應蛋白含量。

2.6 熒光定量PCR測定KB細胞中HBD-2的mRNA表達 采用TRIzol法提取各組總RNA，逆轉錄合成cDNA，于實時熒光定量PCR儀上進行擴增，HBD-2的上游引物為5’-CCAGCCATCAGCCATGAGGGT-3’，下游引物為5’-GGAGCCCTTTCTGAATCC GACA-3’；β-actin的上游引物為5’-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3’，下游引物為5’-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3’；反應條件為：95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s,63 ℃ 5 min，40個循環(huán)。PCR擴增完成后，標準曲線和擴增曲線由PCR儀器自動生成，所得結果直接在熒光定量操作系統(tǒng)中進行比較分析，目標基因的相對定量用2-ΔΔCt計算。

2.7 Western blot實驗 收集各組細胞，加入裂解液，收集蛋白并定量，上樣，進行SDS-PAGE電泳，電泳結束后，轉移至PVDF膜，加入含5%脫脂奶粉的TBST溶液，室溫放置1 h，加入相應 I 抗，4 ℃孵育過夜，再加入相應 II 抗，室溫孵育1 h，ECL顯色，成像掃描分析系統(tǒng)測定蛋白條帶的積分吸光度。

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件對所有實驗數(shù)據(jù)進行分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組間數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，各組均數(shù)間兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 顯微鏡觀察白色念珠菌與KB細胞黏附

顯微鏡下觀察可見正常KB細胞呈現(xiàn)扁平多角形，排列緊密，呈“鋪路石”狀；KB細胞感染白色念珠菌后，菌絲形態(tài)的白色念珠菌占絕大部分；加入桔梗皂苷D共同培養(yǎng)后，隨著桔梗皂苷D濃度的增加，菌絲狀態(tài)的白色念珠菌的數(shù)量逐漸減少，見圖1。

Figure 1. The effect of platycodin D on the adhesion ofCandidaalbicanswith KB cells (×200). A: normal KB cells; B: the KB cells adhered byCandidaalbicans; C: the KB cells adhered byCandidaalbicansafter treated with 20 μmol/L platycodin D.

圖1 桔梗皂苷D對白色念珠菌黏附KB細胞的影響

2 桔梗皂苷D對KB細胞存活率的影響

MTT實驗結果顯示，隨著桔梗皂苷D濃度的增加，KB細胞的存活率沒有顯著變化，但當桔梗皂苷D到達500 mg/L時，KB細胞的存活率略微下降，但并不具有統(tǒng)計學顯著性，見圖2。

3 白色念珠菌黏附數(shù)、菌活力、菌絲轉換率與桔梗皂苷D濃度的關系

如表1所示，在24 h之后，隨著桔梗皂苷D濃度的增加，細菌黏附數(shù)和菌活力均降低；菌絲轉換率由(91.54±2.71)%降低至(52.41±3.16)%，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

Figure 2. The effect of platycodin D (PD) on the viability of KB cells. Mean±SD.n=6.

圖2 桔梗皂苷D對KB細胞存活率的影響

表1 白色念珠菌黏附數(shù)、菌活力、菌絲轉換率與桔梗皂苷D濃度的關系

Table 1. The relationship of platycodin D (PD) concentration with adherent numbers, bacterial activity and conversion ofCandidaalbicans(Mean±SD.n=6)

ConcentrationofPDAdherentnumberBacterialactivity(%)Conversionrate(%)0μmol/L225±1299．25±0．4291．54±2．715μmol/L202±8?88．24±0．38?75．63±3．49?10μmol/L161±9?82．05±0．58?63．98±3．41?20μmol/L122±6?68．36±1．36?52．41±3．16?

*P<0.05vs0 μmol/L group.

4 KB細胞中IL-18與HBD-2蛋白含量的變化

未加桔梗皂苷D培養(yǎng)的KB細胞感染白色念珠菌后，培養(yǎng)上清液中IL-18與HBD-2蛋白含量顯著高于對照組(P<0.05)，隨著加入桔梗皂苷D的濃度逐漸升高，孢子相與菌絲相組的IL-18與HBD-2蛋白含量逐漸降低，見圖3、4。我們用Western blot法進一步檢測KB細胞中HBD-2蛋白表達的變化，結果顯示KB細胞自身的HBD-2 蛋白表達量少，當白色念珠菌黏附KB細胞后，HBD-2蛋白表達量顯著上升(P<0.05)，加入桔梗皂苷D干預后，孢子相組與菌絲相組的KB細胞HBD-2蛋白表達均隨桔梗皂苷D濃度增加而減少(P<0.05)，見圖5。

5 KB細胞中HBD-2的mRNA表達

KB細胞自身HBD-2的mRNA表達量少，當白色念珠菌黏附KB細胞后，HBD-2的mRNA表達量迅速上升(P<0.05)，加入桔梗皂苷D干預后，孢子相組與菌絲相組的KB細胞HBD-2的mRNA表達均隨桔梗皂苷D濃度增加而減少(P<0.05)，見圖6。

Figure 3. The content of IL-18 in the culture supernatants of KB cells. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol (Con) group;#P<0.05vs0 μmol/L (spore form) group;△P<0.05vs0 μmol/L (hyphal form) group.

圖3 KB細胞培養(yǎng)上清液中IL-18蛋白的含量

Figure 4. The content of HBD-2 in the culture supernatants of KB cells. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol (Con) group;#P<0.05vs0 μmol/L (spore form) group;△P<0.05vs0 μmol/L (hyphal form) group.

圖4 HBD-2蛋白在KB細胞培養(yǎng)上清液中的含量

Figure 5. The protein expression of HBD-2 in the KB cells. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol (Con) group;#P<0.05vs0 μmol/L group.

圖5 HBD-2 蛋白在KB細胞中的表達

Figure 6. The mRNA expression of HBD-2 in the KB cells. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol (Con) group;#P<0.05vs0 μmol/L (spore form) group;△P<0.05vs0 μmol/L (hyphal form) group.

圖6 HBD-2 mRNA在KB細胞中的表達

討 論

白色念珠菌的毒力因子主要包括黏附、菌絲形成、表型轉換等，對白色念珠菌致病性起重要作用。白色念珠菌具有孢子相和菌絲相兩種基本形態(tài)，菌絲更容易持續(xù)黏附在上皮細胞的表面。有研究表明[6-7]，菌絲相的白色念珠菌更具有致病性，對宿主的黏附能力更強。本實驗結果表明，500 mg/L桔梗皂苷D對KB細胞不存在毒性，因此，本實驗中所采用的桔梗皂苷D的劑量對黏膜上皮細胞不具有毒性。隨著桔梗皂苷D濃度的增加，白色念珠菌由孢子相向菌絲相改變逐漸減少，表明桔梗皂苷D能夠抑制白色念珠菌由孢子相向菌絲相轉變，并使白色念珠菌對KB細胞的黏附能力下降。臺盼藍排斥實驗結果顯示白色念珠菌均是以活體的形式侵入KB細胞，但隨著桔梗皂苷D的濃度增加，白色念珠菌黏附數(shù)顯著減少，由此推測桔梗皂苷D可能具有抑菌作用。

IL-18是一個重要的免疫調(diào)節(jié)因子。Tardif等[8]在人類正?？谇火つそM織和唾液腺中檢測到IL-18。白色念珠菌感染口腔黏膜組織后，IL-18的表達顯著升高。本實驗結果顯示桔梗皂苷D能夠抑制IL-18的蛋白表達，可能是通過減少白色念珠菌與口腔上皮細胞的相互作用，使得上皮細胞IL-18的表達減少。

人β-防御素是具有廣譜抗菌(包括念珠菌)活性的小分子陽離子多肽，對機體的免疫作用具有重要的影響[9]。HBD-2在念珠菌病頰黏膜上皮中的表達水平比健康頰黏膜高[10]。普遍認為HBD-2在被感染的局部大量釋放，直接殺傷病原微生物，當擴散后其殺菌能力下降，進而產(chǎn)生趨化活性，使更多的白細胞到達被感染的組織清除病原微生物[11]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，KB細胞自身的HBD-2表達少，白色念珠菌顯著誘導HBD-2的表達，與桔梗皂苷D共同培養(yǎng)后，HBD-2的表達均呈現(xiàn)了下降。但其機制尚未十分清楚。有研究發(fā)現(xiàn)病原微生物細胞壁上具有某些免疫反應的激活分子，通過激活宿主上皮細胞的某些識別受體，如Toll樣受體，從而產(chǎn)生免疫應答因子，如TNF、IL-1、IL-12等。

綜上所述，桔梗皂苷D能夠抑制白色念珠菌對口腔黏膜上皮細胞的黏附作用，可能通過參與口腔黏膜上皮細胞的免疫抑制作用而降低白色念珠菌對口腔黏膜的感染。

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(責任編輯： 林白霜， 羅 森)

Platycodin D protects oral epithelial cells against infection of Candida albicans

ZHU Li-fen, WANG Bing

(DepartmentofStomatology,ChongqingHospitalofTraditionalChineseMedicine,Chongqing400010,China.E-mail: 187014511@qq.com)

AIM: To investigate the effect of platycodin D onCandidaalbicansinfection in oral epithelial cells. METHODS: The viability of the oral squamous carcinoma KB cells was detected by MTT assay after treated with different concentrations of platycodin D. The KB cells were infected withCandidaalbicans, and then were incubated with platycodin D at different concentrations. Adherent numbers of theCandidaalbicanswere counted by Gram staining, and the bacterial activity and conversion were measured by Trypan blue staining. Furthermore, the protein levels of IL-18 and human β-defensin 2 (HBD-2) were analyzed by ELISA, and the expression of HBD-2 at mRNA and protein levels was determined by RT-qPCR and Western blot, respectively. RESULTS: The viability of the KB cells was not affected by platycodin D at the concentrations used. The adherent numbers, bacterial activity and conversion were decreased by treatment with platycodin D in a dose-dependent manner. In addition, the protein level of IL-18 in the culture supernatant and the mRNA expression of HBD-2 in the KB cells were also reduced after platycodin D treatment.CONCLUSION: Platycodin D has a bacteriostasis effect and prevents oral epithelial cells fromCandidaalbicansinfection.

Platycodin D; Oral epithelial cells;Candidaalbicans

1000- 4718(2017)01- 0161- 05

2016- 04- 11

2016- 11- 07

R363; R379

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.01.027

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