豬瘟病毒抗原表位的研究進(jìn)展

孫永芳 ， 徐 璐 ， 張乾義 ， 王 琴

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所 ， 北京海淀100081)

豬瘟病毒抗原表位的研究進(jìn)展

孫永芳 ， 徐 璐 ， 張乾義 ， 王 琴

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所 ， 北京海淀100081)

豬瘟病毒(CSFV)是黃病毒科瘟病毒屬成員，為單股正鏈RNA病毒，病毒核酸長(zhǎng)約為12.3 kb，由5′-非編碼區(qū)(5′-UTR)、一個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF)和3′-非編碼區(qū)(3′-UTR)構(gòu)成，開(kāi)放閱讀框編碼 3 898 個(gè)氨基酸的前體蛋白，在合成過(guò)程中被病毒自身編碼的或宿主細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶水解為4種結(jié)構(gòu)蛋白和8種非結(jié)構(gòu)蛋白，迄今為止發(fā)現(xiàn)與抗原相關(guān)的蛋白有3種，分別為結(jié)構(gòu)蛋白Erns、E2和非結(jié)構(gòu)蛋白NS3。CSFV的主要抗原表位主要分布于結(jié)構(gòu)蛋白Erns、E2，可以刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體；已有研究發(fā)現(xiàn)[1]，非結(jié)構(gòu)蛋白NS3也是一種抗原相關(guān)蛋白，能夠誘導(dǎo)抗體的產(chǎn)生，且在病毒復(fù)制及病毒與宿主細(xì)胞相互作用中扮演了十分重要的角色。

抗原并不是通過(guò)完整的分子來(lái)發(fā)揮作用的，其功能和特異性往往是通過(guò)其抗原表位來(lái)實(shí)現(xiàn)的，免疫細(xì)胞通過(guò)識(shí)別與結(jié)合抗原分子上的抗原表位來(lái)啟動(dòng)免疫應(yīng)答，CSFV抗原相關(guān)蛋白中含有多種表位，其中包括與相應(yīng)的淋巴細(xì)胞表面的抗原受體結(jié)合，激活淋巴細(xì)胞從而引起免疫反應(yīng)，也包括與相應(yīng)的抗體或致敏淋巴細(xì)胞發(fā)生特異性結(jié)合而發(fā)揮免疫效應(yīng)，因此研究CSFV抗原表位對(duì)明確病毒的免疫機(jī)制、致病機(jī)理以及疫苗的設(shè)計(jì)具有重要的意義。本文就上述3種相關(guān)蛋白表位的研究進(jìn)展進(jìn)行闡述，同時(shí)對(duì)其在疾病診斷、疫苗研發(fā)等方面的應(yīng)用進(jìn)行了闡述。

1 E2蛋白表位

CSFV E2蛋白位于病毒的囊膜表面，由ORF編碼的690(Arg)至1 060(Leu)之間的370個(gè)氨基酸殘基組成，分子量為51-58 kD，主要以同源二聚體或與E2-E1的異源二聚體形式存在于細(xì)胞或病毒粒子表面，靠近E2蛋白N端上游有一段信號(hào)肽序列，C端有一段約40個(gè)疏水性氨基酸構(gòu)成的跨膜區(qū)(TMR)。在CSFV編碼的蛋白中，E2是最不保守的一種蛋白，但卻是主要的抗原蛋白，參與病毒的感染過(guò)程并誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體。E2蛋白作為CSFV主要保護(hù)性抗原，因此大量的表位研究也主要集中在CSFV E2基因上。從1989年Wensvoort等[2]就開(kāi)始利用制備的13株CSFV特異性單克隆抗體完成了E2蛋白抗原結(jié)構(gòu)域的劃分，發(fā)現(xiàn)了4個(gè)獨(dú)立的抗原結(jié)構(gòu)域：A、B、C、D。后經(jīng)van Rijn[3]對(duì)E2抗原結(jié)構(gòu)模型的進(jìn)行預(yù)測(cè)，確定了這4個(gè)區(qū)域的位置，發(fā)現(xiàn)這些抗原結(jié)構(gòu)域主要位于E2蛋白近N端的1/2部分，處于兩個(gè)相對(duì)獨(dú)立的抗原結(jié)構(gòu)單位，一個(gè)由結(jié)構(gòu)域B和C組成，另一個(gè)由高度保守的A構(gòu)成。2000年Lin等[4]對(duì)CSFV Alfort株E2蛋白部分N端(690aa～910aa)進(jìn)行融合表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物與單抗WH303進(jìn)行識(shí)別鑒定，確定了一個(gè)高度保守的線性表位(829aa～837aa：TAVSPTTLR)，比對(duì)發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)在CSFV中高度保守，存在于所有CSFV毒株中，但在牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)和羊邊界病毒(BDV)則變異較大，目前已有許多研究者應(yīng)用該表位進(jìn)行的疫苗研究[27-30]。劉思國(guó)等[5]從氨基酸的抗原性、親水性和表面可及性等方面應(yīng)用蛋白分析軟件，對(duì)CSFV疫苗株E2蛋白抗原表位進(jìn)行了預(yù)測(cè)，結(jié)合E2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，人工合成兩條多肽序列，與多種特異性單抗進(jìn)行反應(yīng)以及偶聯(lián)載體后免疫家兔，發(fā)現(xiàn)多肽WKEYNHDLQND(719aa～730aa)具有很好的反應(yīng)原性和免疫原性，并推測(cè)該表位可能是B細(xì)胞構(gòu)象型表位。隨著噬菌體肽庫(kù)的發(fā)展，Yu等[6]利用酵母表達(dá)的重組CSFV E2蛋白制備單抗，通過(guò)篩選靶基因表達(dá)文庫(kù)和噬菌體展示隨機(jī)肽庫(kù)，在E2蛋白C端發(fā)現(xiàn)一個(gè)瘟病毒屬保守性的線性表位YYEP(995aa～998aa)，Dong等[7]通過(guò)構(gòu)建表位肽疫苗，通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了KNKYYEP(992aa～998aa)是CSFV石門(mén)株E2蛋白的一個(gè)抗原表位。肖昌等[8]利用抗E2蛋白單抗A11淘選噬菌體隨機(jī)12肽庫(kù)，發(fā)現(xiàn)單抗A11識(shí)別抗原表位為T(mén)TWKEYSH(717aa～724aa)，位于E2蛋白的N端。Peng等[9]利用單抗HQ06進(jìn)行淘選噬菌體隨機(jī)12肽庫(kù)，發(fā)現(xiàn)LFDGTNP(772aa～778aa)是E2蛋白的一個(gè)線性B細(xì)胞表位。徐和敏等[10]構(gòu)建CSFV石門(mén)株和疫苗株E2基因噬菌體展示多肽庫(kù)，利用7株單抗進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)有3個(gè)表位存在高度同源性，其中TAVSPTTLR已經(jīng)證實(shí)為E2蛋白的抗原表位，GGQ(V)VK(887aa～891aa)和PDGLPHY(903aa～909aa)與預(yù)測(cè)表位一致，推測(cè)可能是E2蛋白的潛在抗原表位。目前本實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用肽芯片高通量篩選法鑒定特異性單抗的抗原表位，發(fā)現(xiàn)篩選結(jié)果與徐和敏篩選表位部分重疊，對(duì)其表位的精確定位正在進(jìn)一步鑒定之中。

為了進(jìn)一步了解E2蛋白的構(gòu)象表位，確定特殊氨基酸在抗原表位中的作用，van Rijn等[11-12]用點(diǎn)突變的方法將CSFV E2蛋白N端6個(gè)半胱氨酸(Cys)替換為絲氨酸(Ser)，利用多種特異性單抗進(jìn)行反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)第693和737位Cys對(duì)E2蛋白B和C結(jié)構(gòu)域抗原表位是必需的，第792、818位和856位Cys對(duì)A和D區(qū)域的抗原表位是必需的。Chang等[13]對(duì)CSFV E2蛋白結(jié)構(gòu)域中所有Cys進(jìn)行了定點(diǎn)突變，構(gòu)建載體進(jìn)行表達(dá)，發(fā)現(xiàn)CSFV E2蛋白的D/A結(jié)構(gòu)域和C端末端分別存在一個(gè)構(gòu)象表位，而且D/A區(qū)域中的Cys不僅影響與抗D/A區(qū)單抗的結(jié)合，還對(duì)抗C端蛋白的單抗結(jié)合有影響，說(shuō)明這兩個(gè)表位之間在空間構(gòu)象上相鄰且相互作用。

2 Erns蛋白表位

Erns糖蛋白是由ORF編碼的268(Glu)至494(Ala)之間的227個(gè)氨基酸組成，存在9個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)，分子量為44～48 kD， Erns沒(méi)有疏水的跨膜區(qū)，通過(guò)非共價(jià)連接方式與病毒囊膜中的E2-E1二聚體蛋白或以疏水作用力與囊膜脂質(zhì)層結(jié)合在病毒粒子表面[14]，在病毒囊膜上不穩(wěn)定，是可分泌蛋白，在CSFV感染的細(xì)胞上清、組織和血清中均能檢測(cè)到Erns蛋白。Erns作為CSFV的免疫糖蛋白，也能刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，被用于抗原表位載體的研究。Langeduk等[15]在CSFV Erns蛋白C端191aa～227aa處發(fā)現(xiàn)了一個(gè)抗原表位，該表位具有鑒別CSFV、BVDV、BDV的功能，利用該多肽可以對(duì)免疫豬和自然感染豬進(jìn)行鑒別診斷，王鈺璇等[16]通過(guò)原核表達(dá)也證實(shí)了該段多肽具有良好的抗原特異性。Lin等[17]通過(guò)對(duì)CSFV Alort/187株的Erns蛋白進(jìn)行分段表達(dá)，發(fā)現(xiàn)位于332aa～412aa、351aa～427aa和376aa～487aa三個(gè)重疊區(qū)域能夠與抗CSFV全血清發(fā)生反應(yīng)，說(shuō)明這3個(gè)區(qū)間中存在抗原表位，且涵蓋了病毒的保守區(qū)和變異區(qū)。Meyer等[18]采用點(diǎn)突變和構(gòu)建重疊Erns肽庫(kù)的方法，利用抗Erns的單抗篩選表位，發(fā)現(xiàn)在CSFV Alfort/187株的一個(gè)抗原區(qū)域存在3個(gè)模擬表位，分別為T(mén)NYTCCKLQ(64aa～72aa)，RHEWNKHGW(73aa～81aa)，DPWIQLMNR(88aa～96aa)。到目前為止，人們對(duì)Erns蛋白的抗原表位研究較少，這是由于Erns蛋白雖然是一個(gè)比較保守的蛋白，但其暴露在囊膜外的部分為易變區(qū)，因此Erns抗原表位的差異性較大，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)一株抗Erns的單抗能夠識(shí)別所有的毒株，這為其研究增加了困難。

3 NS3蛋白表位

在不同瘟病毒之間以及同一瘟病毒的不同毒株之間，NS2/3裂解位點(diǎn)的切割程度變化很大，在CSFV中NS2/3呈不完全切割，出現(xiàn)NS2-3和NS3兩種形式，研究發(fā)現(xiàn)，NS2-3是一種免疫優(yōu)勢(shì)蛋白[19]，在感染動(dòng)物體能均能發(fā)現(xiàn)抗NS2-3的抗體，但NS2-3抗體不具有病毒中和活性。已有研究發(fā)現(xiàn)[20]，在CSFV 非結(jié)構(gòu)蛋白NS3與NS4A酶切位點(diǎn)附近(2 273aa～2 287aa)存在一個(gè)MCH-Ⅰ分子的T細(xì)胞表位(ENALLVALF)，該表位能夠誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)應(yīng)答，而且該表位在瘟病毒屬中高度保守。此后，Armemgol等[21]在NS2-3上也鑒定了一個(gè)T細(xì)胞表位，采用人工合成多肽的方法，橫跨CSFV 82%的氨基酸序列，進(jìn)行誘導(dǎo)特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)有一段肽段(KHKVRNEVMVHWFDD)與CSFV非結(jié)構(gòu)蛋白NS2-3 1 446～1 460位氨基酸殘基同源，而且該多肽可以誘導(dǎo)干擾素調(diào)節(jié)因子-γ(Interferon Regulatory Factor -γ，INF-γ)分泌，INF2-γ能夠刺激CD+4T和CD+8T 細(xì)胞應(yīng)答，在融細(xì)胞試驗(yàn)中，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)CSFV特異性T淋巴細(xì)胞能夠融解含有該多肽的靶細(xì)胞，這說(shuō)明該肽段上既存在CSFV特異的輔助性T細(xì)胞抗原表位，又含有CTL抗原表位，該表位可作為合成肽疫苗的候選區(qū)域，在黃病毒科其他病毒的表位研究中，也發(fā)現(xiàn)非結(jié)構(gòu)蛋白NS3上存在T細(xì)胞表位，這與CSFV結(jié)果一致[22-24]，這為深入了解CSFV NS3蛋白抗原表位提供了依據(jù)，也為CSFV新型疫苗的研制提供思路。

4 豬瘟病毒抗原表位的應(yīng)用

抗原表位是蛋白質(zhì)抗原性的基礎(chǔ)，研究抗原表位對(duì)設(shè)計(jì)具有免疫原性和中和活性的多肽、新型疫苗分子以及新型診斷試劑等具有重要意義，隨著抗原表位鑒定技術(shù)以及預(yù)測(cè)方法的不斷更新與完善，研究者對(duì)CSFV抗原表位研究也逐步深入，使得將表位應(yīng)用到疫苗研究、病毒診斷以及鑒定特異性抗體等方面成為可能。

4.1 檢測(cè)診斷 抗原表位是激發(fā)免疫反應(yīng)的基本單元，使用特異性的抗原表位或其復(fù)合物作為抗體或細(xì)胞因子的檢測(cè)物，可檢測(cè)出特異的免疫成分，提高診斷的特異性，而且使用多種特異表位作為檢測(cè)抗原也可提高診斷方法的敏感性，目前已有許多研究者制備特異性的單抗用于抗原或抗體的檢測(cè)，而且成果顯著。張富強(qiáng)等[25]基于單抗、抗原表位的特異性和噬菌體模擬表位的放大效應(yīng)，以單抗作為包被抗體，以噬菌體模擬表位為競(jìng)爭(zhēng)指示劑，以抗M13噬菌體主要蛋白的特異性抗體為檢測(cè)抗體，建立了用于CSFV抗原檢測(cè)的競(jìng)爭(zhēng)ELISA，在76份臨床樣品檢測(cè)中，該方法較國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)抗原捕捉ELISA具有更高的敏感性，可作為CSFV抗原常規(guī)檢測(cè)方法應(yīng)用。Li等[26]使用pET表達(dá)系統(tǒng)將CSFV E2蛋白部分抗原表位和Erns蛋白部分抗原表位作為嵌合蛋白進(jìn)行原核表達(dá)，制備豬瘟抗體膠體金快速檢測(cè)試紙，用該試紙對(duì)免疫后豬血清進(jìn)行抗體檢測(cè)，其敏感度為97.0%(65/67),特異性為100%(98/98)，這與商品化ELISA試劑盒檢測(cè)結(jié)果相一致，符合率達(dá)93.5%，制備的試紙條能夠快速檢測(cè)免疫CSFV疫苗后豬體內(nèi)的抗體效價(jià)，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。Fimme等[27]利用多肽懸浮芯片技術(shù)，將CSFV E2蛋白線性表位(TAVSPTTLR)固定在磁珠上，從而來(lái)捕捉血清中特異性抗體，使用該方法對(duì)87份CSFV陽(yáng)性血清以及BVDV和BDV陽(yáng)性血清進(jìn)行反應(yīng)，確定含有特異表位的芯片能夠與CSFV血清發(fā)生特異性反應(yīng)，而不與其他瘟病毒屬進(jìn)行交叉反應(yīng)，該方法可用于豬瘟病毒與其他瘟病毒之間的鑒別檢測(cè)。

4.2 疫苗研究 到目前為止，豬瘟兔化弱毒疫苗接種仍然是控制豬瘟的主要手段，但其惟一的缺陷是無(wú)法區(qū)分感染動(dòng)物與免疫動(dòng)物。隨著豬瘟根除計(jì)劃的推進(jìn)，許多研究者開(kāi)始致力于新型豬瘟疫苗的研制。研究者利用保守抗原表位TAVSPTTLR進(jìn)行了一系列的疫苗研究，將該表位與GST標(biāo)簽進(jìn)行融合表達(dá)[28]或人工合成表位肽并結(jié)合載體蛋白[29]來(lái)提高表位肽疫苗的免疫原性，免疫動(dòng)物后均能產(chǎn)生特異性的中和抗體，但不能對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生完全保護(hù)。此后，Monso[30]和Guo等[31]構(gòu)建CSFV多表位分枝多肽系統(tǒng)，將E2蛋白的B細(xì)胞表位和NS3蛋白的T細(xì)胞表位共同連接到一個(gè)賴(lài)氨酸“樹(shù)”上形成樹(shù)狀分枝結(jié)構(gòu)，使免疫原性有所提高，但仍不能產(chǎn)生完全保護(hù)。Holinka等[32,33]通過(guò)轉(zhuǎn)座子篩選方法在CSFV Brescia株E1基因中插入Flag片段使病毒致弱，并以Flag為陽(yáng)性標(biāo)記，突變單抗WH303對(duì)應(yīng)表位(TAVSPTTLR)為陰性標(biāo)記，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，免疫該標(biāo)記疫苗后，豬體內(nèi)產(chǎn)生較高滴度的抗Flag抗體，而改造后疫苗免疫后不產(chǎn)生與TAVSPTTLR表位相應(yīng)的抗體，并保護(hù)豬免受豬瘟強(qiáng)毒的感染，這說(shuō)明該毒株是一種具有潛力的雙標(biāo)記疫苗，可用于豬瘟病毒的預(yù)防和檢測(cè)。

4.3 其他應(yīng)用 病毒載體疫苗利用載體容量大的特性，可以研制多聯(lián)疫苗，實(shí)現(xiàn)一針?lè)蓝嗖〉哪康模切滦拓i瘟疫苗的主要研究方向，目前用于豬瘟疫苗研究的載體主要包括痘病毒、偽狂犬病病毒、豬腺病毒和牛流行性腹瀉病毒等載體，應(yīng)用這些載體已成功研制出一些疫苗，但往往出現(xiàn)免疫效果不理想，免疫應(yīng)答遲緩，存在潛在的基因交換的風(fēng)險(xiǎn)等問(wèn)題，因此研究人員仍在繼續(xù)尋找合適的載體用于疫苗的研究，Zhu等[34]分別將PRRSV全部ORF5和CSFV E2蛋白部分抗原表位插入到致弱的腦心肌炎病毒(Encephalomyocarditisviruses，EMCV)中，構(gòu)建重組病毒，其表達(dá)產(chǎn)物是部分PRRSV囊膜蛋白GP5和CSFV中和抗原表位與EMCV蛋白相連，免疫小鼠檢測(cè)產(chǎn)物的免疫原性，發(fā)現(xiàn)小鼠可以產(chǎn)生抗PRRSV或抗CSFV的中和抗體，這說(shuō)明EMCV可以作為一個(gè)表達(dá)載體或工具用于新型疫苗的研究。Zhang等[35]利用將豬圓環(huán)病毒Ⅱ型(porcinecircovirustype2，PCV-2)核心蛋白核定位信號(hào)(nuclear location signal，NLS)替換成外源蛋白而形成病毒樣顆粒(Virus-like particles，VLPs)，分別將CSFV T細(xì)胞表位(1 446aa～1 460aa)、B細(xì)胞表位(693aa～716aa)和兩表位相連進(jìn)行替換，，對(duì)重組基因進(jìn)行桿狀病毒表達(dá)，間接ELISA和Western-Blot驗(yàn)證抗原表位，免疫小鼠進(jìn)行免疫原性評(píng)估，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三種模擬核心蛋白NLS形成VLPs，并且誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生有效的抗PCV-2和抗CSFV的體液免疫和細(xì)胞免疫，從而推測(cè)PCV-2 VLPs可用于抗原載體來(lái)傳遞外源表位，并且可制備成多價(jià)苗用于新型疫苗的研究。

5 小結(jié)

抗原表位作為抗原的重要組成部分，在誘導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要的作用，而表位的確定不僅可以了解有關(guān)免疫反應(yīng)的眾多信息，為進(jìn)一步人工控制免疫反應(yīng)奠定基礎(chǔ)，而且對(duì)藥物合成、疫苗設(shè)計(jì)等具有指導(dǎo)意義。近年來(lái)，研究者致力于CSFV抗原表位的研究，篩選出多個(gè)特異性CSFV表位，這使得為豬瘟疫苗的研發(fā)與診斷鑒定提供了理論依據(jù)。文章針對(duì)近年來(lái)CSFV抗原相關(guān)蛋白中抗原表位的研究進(jìn)展進(jìn)行了闡述，并對(duì)其在疾病診斷、疫苗研發(fā)等方面的應(yīng)用進(jìn)行了介紹，為研究學(xué)者深入了解CSFV免疫機(jī)理、致病機(jī)理及疫苗的研發(fā)提供了理論依據(jù)，具有一定的參考價(jià)值。

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2017-04-11

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31372434)

孫永芳(1989-)，女，碩士生，從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究，E-mail:17701023687@163.com

王琴，E-mail：wq551@vip.sina.com

S852.651

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0529-6005(2017)07-0072-04