豬圓環(huán)病毒3的流行及應(yīng)對措施研究

王彩霞 ， 馮春燕 ， 劉丹丹 ， 張永寧 ， 杜方原 ， 林祥梅 ， 吳紹強(qiáng)

(中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院動物檢疫研究所 ， 北京大興100176)

豬圓環(huán)病毒3的流行及應(yīng)對措施研究

王彩霞 ， 馮春燕 ， 劉丹丹 ， 張永寧 ， 杜方原 ， 林祥梅 ， 吳紹強(qiáng)

(中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院動物檢疫研究所 ， 北京大興100176)

2015年6月，由于豬繁殖障礙、皮炎和腎病綜合征(PDNS)的暴發(fā)，北卡羅萊納州的一個(gè)商業(yè)豬場的母豬死亡率增加了10.2%，受孕率降低了0.6%。美國堪薩斯州立大學(xué)、愛荷華州立大學(xué)和史密斯菲爾德的研究人員對該豬場的病料組織樣品進(jìn)行了檢測，排除了豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)、高致病性藍(lán)耳病毒(PRRSV)、甲型流感病毒(IAV)、豬細(xì)小病毒(PPV)的感染，分離到1株新病毒，并將該病毒確認(rèn)為新型豬圓環(huán)病毒3型(PCV-3)[1]。Palinski等的進(jìn)一步研究指出，目前PCV-3在美國已有較為廣泛的分布。隨后，我國華中農(nóng)業(yè)大學(xué)在我國安徽、重慶、福建、河北、河南、湖南、江蘇、江西、遼寧、沈陽、浙江等11個(gè)省市或地區(qū)也檢測到了PCV-3[2]，可見PCV-3已經(jīng)開始在世界范圍內(nèi)蔓延開來，逐漸引起世界各國的高度重視和密切關(guān)注，本文將對該病的發(fā)生、發(fā)展、病原學(xué)、流行情況、診斷方法及防控、應(yīng)對措施等研究進(jìn)行綜述。

1 發(fā)生史

豬圓環(huán)病毒是目前發(fā)現(xiàn)的可以自主復(fù)制的最小的哺乳動物病毒。已經(jīng)確定有兩種類型的PCV，即圓環(huán)病毒1型(PCV-1)和圓環(huán)病毒2型(PCV-2)。PCV-1于1974年首次在PK細(xì)胞培養(yǎng)物中作為一種污染物鑒定，其對豬只沒有致病性。PCV-2于1998年首次報(bào)道，其在臨床條件下能引起豬只的豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病。自2010年一些研究者就報(bào)道，在豬樣品中檢測到了新的圓環(huán)病毒，直到2016年，美國的Palinski等通過宏基因組測序首次將其確認(rèn)為新型豬圓環(huán)病毒3型[1]。

2 病原學(xué)

2.1 分類地位 豬圓環(huán)病毒3型屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬。圓環(huán)病毒科包含3個(gè)病毒屬，分別為圓環(huán)病毒屬(Cirocovirus)，環(huán)形病毒屬(Gyrovirus)和指環(huán)病毒屬(Anellovirus)。進(jìn)化樹分析表明PCV-3與犬圓環(huán)病毒密切相關(guān)，然而這種關(guān)系缺乏有力的證據(jù)支持。進(jìn)化樹分析還表明PCV-3和犬圓環(huán)病毒與PCV-1、PCV-2和蝙蝠圓環(huán)病毒2型的進(jìn)化枝具有共同的祖先[1]。

2.2 基因組結(jié)構(gòu) 豬圓環(huán)病毒(Porcinecircoviruses，PCV)是單股環(huán)狀的DNA病毒，基因組長度約為1.7 kb長，是最小的動物DNA病毒之一。首先被確診為新型圓環(huán)病毒3型的毒株名稱為2164(Genbank NO.KX458235)和29160((Gen-Bank NO.KT869077))，該病毒基因組長為2.0 kb，其基因組結(jié)構(gòu)如下圖1所示，共有3個(gè)開放閱讀框(ORF)，分別編碼與圓環(huán)病毒同源的REP蛋白，CAP蛋白和一個(gè)特有的ORF3蛋白， BLASTP分析顯示rep和cap在相反的方向上，且在rep基因鏈上位于rep和capORFs之間的235-nt 的5′端的基因間隔區(qū)是一個(gè)預(yù)測的帶有與PCV-1(TAGTATTAC)相同的9-nt莖-環(huán)九聚體莖環(huán)結(jié)構(gòu)[3]。

圖1 新型豬圓環(huán)病毒的基因組結(jié)構(gòu)(摘自Palinski et al，2017)

最大的ORF編碼的是與圓環(huán)病毒同源的REP蛋白，含有297個(gè)氨基酸，BLASTP顯示與圓環(huán)病毒PorkNW2/USA/2009的部分復(fù)制酶蛋白的同源性為69.4%，與中國蝙蝠圓環(huán)病毒的同源性為54%。保守的圓環(huán)病毒復(fù)制酶和解旋酶區(qū)域通過BLASTP分析確定分別位于REP ORF的9～93個(gè)氨基酸和162～251個(gè)氨基酸處。進(jìn)一步分析顯示,repORF蛋白序列顯示保守的滾環(huán)復(fù)制(RCR)基序和一個(gè)P-環(huán)基序，與鵝圓環(huán)病毒(GoCV)和鴿子圓環(huán)病毒(PiCV)類似[4-5]。PCV-3的3個(gè)保守的滾環(huán)復(fù)制(RCR)基序中，F(xiàn)TLNN基序含有單個(gè)突變，L突變?yōu)镮，成為FTINN。這種突變在其他圓環(huán)病毒如GoCV中可以看到[4]。另外兩個(gè)RCR基序(HLQG和YCKK)也存在于PCV-3病毒中。而且3個(gè)基序包括WWDGY(196-200個(gè)氨基酸)、DDFYGWVP(209-2016個(gè)氨基酸)和DRYP(225-228個(gè)氨基酸)在圓環(huán)病毒復(fù)制酶蛋白中是保守的，具有未知功能。有趣的是，該ORF沒有確定的起始密碼子。在這個(gè)ORF中5′端的起始密碼子可能為GTC(編碼纈氨酸)，而閱讀框中最近的ATG在下游約400 bp處。這種替代ATG起始密碼子的現(xiàn)象在圓環(huán)病毒PorkNW2/USA/2009中也出現(xiàn)過，還有在一些禽類圓環(huán)病毒，包括GoCV、PiCV和喙羽病病毒(BFDV)中也出現(xiàn)過[6-8]。

位于rep相反方向有一個(gè)推測的cap ORF，編碼了一個(gè)214個(gè)氨基酸的蛋白，BLASTP分析與圓環(huán)病毒PorkNW2/USA/2009的部分衣殼基因序列的同源性為87%，與PCV-2和鴨圓環(huán)病毒(DuCV)的同源性為36%～37%。同其他圓環(huán)病毒蛋白相似，N端含有許多精氨酸殘基，并且是高堿性的。保守的圓環(huán)病毒衣殼區(qū)域在26～173個(gè)氨基酸。此外，PCV-3的cap蛋白沒有預(yù)測的N-連接糖基化位點(diǎn)，但在第146和150個(gè)氨基酸處(分別為S和T)具有兩個(gè)預(yù)測的O-連接糖基化位點(diǎn)。這與PCV-2形成對比，PCV-2經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證具有兩個(gè)N-連接糖基化位點(diǎn)[9]。

病毒編碼的第3個(gè)ORF與預(yù)測的rep ORF在同一條鏈上，編碼一個(gè)231個(gè)氨基酸的蛋白，BLASTP分析與圓環(huán)病毒PorkNW2/USA/2009確定的ORF的同源性為94%，與鼠皰疹病毒M169，一個(gè)未知功能的蛋白的同源性為39%[10]。同rep蛋白相似，ORF3的起始密碼子不是ATG，編碼位置不清楚，5′端的密碼子是TCG(編碼絲氨酸)。也有研究推測，ORF3第55個(gè)氨基酸處的蛋氨酸可能是一個(gè)起始位點(diǎn)，會產(chǎn)生一個(gè)177個(gè)氨基酸的蛋白[1]。

對中國確診毒株的基因序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，結(jié)果顯示，來自中國的PCV-3分離株與美國分離株的基因組和衣殼核苷酸相似度分別為99.0%～99.1%和98.4%～98.9%。中國PCV-3分離株之間的基因組和衣殼核苷酸的相似度分別為99.0%～100%，98.4%～100%。這表明衣殼的變異程度要高于全基因組[2]，中國分離株與美國分離株具有很高的同源性(見圖2)。

2.3 培養(yǎng)特性 PCV-3的分離培養(yǎng)可以采用豬睪丸細(xì)胞(ST)和豬腎細(xì)胞(PK-15)[1]進(jìn)行分離。

3 流行病學(xué)

3.1 感染部位 感染了病毒的帶毒豬或病豬，死胎豬的腦、肺、淋巴結(jié)、扁桃體、精液、血液中均可檢測出PCV-3病毒[2]。

3.2 傳播途徑 死胎和精液中可檢測到PCV-3，表明PCV-3存在著垂直傳播的風(fēng)險(xiǎn)[2]。該病還可經(jīng)口腔、呼吸道等途徑感染豬。

3.3 易感動物 目前的研究發(fā)現(xiàn)，PCV-3的易感宿主主要是豬。各種品種、年齡、不同性別的豬均可感染[11]。

3.4 發(fā)病率與死亡率

2015年6月，北卡羅萊納州的一個(gè)商業(yè)豬場與以往的數(shù)據(jù)相比，母豬死亡率增加了10.2%，受孕率降低了0.6%。每窩增加了1.19個(gè)死亡木乃伊胎，超過歷史平均流產(chǎn)率[1]。華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物疾病診斷中心對收集自湖北省種豬場的14份繁殖障礙豬樣品進(jìn)行了檢測，其中有12份確認(rèn)為PCV-3陽性[12]。

4 臨床癥狀及病理變化

4.1 臨床癥狀 新型圓環(huán)病毒3型能引起豬的皮炎、腎病綜合征、繁殖障礙(圖3)及心臟和多系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)?；疾∧肛i表現(xiàn)厭食，呈現(xiàn)多灶性丘疹、斑點(diǎn)和表面皮炎，豬群的死亡率增加，受孕率降低，母豬的流產(chǎn)率增加，生下不同胎齡的死亡木乃伊胎[1]?；疾∽胸i主要表現(xiàn)為呼吸、泌尿、腸道、淋巴、心血管、神經(jīng)、繁殖系統(tǒng)以及皮膚的功能紊亂，對全世界的生豬養(yǎng)殖造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失[12]。

4.2 病理變化 組織學(xué)上，皮膚損傷的特征是急性壞死性皮炎和與淋巴漿細(xì)胞性血管套相關(guān)的表皮炎。腎臟皮質(zhì)小管擴(kuò)張、衰減和管狀黏膜上皮的再生，和大型集群的淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞大量地滲透到大腦皮層間質(zhì)和腎小球[1]。

圖2 (a)：不同物種圓環(huán)病毒完整基因組的系統(tǒng)進(jìn)化樹;(b)：不同的中國PCV-3分離株同美國PCV-3分離株P(guān)CV-3-USA-MO2015的部分衣殼基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(摘自Ku X et al, 2017)

圖3 新型豬圓環(huán)病毒引起豬的皮膚疾病和繁殖障礙(摘自Palinski et al，2016)

5 流行情況

自2016年9月PCV-3被首次確診以來，PCV-3在美國的分布范圍已經(jīng)較廣[1]，在中國安徽、重慶、福建、河北、河南、湖南、江蘇、江西、遼寧、沈陽、浙江11個(gè)省市或地區(qū)也有感染報(bào)道[2]。2016年12月在中國廣東省的斷奶仔豬中也檢測到了PCV-3[13]。由于該疫病屬于新發(fā)疫病，其他國家和地區(qū)目前還未有報(bào)道。

6 診斷

6.1 鑒別診斷 豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病(PCVAD)臨床上表現(xiàn)為斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)，豬呼吸道綜合征，繁殖障礙和豬皮炎腎病綜合征，上述癥狀并非PCV-3的特異性癥狀，因此，對患豬進(jìn)行鑒別診斷時(shí)，需要首先排除PCV-2、高致病性藍(lán)耳病毒(PRRSV)、甲型流感病毒(IAV)和豬細(xì)小病毒(PPV)的感染或其他可引起上述癥狀的因素，然后通過進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)來進(jìn)行確診[1]。

6.2 病毒的分離與鑒定 病毒的分離與鑒定是確診疫病最準(zhǔn)確的檢測方法，由于成年患病動物常缺乏臨床癥狀而導(dǎo)致病毒血癥期難以掌握，從而影響病毒分離。因此，通常從流產(chǎn)胎兒或死胎的組織樣品中分離病毒[14]。Palinski等[1]利用ST和PK-15細(xì)胞從胎兒組織勻漿中分離到了PCV-3。PCV-3可以在不同的豬組織中檢測到，例如腦、肺、淋巴結(jié)、扁桃體、精液和血清中均可檢測到[2]。

6.3 分子生物學(xué)檢測方法 目前，Palinski等[1]在實(shí)驗(yàn)室研究中已經(jīng)針對PCV-3建立了PCR、定量熒光PCR方法、免疫組化檢測等方法，并針對cap蛋白制備單克隆抗體建立了PCV-3的免疫熒光檢測方法。Phan等[15]利用靶向PCV-3的探針進(jìn)行原位雜交調(diào)查了心臟和肺中的PCV-3，結(jié)果顯示，在呈現(xiàn)彌漫性肌漿/胞漿性反應(yīng)的多灶性心肌細(xì)胞、發(fā)炎小動脈中膜的平滑肌細(xì)胞和心肌中的炎癥細(xì)胞(大概是巨噬細(xì)胞)中較少檢測到PCV-3 mRNA，在肺切片中未檢測到PCV-3 mRNA。中國的Ku等[2]設(shè)計(jì)PCR引物對中國11個(gè)省市或地區(qū)的35個(gè)農(nóng)場的222份樣品進(jìn)行了PCV-3檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)11個(gè)省市或地區(qū)的樣品均可檢測到PCV-3。但值得一提的是，目前這些技術(shù)還未形成商品化的試劑盒，都僅停留在實(shí)驗(yàn)室階段。

6.4 血清學(xué)檢測方法 Palinski等利用純化的重組衣殼蛋白包被ELISA板子，建立了PCV-3的ELISA檢測方法[1]。

7 防控

圓環(huán)病毒病是國際公認(rèn)的危害養(yǎng)豬業(yè)的重大經(jīng)濟(jì)影響性疾病，是養(yǎng)豬業(yè)的3大疾病(豬瘟、藍(lán)耳病、豬圓環(huán)病毒病)之一。對PCV-3的防控，首先要強(qiáng)化生物安全，提高相關(guān)人員的消毒意識，嚴(yán)格執(zhí)行消毒規(guī)范。重視防蚊滅蠅，清潔環(huán)境，保持衛(wèi)生。定期滅鼠。其次應(yīng)加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，改善豬場環(huán)境，控制營養(yǎng)結(jié)構(gòu)，做好引種考察工作，及時(shí)隔離淘汰病豬，嚴(yán)密處理死豬及相關(guān)飼喂設(shè)施[11,16-17]。此外，PCV-2與PCV-3的衣殼蛋白之間只有30%的同源性，利用PCV-2疫苗產(chǎn)生交叉保護(hù)的可能性較小[1]，因此，必須盡快研制優(yōu)質(zhì)高效的PCV-3疫苗，通過疫苗免疫來防控該病。同時(shí)還應(yīng)定期對豬群進(jìn)行投藥保健，增強(qiáng)豬群自身的抵抗力。

8 我國需采取的應(yīng)對措施

8.1 加快檢測技術(shù)儲備研究 PCV-3是一種新型病毒，將可能對我國養(yǎng)豬業(yè)構(gòu)成巨大威脅，為了及時(shí)監(jiān)控疫情，防止疫情的擴(kuò)散與傳播，必須加強(qiáng)檢測技術(shù)研究，同時(shí)進(jìn)一步研究探索其生物和致病特征并監(jiān)測其單一和共感染狀態(tài)，以達(dá)到精準(zhǔn)快速的確診疫情。

8.2 做好疫病風(fēng)險(xiǎn)評估 我國的母豬及流產(chǎn)胎兒中已經(jīng)檢測到PCV-3病原，遺傳進(jìn)化樹分析，與美國PCV-3分離株的序列同源性較高。目前不但要防止外來新的疫情傳入，還要防止國內(nèi)疫情的傳播，為避免疫情傳入，對進(jìn)口國豬肉及其產(chǎn)品，以及種豬的進(jìn)口，相關(guān)部門應(yīng)根據(jù)該病的最新研究進(jìn)展做好風(fēng)險(xiǎn)評估工作，并基于準(zhǔn)確的風(fēng)險(xiǎn)評估結(jié)果做出最終的貿(mào)易措施。為避免疫情在國內(nèi)擴(kuò)散，應(yīng)在國內(nèi)開展廣泛的流行病學(xué)調(diào)查，及時(shí)做好疫情監(jiān)控工作，做到防患于未然。

8.3 加強(qiáng)檢驗(yàn)檢疫監(jiān)管 加強(qiáng)對來自疫區(qū)的貨物、攜帶物、郵寄物、運(yùn)輸工具的查驗(yàn)和防疫消毒工作，加強(qiáng)出入境檢驗(yàn)檢疫監(jiān)管力度，嚴(yán)防不合格產(chǎn)品的傳入與傳出[14]。

8.4 加強(qiáng)疫病監(jiān)測 及時(shí)跟蹤國內(nèi)外疫情動態(tài)，加強(qiáng)對國內(nèi)所有易感動物和媒介昆蟲的監(jiān)測。若發(fā)現(xiàn)可疑病例應(yīng)立即上報(bào)，并封鎖疫區(qū)，及時(shí)開展流行病學(xué)和血清學(xué)調(diào)查，并嚴(yán)格控制疫區(qū)易感動物的流動[14]。

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2017-05-26

十三五國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃課題(2016YFD0501105、2016YFD0501106)

王彩霞(1982-)，女，助理研究員，碩士，從事動物檢疫工作，E-mail：friday128@sina.com

馮春燕(1982-)，女，副研究員，博士，從事動物檢疫工作，E-mail：fengcy@caiq.gov.cn

林祥梅，E-mail：linxm@caiq.gov.cn；吳紹強(qiáng)，E-mail：sqwu@sina.com

S852.65+1

B

0529-6005(2017)07-0101-04

注：馮春燕與王彩霞對本文具有同等貢獻(xiàn)