pEGFP-NTCP穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞系的建立及鑒定

陳 雅，李 靜，張文政，羅 敏，傅曉鐘，劉 亭

(1. 民族藥與中藥開(kāi)發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心，貴州 貴陽(yáng) 550004；2. 貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550004；3.貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550004；4.國(guó)家苗藥工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽(yáng) 550004)

◇實(shí)驗(yàn)方法學(xué)◇

pEGFP-NTCP穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞系的建立及鑒定

陳 雅1,3,4，李 靜1,3，張文政1,3，羅 敏1,3，傅曉鐘1,3，劉 亭2,3

(1. 民族藥與中藥開(kāi)發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心，貴州 貴陽(yáng) 550004；2. 貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550004；3.貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550004；4.國(guó)家苗藥工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽(yáng) 550004)

目的 高效快速地建立穩(wěn)定高表達(dá)鈉離子-牛磺膽酸共轉(zhuǎn)運(yùn)多肽(sodium taurocholate cotransporting polypeptide，NTCP)的HEK293細(xì)胞系。方法 構(gòu)建可表達(dá)EGFP-NTCP融合蛋白的pEGFP-NTCP重組質(zhì)粒，并利用FuGENE 6轉(zhuǎn)染試劑將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞中。用熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白表達(dá)情況，挑選轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行14 d G418篩選和單克隆培養(yǎng)，以獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。用RT-PCR法、qRT-PCR法和Western blot技術(shù)檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞及正常細(xì)胞中NTCP mRNA和蛋白的表達(dá)情況，并進(jìn)一步用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)考察穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的牛磺膽酸攝取能力。結(jié)果 使用本文優(yōu)化的方法，細(xì)胞轉(zhuǎn)染率可達(dá)90%。RT-PCR、qRT-PCR、Western blot和?；撬釘z取實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：相對(duì)于正常組，在熒光顯微鏡下呈綠色熒光的轉(zhuǎn)染細(xì)胞；其N(xiāo)TCP表達(dá)均顯陽(yáng)性(P<0.01)；且穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的牛磺膽酸攝取能力明顯升高(P<0.05)。結(jié)論 高效快速地建立了穩(wěn)定高表達(dá)NTCP的HEK293細(xì)胞系，為膽酸衍生物攝取機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。

NTCP；EGFP；穩(wěn)定轉(zhuǎn)染；牛磺膽酸；HEK293細(xì)胞；高效快速

膽汁酸在肝臟中合成并儲(chǔ)備在膽囊，在食物的刺激下被腸道吸收，至回腸末端被腸壁吸收后，經(jīng)門(mén)靜脈重新進(jìn)入肝臟，被肝細(xì)胞攝取后再次分泌，進(jìn)行肝腸循環(huán)[1]。研究發(fā)現(xiàn)，在肝腸循環(huán)中肝細(xì)胞對(duì)膽汁酸的攝取具有靶向性。而多數(shù)治療肝病的藥存在肝細(xì)胞富集能力差，對(duì)非靶器官毒性較大等缺點(diǎn)，因此可引入膽汁酸載體片段實(shí)現(xiàn)藥物的肝靶向性富集。研究表明介導(dǎo)血液中的膽汁酸進(jìn)入肝細(xì)胞的關(guān)鍵載體蛋白是位于肝細(xì)胞表面的鈉離子-?；悄懰峁厕D(zhuǎn)運(yùn)多肽(sodium taurocholate cotransporting polypeptide，NTCP)[1]。因此建立穩(wěn)定高表達(dá)NTCP的HEK293細(xì)胞系，可為大規(guī)模篩選基于膽酸結(jié)構(gòu)的具有肝靶向性的新藥提供一個(gè)便利的模型。 在構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的過(guò)程中，常常因?yàn)檗D(zhuǎn)染效率低、表達(dá)不穩(wěn)定等因素，使得整個(gè)工作周期變得冗長(zhǎng)，增加了大量的額外工作。尤其在表達(dá)離子通道蛋白的細(xì)胞系構(gòu)建上，由于離子通道蛋白活性鑒定較為繁復(fù)，通常需要利用到液質(zhì)聯(lián)用等分析儀器，因此要選擇表達(dá)效率最高的轉(zhuǎn)染細(xì)胞尤為耗時(shí)耗力。鑒于此本文擬建立一種高效、方便的穩(wěn)定高表達(dá)NTCP細(xì)胞系構(gòu)建方法，不僅為肝靶向膽酸衍生物的篩選提供一個(gè)便利的工具，也旨在為他人建立穩(wěn)定表達(dá)離子通道細(xì)胞系提供方法學(xué)參考。

1 材料

1.1 細(xì)胞 HEK293細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

1.2 試劑 DMEM培養(yǎng)基(批號(hào)8114031)、胎牛血清(FBS，批號(hào)1227694)、胰蛋白酶(批號(hào)J130049)均購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；質(zhì)粒pEGFP-N1、NTCP DNA購(gòu)于北京博邁德基因技術(shù)有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒(批號(hào)08114KA1)、G418(批號(hào)G8160)、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(批號(hào)20160113)、牛血清白蛋白V(批號(hào)1112M055)、ECL Plus超敏發(fā)光液(批號(hào)20151020)、RIPA(批號(hào)20151020)均購(gòu)于索萊寶公司；限制性內(nèi)切酶EcoR Ι、BamH I(批號(hào)00187254)購(gòu)于美國(guó)Thermo公司；鼠抗β-actin單抗(批號(hào)AB66132)購(gòu)于巴傲得生物科技有限公司；?；悄懰?批號(hào)2015092601)購(gòu)于Regent Sicence Industry Limited公司；RNA提取試劑盒(批號(hào)7020001018)、PVDF膜(批號(hào)K4SA1716L)均購(gòu)于美國(guó)Millipore公司；FuGENE6轉(zhuǎn)染試劑(批號(hào)0000164121)購(gòu)于美國(guó)Promega公司；GAPDH引物上游5′-GGTCCTGGTTCTCATTCCT-3′，引物下游5′-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3′；NTCP引物上游5′-GGTCCTGGTTCTCATTCCT-3′，引物下游5-AGAGTAATATCATGGCAAA-3′，由上海生工公司合成；膜蛋白提取試劑盒(批號(hào)BB150121)購(gòu)于上海貝博生物公司；TRIzol(批號(hào)15596026)購(gòu)于美國(guó)Ambion公司；T4 DNA連接酶(批號(hào)K6901BB)、TransScriptTMOne-Step RT-PCR SuperMix(批號(hào)RR047A)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號(hào)AK5301)均購(gòu)于日本TaKaRa公司；兔抗NTCP多克隆抗體(批號(hào)GR90832-34)、鼠抗EGFP單克隆抗體(批號(hào)GR191827-3)均購(gòu)于美國(guó)Abcam公司；羊抗兔IgG抗體(批號(hào)C2301)、羊抗鼠IgG抗體(批號(hào)C3114)均購(gòu)于上海Santa公司。

1.3 儀器 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Scientific公司)；超凈工作臺(tái)(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司)；數(shù)顯立式壓力蒸汽滅菌器(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療儀器廠)；Allegra 64R 冷凍高速離心機(jī)(美國(guó)Beckman公司)；熒光倒置顯微鏡(日本尼康公司)；Acugity-TDQ型超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(美國(guó)Waters公司)；PowerPac Basic電泳儀、Modle 680酶標(biāo)儀、垂直電泳槽、ChemiDoc XRS+凝膠成像儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 pEGFP-NTCP質(zhì)粒的構(gòu)建 將NTCP基因片段與pEGFP-N1載體分別用EcoR Ⅰ與BamH Ⅰ雙酶切，切膠回收后用T4連接酶切產(chǎn)物。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至TOP10感受態(tài)大腸桿菌中，在0.1%卡拉霉素的LB瓊脂平板上37℃培養(yǎng)12 h后，挑選單克隆至含0.1%卡拉霉素的LB培養(yǎng)基中，200 r·min-1、37℃培養(yǎng)14 h。然后用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。

2.2 pEGFP-NTCP質(zhì)粒的鑒定 將提取的質(zhì)粒EcoR Ⅰ與BamH Ⅰ雙酶切后，挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序鑒定。

2.3 HEK293細(xì)胞的培養(yǎng) 用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液在37℃、5% CO2中靜置培養(yǎng)HEK293細(xì)胞，細(xì)胞達(dá)到80%匯合時(shí)，用胰蛋白酶消化傳代。

2.4 確定G418篩選濃度 取生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期的HEK293細(xì)胞，胰酶消化后計(jì)數(shù)，用完全培養(yǎng)基將細(xì)胞密度調(diào)整為2.4×108·L-1。在6孔板每孔中加入2 mL細(xì)胞懸浮液，于37℃，5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞匯合度達(dá)到80%后，在6孔板中分別加入不同濃度抗生素G418(100、200、400、500、600、700、800 mg·L-1)。每隔2 d換液(含同濃度抗生素的培養(yǎng)液)1次，并觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，選擇5 d后大批量死亡、14 d后全部死亡的最低G418濃度為最佳篩選濃度。

2.5 pEGFP-NTCP穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞系的構(gòu)建

2.5.1 篩選最佳轉(zhuǎn)染條件 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HEK293細(xì)胞，胰酶消化后，用完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為1.0×108、1.5×108、2.0×108、2.4×108·L-1，然后轉(zhuǎn)至96孔板中，每孔加入100 μL，培養(yǎng)24 h。細(xì)胞匯合度分別為50%、60%、70%、80%。按FuGENE6轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)配制轉(zhuǎn)染工作液，使pEGFP-NTCP質(zhì)粒與FuGENE6的比例分別達(dá)到6 ∶1、4 ∶1、3 ∶1、1.5 ∶1，并在不同匯合度的HEK293細(xì)胞中均加入不同比例的轉(zhuǎn)染液。分別孵育24、30、48 h后熒光顯微鏡下觀察。篩選出最佳轉(zhuǎn)染條件。

2.5.2 挑選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞單克隆培養(yǎng)[2-3]取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HEK293細(xì)胞，胰酶消化后，在6孔板中每孔加入2 mL密度為2.4×108·L-1的細(xì)胞懸浮液。培養(yǎng)30 h后，細(xì)胞達(dá)到80%匯合度，按FuGENE6轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)配制pEGFP-NTCP質(zhì)粒與FuGENE6比例為1 ∶3的轉(zhuǎn)染液，將轉(zhuǎn)染液加入到HEK293細(xì)胞中，孵育30 h后熒光顯微鏡下觀察。選取轉(zhuǎn)染效率為90%的細(xì)胞，將原培養(yǎng)液更換濃度為800 mg·L-1的G418的選擇性培養(yǎng)液[5]，每隔2 d更換1次相同選擇性培養(yǎng)液，孵育14 d后，基本得到含G418抗性HEK293細(xì)胞的克隆，挑選單個(gè)細(xì)胞克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，更換800 mg·L-1的G418培養(yǎng)液維持篩選。

2.6 RT-PCR鑒定NTCP mRNA的表達(dá)

2.6.1 RT-PCR測(cè)定穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 HEK293細(xì)胞系中NTCP mRNA水平對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFP-NTCP的HEK293細(xì)胞，利用總RNA提取試劑盒提取細(xì)胞中總RNA，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以0.5 μg cDNA為模板，利用NTCP引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，25 μL擴(kuò)增體系包括：上下游引物各0.5 μL，dNTP 2.0 μL，rTaq 0.2 μL，MgCl21.5 μL，10×buffer 2.5 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，55℃退火1 min，40個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。以GAPDH作為內(nèi)參，擴(kuò)增后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

2.6.2 qRT-PCR測(cè)定 NTCP mRNA水平以0.1 μg mRNA逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，20 μL熒光定量PCR反應(yīng)體系包括：1.0 μL cDNA，上下游引物(10 μmol·L-1)各0.8 μL，SYBR?Premix Ex TaqTMII 10 μL。PCR擴(kuò)增程序同2.5.1。以GAPDH為內(nèi)參，通過(guò)2(-△△Ct)方法分析數(shù)據(jù)。

2.7 Western blot測(cè)定NTCP、EGFP的蛋白表達(dá) 利用膜蛋白提取試劑盒提取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFP-NTCP的HEK293細(xì)胞膜蛋白，用BCA試劑盒測(cè)定蛋白含量。取等量膜蛋白變性進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳結(jié)束后通過(guò)轉(zhuǎn)膜裝置將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜，并將膜在5%的BSA中封閉2 h，分別加入兔抗NTCP多克隆抗體和鼠抗EGFP單克隆抗體4℃孵育14 h后，對(duì)應(yīng)加入二抗羊抗兔IgG抗體和羊抗鼠IgG抗體室溫下孵育2 h。用ECL進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)ChemiDoc XRS+系統(tǒng)成像。

2.8 pEGFP-NTCP穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞系的功能鑒定

2.8.1 考察牛磺膽酸對(duì)HEK293細(xì)胞及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFP-NTCP的HEK293細(xì)胞安全濃度范圍 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HEK293細(xì)胞與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFP-NTCP的HEK293細(xì)胞消化后，調(diào)整細(xì)胞密度為2.4×108·L-1。96孔板中每孔加入100 μL細(xì)胞懸浮液，孵育24 h后，在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFP-NTCP的HEK293細(xì)胞孔中加入濃度分別為：25、50、100、200、400 μmol·L-1的?；悄懰?。放入孵育箱孵育1 h后，吸棄藥液，每孔加入100 μL培養(yǎng)基及5 μL MTS溶液孵育3 h，最后利用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)處吸收值，按以下公式計(jì)算細(xì)胞存活率，考察安全濃度范圍。

2.8.2 HEK293細(xì)胞及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFP-NTCP的HEK293細(xì)胞對(duì)?；悄懰岬臄z取[4-5]參考已有文獻(xiàn)[4]，并稍作調(diào)整。具體步驟如下，取匯合度為90%的HEK293細(xì)胞與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFP-NTCP的HEK293細(xì)胞，胰酶消化，并調(diào)整細(xì)胞密度為2.4×108·L-1，在6孔板中每孔加入2 mL細(xì)胞懸浮液。孵育24 h后分別加入濃度為10、25、50、100、200 μmol·L-1的?；悄懰?，并于培養(yǎng)箱孵育30 min后，用200 μL的RIPA裂解細(xì)胞，通過(guò)BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，裂解液與甲醇的比值按1 ∶6混勻，13 800×g離心20 min，沉淀蛋白，最后通過(guò)UPLC-MS/MS測(cè)定牛磺膽酸的攝取量，計(jì)算正常HEK293細(xì)胞與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFP-NTCP的HEK293細(xì)胞中單位蛋白藥物的攝取量。

2.9 色譜與質(zhì)譜條件 色譜柱Waters Van Guard BEH C 18(2.1 mm×50 mm,1.7 μm)柱，柱溫：45℃，流速：0.35 mL·min-1，進(jìn)樣體積：2.0 μL，流動(dòng)相：A：含0.1%甲酸的乙腈，B：含0.1%甲酸的水，梯度洗脫：5% A(0～1.5 min)，5%～100% A(1.5～4 min)，5% A(4～6 min)。錐孔電壓為：45 V，質(zhì)譜采用選擇離子監(jiān)測(cè)(SIR)，以格列本脲為內(nèi)標(biāo)，用于定量正離子對(duì)(m/z)：515.71。

3 結(jié)果

3.1 pEGFP-NTCP質(zhì)粒的鑒定 瓊脂糖凝膠電泳顯示：pEGFP-NTCP質(zhì)粒的主帶在5.7 kb左右，如Fig 1所示，與理想大小相符合。pEGFP-NTCP質(zhì)粒的EcoR Ⅰ與BamH Ⅰ雙酶切產(chǎn)物亦符合理論大小，如Fig 2所示。將陽(yáng)性克隆送出測(cè)序，結(jié)果與GenBank(L21893.1)報(bào)道的NTCP序列相符，說(shuō)明質(zhì)粒pEGFP-NTCP構(gòu)建成功。

3.2 NTCP穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型的建立與鑒定 質(zhì)粒通過(guò)FuGENE 6轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞后，利用濃度為800 mg·L-1的G418篩選成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，d 5細(xì)胞開(kāi)始大量死亡，d 14后大部分細(xì)胞死亡，如Fig 3所示?；镜玫紾418抗性HEK293細(xì)胞的克隆，挑選單克隆繼續(xù)進(jìn)行篩選擴(kuò)增。

Fig 1 Gel electrophoresis of pEGFP-NTCP recombinant plasmid

M:DNA Marker 5 000； 1:pEGFP-NTCP recombinant plasmid

Fig 2 Identification of recombinant plasmid digested by EcoR Ⅰand BamH Ⅰ

M:DNA Marker 2 000； 1:pEGFP-NTCP recombinant plasmid

3.2.1 熒光顯微鏡鑒定穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 pEGFP-NTCP的HEK293細(xì)胞系在熒光顯微鏡下顯綠色熒光，如Fig 4所示。說(shuō)明穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFP-NTCP的HEK293細(xì)胞表達(dá)含綠色熒光的融合蛋白。

3.2.2 RT-PCR鑒定NTCP轉(zhuǎn)錄的表達(dá) 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，在GAPDH表達(dá)量相同時(shí)，HEK293細(xì)胞組擴(kuò)增不出目的條帶，而pEGFP-NTCP穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞可擴(kuò)增出175 bp的目的片段，如Fig 5所示。qRT-PCR結(jié)果顯示，與正常組相比，pEGFP-NTCP穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞中的NTCP mRNA表達(dá)明顯升高，且差異有顯著性(P<0.01)，如Tab 1所示。說(shuō)明外源性基因已整合到HEK293細(xì)胞中，且能轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)的mRNA。

CellNTCPmRNAStabletransfectedHEK293cells14939.56±1034.98**HEK293cells1.00±0.06

**P<0.01vsHEK293 cells

3.2.3 Western blot鑒定NTCP、EGFP特異性蛋白的表達(dá) 以HEK293細(xì)胞作為陰性對(duì)照，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFP-NTCP的HEK293細(xì)胞的NTCP特異性蛋白表達(dá)呈陽(yáng)性，且EGFP特異性蛋白表達(dá)也同時(shí)呈陽(yáng)性，如Fig 6所示，與RT-PCR結(jié)果相符。說(shuō)明穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFP-NTCP的HEK293細(xì)胞系構(gòu)建成功。

Fig 3 Cell morphology(×100) A:Culture for first day; B:Culture for fifth day;C:Culture for fourteenth day

Fig 4 Cell morphology under fluorescence microscope(×100)

Fig 5 Analysis of NTCP mRNA by RT-PCR

M：DNA Marker 5 000;1：NTCP from RNA of HEK293 cells;2:NTCP from RNA of stable transfected HEK293 cells;3:GAPDH of HEK293 cells;4:GAPDH of stable transfected HEK293 cells

Fig 6 Western blot

1:Stable transfected HEK293 cells; 2：HEK293 cells

3.3 pEGFP-NTCP穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞功能鑒定

3.3.1 牛磺膽酸的細(xì)胞安全濃度范圍 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，受試化合物濃度在400 μmol·L-1以下對(duì)HEK293細(xì)胞及轉(zhuǎn)染pEGFP-NTCP的HEK293細(xì)胞均沒(méi)有毒性作用(P>0.05)，如Tab 2所示。因此研究HEK293細(xì)胞及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFP-NTCP的HEK293細(xì)胞的牛磺膽酸攝取能力時(shí)，可選擇作用時(shí)間1 h之內(nèi)、受試化合物濃度在400 μmol·L-1以下的條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

3.3.2 牛磺膽酸對(duì)HEK293細(xì)胞及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFP-NTCP的HEK293細(xì)胞的攝取 分別給濃度為10、25、50、100、200 μmol·L-1的牛磺膽酸至HEK293細(xì)胞及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFP-NTCP的HEK293細(xì)胞中，測(cè)定牛磺膽酸的攝取量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明pEGFP-NTCP穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞對(duì)?；悄懰岬臄z取從濃度50 μmol·L-1開(kāi)始趨于飽和，且穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFP-NTCP的HEK293細(xì)胞對(duì)?；悄懰岬臄z取明顯高于HEK293細(xì)胞(P<0.05)，如Fig 7所示，說(shuō)明轉(zhuǎn)染pEGFP-NTCP的HEK293細(xì)胞系模型構(gòu)建成功。

Fig 7 Concentration dependence of taurocholate uptake

**P<0.01vscontrol group. Uptake of taurocholate into stable transfected HEK2932(■),Uptake of taurocholate into HEK2932(●)

4 討論

鑒定穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系是否構(gòu)建成功的重要標(biāo)志是外源基因是否表達(dá)以及目的蛋白是否具有活性。本文構(gòu)建了一個(gè)能表達(dá)NTCP載體蛋白和EGFP熒光蛋白的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，為了驗(yàn)證該細(xì)胞是否構(gòu)建成功，本文利用熒光顯微鏡觀察、RT-PCR、qRT-PCR、Western blot和膽酸攝取實(shí)驗(yàn)等方法來(lái)進(jìn)行鑒定。實(shí)驗(yàn)表明，細(xì)胞系在熒光顯微鏡下顯綠色熒光；RT-PCR、qRT-PCR、Western blot表明NTCP和EGFP蛋白在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中得到了表達(dá)；并且膽酸攝取實(shí)驗(yàn)證實(shí)所表達(dá)的NTCP 目的蛋白具有活性。以上實(shí)驗(yàn)說(shuō)明pEGFP-NTCP穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞系構(gòu)建成功。

HEK293細(xì)胞是常用于研究外源基因的細(xì)胞株，具有轉(zhuǎn)染效率高、極少表達(dá)細(xì)胞外配體所需的內(nèi)生受體等特點(diǎn)[6]；FuGENE 6轉(zhuǎn)染試劑是一種非脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，與其它試劑相比具有更高的轉(zhuǎn)染效率、毒性更低等優(yōu)勢(shì)。因此實(shí)驗(yàn)選用HEK293細(xì)胞作為宿主細(xì)胞，F(xiàn)uGENE 6作為轉(zhuǎn)染試劑來(lái)篩選最佳轉(zhuǎn)染條件。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染效率隨細(xì)胞匯合度的增加而增加，且細(xì)胞匯合度達(dá)到80%時(shí)轉(zhuǎn)染效率最佳；當(dāng)FuGENE 6轉(zhuǎn)染試劑與pEGFP-NTCP質(zhì)粒濃度比例在3 ∶1時(shí)轉(zhuǎn)染效率最佳；pEGFP-NTCP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞30 h轉(zhuǎn)染效率達(dá)到最佳，48 h細(xì)胞明顯部分死亡。因此本實(shí)驗(yàn)選用細(xì)胞融合度為80%，F(xiàn)uGENE 6轉(zhuǎn)染試劑與轉(zhuǎn)染質(zhì)粒濃度比例為3 ∶1，轉(zhuǎn)染時(shí)間為30 h進(jìn)行轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)表明，在該條件下，轉(zhuǎn)染效率可達(dá)90%。此外，本文還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)HEK293細(xì)胞形態(tài)縮小且生長(zhǎng)偽足時(shí)，會(huì)降低轉(zhuǎn)染效率。

Tab 2 Toxic effects of taurocholic acid on cells after 1 ±s，n=3)

增強(qiáng)的綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)是綠色熒光蛋白(green fluorescent protein GFP)的突變體[7]，其熒光強(qiáng)度比GFP高6 倍以上，比GFP更適合作為報(bào)告基因監(jiān)測(cè)外源基因表達(dá)[8]。為了提高轉(zhuǎn)染效率，并快速挑選出蛋白表達(dá)效率高的單克隆，本文構(gòu)建了能表達(dá)EGFP-NTCP融合蛋白的pEGFP-NTCP重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)入HEK293細(xì)胞，通過(guò)比較綠色熒光強(qiáng)度來(lái)挑選表達(dá)效率最高的單克隆進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，成功建立穩(wěn)定表達(dá)NTCP的HEK293細(xì)胞系。并且牛磺膽酸的攝取實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞對(duì)?；悄懰岬臄z取量明顯高于正常細(xì)胞，表明EGFP-NTCP融合蛋白具有NTCP特異性介導(dǎo)的運(yùn)輸功能。本文使用的方法解決了構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí)存在的轉(zhuǎn)染效率低、目的蛋白表達(dá)不穩(wěn)定、目的蛋白活性鑒定繁復(fù)等問(wèn)題，提升了構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)NTCP轉(zhuǎn)染細(xì)胞的工作效率。

綜上所述，建立pEGFP-NTCP穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞便于高效快速得到穩(wěn)定高表達(dá)NTCP蛋白的轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，且不影響NTCP特異性介導(dǎo)的運(yùn)輸功能，為膽酸衍生物開(kāi)發(fā)及研究奠定了基礎(chǔ)。

(致謝：感謝傅曉鐘老師與劉亭老師的細(xì)心指導(dǎo)，感謝李靜同學(xué)、羅敏同學(xué)和張文政同學(xué)的熱心幫助。)

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Abstrate:Aim To construct HEK293 cell line with stable and high expression of sodium taurocholate cotransporting polypeptide(NTCP) efficiently and rapidly.Method Vector expressing EGFP-NTCP fusion protein was constructed and verified by DNA sequencing. The pEGFP-NTCP expression vector was transfected into HEK293 cells by FuGENE 6 transfection reagent. The transfected cells with high expression of green fluorescent protein were selected using fluorescence microscope for screening of G418 for 14 days to obtain cell lines stably and highly expressing NTCP. NTCP expression was detected by RT-PCR, qRT-PCR, Western-blot and the uptake experiment of taurocholic acid.Result RT-PCR, qRT-PCR, Western-blot and the uptake experiment revealed that compared to the control cells, the expression of NTCP was significantly positive(P<0.01) in stable trans-fected cells showing green fluorescence(P<0.05).Conclusion The HEK293 cell line with stable and high expression of NTCP has been established efficiently and rapidly, which provides a cellular model for the study of the mechanism of the uptake of bile acid derivatives.

Establishment and identification of HEK293 cell lines with stable and high expression of NTCP

CHEN Ya1,3,4, LI Jing1,3,ZHANG Wen-zheng1,3, LUO Min1,3, FU Xiao-zhong1,3,LIU Ting2,3

(1.EngineeringResearchCenterfortheDevelopmentandApplicationofEthnicMedicineandTCM(MinistryofEducation),Guiyang550004,China; 2.ProvincialKeyLaboratoryforPharmaceuticalPreparations,Guiyang550004,China;3.SchoolofPharmacy,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China;4.NationalEngineeringResearchCenterofMiao′sMedicines,Guiyang550004,China)

NTCP; EGFP; stable transfection; taurocholic acid; HEK293 cells; efficient and fast

時(shí)間：2016-12-5 15:14

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161205.1514.050.html

2016-06-08，

2016-08-22

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81460523)；貴州省優(yōu)秀青年科技人才培養(yǎng)對(duì)象專項(xiàng)基金(No 2013-45號(hào))；貴州省社會(huì)發(fā)展攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(No 2013-3031號(hào))；貴州省中藥現(xiàn)代化科技產(chǎn)業(yè)研究開(kāi)發(fā)專項(xiàng)(No 2013-4001號(hào))；貴州省科學(xué)技術(shù)基金(No 黔科合J字[2014]2018號(hào))

陳 雅(1991-)，女，碩士生，研究方向：藥物化學(xué)及藥理學(xué)，E-mail: 635959626@qq.com； 傅曉鐘(1972-)，男，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：藥物化學(xué)，通訊作者，E-mail: xiaozhong_fu@sina.com； 劉 亭(1981-)，男，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：藥理學(xué)，通訊作者，E-mail: 1586740@qq.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.12.025

A

1001-1978(2016)12-1767-06

R282.74；R322.61；R341；R394.2