循環(huán)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性及臨床應(yīng)用

周游，蔣敬庭

循環(huán)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性及臨床應(yīng)用

周游，蔣敬庭

惡性腫瘤是一種細(xì)胞增殖與死亡失衡的疾病，其導(dǎo)致患者死亡的首要原因是復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移。早在 19 世紀(jì)就有學(xué)者發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞能通過血流傳播到遠處器官[1]。1869 年Ashworth[1]首次提出循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells，CTCs）的概念。然而，直到最近二十年 CTCs 才得以分離和鑒定。CTCs 具體是指腫瘤患者外周血中來源于實體腫瘤且在逃避宿主免疫殺傷后存活的一群個數(shù)稀少的異質(zhì)性腫瘤細(xì)胞。它不僅存在于轉(zhuǎn)移性腫瘤患者的血液中，也可存在于放療后的原位癌患者中。目前大量臨床研究證實 CTCs是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素[2-3]。相比于創(chuàng)傷較大的病理學(xué)診斷，外周血 CTCs 的檢測取材方便、可重復(fù)操作、靈敏度高、特異性強，可實時監(jiān)測腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移情況以及評估腫瘤的進程。它的出現(xiàn)不僅提示可能有復(fù)發(fā)的風(fēng)險，而且可被作為預(yù)后的分子標(biāo)記物，具有重要的臨床價值。本文就近年來 CTCs 的生物學(xué)特性及其臨床應(yīng)用進展作一綜述。

1 CTCs 的生物學(xué)特性

1.1 CTCs 的增殖活性

腫瘤患者外周血來源的 CTCs 是一群平均半衰期為1 ～ 2.4 h 的異質(zhì)性腫瘤細(xì)胞[4-5]。大部分CTCs 在體內(nèi)循環(huán)過程中處于休眠狀態(tài)，期間也可能會發(fā)生凋亡，最終只有少部分 CTCs 形成轉(zhuǎn)移灶，但目前所用的檢測方法難以辨別休眠和活化的 CTCs，同樣也不能確定其是否正處于細(xì)胞周期，但這些特征都可能影響患者對治療手段的反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，CTCs 低表達增殖相關(guān)的核蛋白 Ki-67[6-8]，提示其可能為不處于細(xì)胞周期中的靜息腫瘤細(xì)胞，而且這些非增殖的細(xì)胞可能對目前使用的化療方法不敏感，因此更易于產(chǎn)生化療耐受從而存活下來。有報道稱活化的 CTCs 可分泌細(xì)胞角蛋白 19（CK19）和 MUC-1，通過EpiSpot 等技術(shù)可將這些蛋白檢測出來[9]，而凋亡的 CTCs 可通過 M30 染色進行鑒定[10]，因此通過計算 CK19 和 M30 的比值可以推斷活化 CTCs 所占的比例[11]，進而指導(dǎo)下一步的治療。

1.2 CTCs 標(biāo)記基因的表達和不完全間質(zhì)轉(zhuǎn)化

現(xiàn)有研究表明腫瘤細(xì)胞具有極大的異質(zhì)性，而來源于原發(fā)灶的 CTCs 同樣也是一個異質(zhì)性極高的群體[12]，因此經(jīng)典的上皮標(biāo)記物如細(xì)胞黏附蛋白（EpCAM）或 CK 等并不能識別血液中所有的 CTCs 群體[13]。據(jù)報道 Normal-like型乳腺癌細(xì)胞表達脂肪組織及非上皮細(xì)胞標(biāo)記物，低表達上皮標(biāo)記基因，因此基于檢測 EpCAM 抗原的 CellSearch 系統(tǒng)往往難以檢出 Normal-like 型乳腺癌細(xì)胞[14-15]，只有使用CD146 才能檢測出這群特殊的 CTCs[16]。同時，單一的 CK抗體可能無法檢測出所有表達于乳腺癌細(xì)胞的 CK 蛋白[17]，合適的或更廣譜的 CK 抗體才能增加檢出率，降低假陰性。最近關(guān)于 EpCAM 通路的研究發(fā)現(xiàn)，抗體只能識別糖蛋白的胞外段，但經(jīng)蛋白酶剪切后 EpCAM 胞內(nèi)段可重定位到細(xì)胞核內(nèi)，而核內(nèi)的 EpCAM 在體內(nèi)往往具有致瘤性[18]。由此可見，腫瘤細(xì)胞的增殖可能需要 EpCAM 的短暫表達和剪切，這也給靶向 EpCAM 的 CTCs 檢測系統(tǒng)帶來了諸多困難。此外，有些腫瘤如黑色素瘤屬于非上皮細(xì)胞癌，不表達 EpCAM 或 CK，因此從患者外周血中分離出 CTCs異常困難。目前分離這部分 CTCs 的主要方法是抗原篩選技術(shù)[19]。近期研究顯示，黑色素瘤患者動脈血中的 CTCs 數(shù)目明顯高于靜脈血[20]，可作為 CTCs 的主要來源。與黑色素瘤類似，惡性膠質(zhì)瘤（GBM）也不表達 EpCAM，并且未有證據(jù)表明 GBM 細(xì)胞可以通過血腦屏障，因此分離CTCs 同樣顯得相當(dāng)困難，目前只有三個研究組報道了從GBM 患者外周血中成功分離 CTCs 的案例[21-23]，并證實CTCs 中含有與原發(fā)灶相同的 EGFR 突變。

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）引起的表型轉(zhuǎn)變可能是不能通過常規(guī)上皮細(xì)胞篩選標(biāo)志檢測 CTCs 的另一個原因。內(nèi)在突變或特定外部刺激均會導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞向間質(zhì)或半間質(zhì)的表型轉(zhuǎn)化[24]，而轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞上皮表面標(biāo)記物表達水平很低，可能導(dǎo)致 CTCs 檢測的假陰性。Sullivan 等[22]發(fā)現(xiàn)與原發(fā)灶相比，CTCs 中有更多的間質(zhì)相關(guān)基因如 SERPINE1、TGFB1、TGFB2 等的富集。Aktas 等[25]發(fā)現(xiàn) 62% CTCs 陽性和 7% CTCs 陰性的腫瘤患者血液中都至少表達一種 EMT 標(biāo)記物（Twist1、Akt2 或PI3Kalpha）。而 Raimondi 等[26]發(fā)現(xiàn)兩種 EMT 標(biāo)記物vimentin 和 fibronectin 分別在 28% CK 陽性和 38% CK陰性的腫瘤患者中表達，因此，vimentin 等 EMT 標(biāo)記物可作為上皮標(biāo)記物的補充在 CTCs 檢測中發(fā)揮重要作用[27]。

1.3 CTCs 的干細(xì)胞樣表型

腫瘤細(xì)胞的 EMT 特征和干性密不可分[28]，因此部分CTCs 可能具有干細(xì)胞樣表型。最新單細(xì)胞測序結(jié)果顯示干細(xì)胞標(biāo)記物 ALDH1、CD44 和 KLF4 以及一些細(xì)胞增殖相關(guān)標(biāo)記物在前列腺癌 CTCs 中顯著富集[29]。研究表明，CTCs 陽性乳腺癌患者血液中 ALDH1 的表達陽性率為46% ～ 70%，且與 EMT 標(biāo)記物及乳腺癌分期相關(guān)[26]。Theodoropoulos 等[30]通過分析 CTCs 基因表達譜發(fā)現(xiàn)，約35% CTCs 具有 CD44+/CD24-/low干細(xì)胞樣表型，17% CTCs 具有 ALDH1high/CD24-/low干細(xì)胞樣表型，且 ALDH1的表達與患者化療耐藥相關(guān)。MRP1、MRP4、MRP5 和MRP7 等耐藥相關(guān)蛋白表達于超過 80% 的乳腺癌轉(zhuǎn)移患者，且與疾病進展密切相關(guān)[31]。

1.4 CTCs 基因型和表型的改變

腫瘤患者的分子診斷和初始治療方法都基于原發(fā)癌進行，但能預(yù)示疾病復(fù)發(fā)或進展情況的是轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞。研究表明，CTCs 的成瘤能力比其親本高出數(shù)十倍[32-33]，顯然具有強侵襲能力的 CTCs 對患者的風(fēng)險評估具有更大的意義，并且 CTCs 與原發(fā)腫瘤細(xì)胞相比基因型和表型的改變可能會影響患者遠期療效[34-35]。研究發(fā)現(xiàn)，HER2-原發(fā)乳腺癌患者中存在 HER2+CTCs，而 HER2+乳腺癌患者中也存在 HER2-CTCs[36]。類似的情況也出現(xiàn)在 EGFR、雌激素受體 alpha 和黃體酮受體中[25, 31]。此外，單細(xì)胞芯片雜交數(shù)據(jù)顯示雖然原發(fā)灶、轉(zhuǎn)移灶以及 CTCs 中都存在結(jié)直腸癌相關(guān)基因 APC、KRAS 和 PIK3CA 等的驅(qū)動突變，但仍有相當(dāng)一部分突變只能在 CTCs 中觀察到，而在原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶中的頻率很低[37]。由于 CTCs 分子特征與原發(fā)癌細(xì)胞具有差異，同時 CTCs 可能通過系統(tǒng)治療經(jīng)歷強烈的選擇，其基因組的不穩(wěn)定可能導(dǎo)致新的癌細(xì)胞克隆形成，而這些克隆的基因型和表型不同于原發(fā)癌細(xì)胞，同樣可能影響患者的療效。而且由于 CTCs 可能從轉(zhuǎn)移癌中進入血液循環(huán)，因此其基因型和表型更接近于轉(zhuǎn)移癌。

然而并非所有腫瘤原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶均發(fā)生明顯的基因型改變。比較原發(fā)前列腺癌和轉(zhuǎn)移前列腺癌的突變譜發(fā)現(xiàn)兩者具有很高的相似性，由此證實 CTCs 基因組可作為一種非侵入性手段用于評估轉(zhuǎn)移性前列腺癌的突變圖譜[38]。此外，全基因組擴增結(jié)果顯示，大部分去勢抵抗性前列腺癌（CRPC）患者中的 CTCs 拷貝數(shù)變異同樣也出現(xiàn)在原發(fā)灶中。同時，前列腺癌中 CTCs 也表現(xiàn)出顯著的異質(zhì)性，包括雄激素受體（AR）突變體和剪切變異體的表達，這可能是患者產(chǎn)生抗雄激素治療的原因[29, 39]?？傊?，在治療原發(fā)灶的同時輔以針對 CTCs 的有效治療措施有望成為一種新的治療策略。

2 CTCs 在腫瘤中的臨床應(yīng)用

2.1 CTCs 與腫瘤的輔助診斷和分期

Bevilacqua 等[40]通過 CTCs 檢測發(fā)現(xiàn)一例臨床診斷為“低分化神經(jīng)內(nèi)分泌瘤”的患者外周血中存在EpCAM+CK+CTCs，肝臟穿刺活檢顯示肝內(nèi)轉(zhuǎn)移灶，最終確診為小細(xì)胞肺癌（SCLC），提示 CTCs 具有輔助診斷腫瘤早期轉(zhuǎn)移的價值。研究表明，CTCs 高表達于部分 TNM 分期較早的腫瘤患者外周血中，可導(dǎo)致腫瘤的快速轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，且與腫瘤分期相關(guān)。Sastre 等[41]檢測了 94 例大腸癌患者外周血中 CTCs 的表達，結(jié)果顯示，CTCs 陽性率與結(jié)腸癌患者的臨床分期相關(guān)。Krebs 等[42]通過 CellSearch 系統(tǒng)檢測 III ～ IV 期非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）患者的 CTCs，發(fā)現(xiàn) IV 期 NSCLC 患者 CTCs 數(shù)量顯著高于 IIIb和IIIa期 NSCLC 患者。Naito 等[43]也發(fā)現(xiàn)廣泛期 SCLC 患者外周血 CTCs 中位數(shù)為 9.5 個/7.5 ml，而局限期 SCLC患者外周血 CTCs 中位數(shù)僅為 1 個/7.5 ml，提示 CTCs 數(shù)目與 SCLC 患者分期相關(guān)。報道顯示，乳腺癌 CTCs 中GA733-2、MUC1、MGB1 和 SPDEF 的表達狀態(tài)與乳腺癌臨床分期相關(guān)[44]。

2.2 CTCs 與腫瘤的療效和預(yù)后

研究顯示，觀察患者治療前及治療過程中外周血中CTCs 數(shù)目的變化有助于評估腫瘤進展和藥物治療療效。Sastre 等[45]發(fā)現(xiàn)化療前外周血 CTCs ≥ 3 個/7.5 ml 和＜ 3 個/7.5 ml 的患者中位無進展生存期（mPFS）和中位總生存期（mOS）均有顯著差異。相較于化療后外周血 CTCs水平較高的患者，化療后外周血 CTCs 水平低的患者的mPFS 和 mOS 顯著延長，提示治療前及治療過程中 CTCs數(shù)目的變化是轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者無進展生存期（PFS）和總生存期（OS）的獨立預(yù)后因素。研究顯示，相較于外周血基線 CTCs 數(shù)目較高的 CRPC 患者，外周血基線 CTCs數(shù)目較低的 CRPC 患者 mOS 更長，且經(jīng)三個周期的多西他賽化療后患者生存期也顯著延長[46]。Normanno 等[47]發(fā)現(xiàn)患者一輪化療后的 CTCs 數(shù)目較基線水平 CTCs 更能反映進展期 SCLC 的預(yù)后和療效。Martín 等[48]也證實患者一輪化療后 CTCs 數(shù)目可作為轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者 PFS 和OS 的獨立預(yù)后因素。與乳腺癌類似，晚期前列腺癌和胰管腺癌（PDAC）患者的 CTCs 數(shù)目也可以預(yù)測疾病進程和預(yù)后[49-50]，但在局部前列腺癌和 GBM 中，研究者并未發(fā)現(xiàn)CTCs 數(shù)目與患者臨床指標(biāo)明顯相關(guān)[23, 51-52]。

2.3 CTCs 與腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移

脫離原發(fā)灶進入血液循環(huán)的腫瘤細(xì)胞能否導(dǎo)致腫瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移不僅取決于腫瘤微環(huán)境，還取決于血液循環(huán)中腫瘤細(xì)胞的特性。只有具備自我更新和無限增殖潛能的循環(huán)腫瘤干細(xì)胞（circulating tumor initiating cells，CTICs）才能引起腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。因此，動態(tài)監(jiān)測治療過程中患者 CTICs的變化可更加準(zhǔn)確地評估療效。一項前瞻性研究顯示，前列腺癌骨轉(zhuǎn)移患者的 CTCs 數(shù)目顯著高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者[53]。越來越多的證據(jù)表明，CTICs 在腫瘤轉(zhuǎn)移中具有重要作用。CD44 是胃癌干細(xì)胞的表面標(biāo)記。Li 等[54]發(fā)現(xiàn)CTCs 與胃癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)顯著相關(guān)，且相較于 CD44-患者，CD44+CTCs+患者更容易出現(xiàn)轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)時間也相對較短。COX 比例風(fēng)險模型顯示，CD44+CTCs 和 TNM 分期可作為胃癌復(fù)發(fā)的獨立預(yù)后因素。通過 CellSearch 系統(tǒng)檢測 492 例乳腺癌患者外周血CTCs 發(fā)現(xiàn)，基線 CTCs ≥ 5 個/7.5 ml 外周血的患者存在更多的轉(zhuǎn)移部位，且其在化療失敗后更易產(chǎn)生新的病變和轉(zhuǎn)移病灶，生存期也較短，提示基線 CTCs 水平可預(yù)測乳腺癌轉(zhuǎn)移[55]。此外，單細(xì)胞 RNA 測序結(jié)果顯示，人和小鼠PDAC CTCs 均高表達基質(zhì)來源的 ECM 蛋白，表明其可能通過表達 Wnt 通路效應(yīng)分子和 ECM 蛋白來促進腫瘤轉(zhuǎn)移[56]。

2.4 CTCs 與腫瘤的個體化醫(yī)療

隨著分子靶向治療的不斷發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)靶基因與腫瘤患者的療效密切相關(guān)，如表皮生長因子受體-酪氨酸激酶抑制劑對 EGFR 突變型非小細(xì)胞肺癌敏感，而伊馬替尼則可用于 KIT 激活突變的胃腸道間質(zhì)瘤和黑色素瘤等，因此，明確腫瘤的靶基因?qū)颊叩闹委熅哂蟹e極意義。作為“液體活檢”的 CTCs 分子特征譜可用于檢測腫瘤治療相關(guān)的基因突變或蛋白，從而實時監(jiān)控腫瘤細(xì)胞的生長和變化，指導(dǎo)患者的個體化治療。Maheswaran 等[57]發(fā)現(xiàn)接受吉非替尼治療的 NSCLC 患者其 CTCs 存在 EGFR 突變（T790M），而且 CTCs 攜帶的基因信息與腫瘤組織具有高度一致性，因此 CTCs 可以替代腫瘤組織指導(dǎo)靶向治療。HER2 是重要的乳腺癌預(yù)后因素，抗 HER2 靶向治療可顯著延長HER2 高表達乳腺癌患者的生存期，并改善其生活質(zhì)量。但有研究顯示，HER2 受體在乳腺癌患者腫瘤組織和 CTCs中的表達不一致[58]，而目前還缺乏針對腫瘤組織 HER2 陰性而 CTCs HER2 陽性的患者靶向治療療效的臨床研究。

3 展望

近年來，單細(xì)胞全基因組測序技術(shù)的迅速發(fā)展使基于CTCs 基因組和基因表達譜的腫瘤標(biāo)志物檢測成為新的研究熱點，CTCs 檢測也取得了突破性的進展，但仍然面臨諸多挑戰(zhàn)。由于 CTCs 具有異質(zhì)性，現(xiàn)在還沒有發(fā)現(xiàn)任何一種能夠檢測所有 CTCs 的方法，因此亟需進一步研究CTCs 的分子生物學(xué)特征，尋找可進一步提高 CTCs 檢測敏感性、特異性和可重復(fù)性的先進技術(shù)，并統(tǒng)一其檢測標(biāo)準(zhǔn)，以期發(fā)現(xiàn)可指導(dǎo)患者個體化治療的新靶點。綜上所述，CTCs作為非侵襲性診斷標(biāo)志物，在惡性腫瘤的早期轉(zhuǎn)移診斷、分期、預(yù)后評估、療效監(jiān)測以及個體化醫(yī)療方案制定等方面具有重要作用，隨著研究的不斷深入，CTCs 將為腫瘤的診斷和治療提供新策略和新前景。

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10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2017.01.012

國家科技支撐計劃項目（2015BAI12B12）；國家自然科學(xué)基金（81171653）；江蘇省條件建設(shè)與民生科技專項資金（BL2014034）；江蘇省重點研發(fā)計劃基金（BE2015633、BE2015634）

213003 常州，蘇州大學(xué)附屬第三醫(yī)院腫瘤生物診療中心/江蘇省腫瘤免疫治療工程技術(shù)研究中心/蘇州大學(xué)細(xì)胞治療研究院

蔣敬庭，Email：jiangjingting@suda.edu.cn

2016-11-17