CUS致大鼠抑郁行為涉及TPH2、DDC及MAO-A異常表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究

崔 婷，謝 煒，伏蕭燕，李海燕，蔣心惠，邱紅梅

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，重慶市生物化學(xué)與分子藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400016；2.重慶市人民醫(yī)院中山院區(qū)普外科，重慶 400013)

CUS致大鼠抑郁行為涉及TPH2、DDC及MAO-A異常表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究

崔 婷1，謝 煒2，伏蕭燕1，李海燕1，蔣心惠1，邱紅梅1

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，重慶市生物化學(xué)與分子藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400016；2.重慶市人民醫(yī)院中山院區(qū)普外科，重慶 400013)

目的 探討慢性不可預(yù)見刺激(chronically unpredicted stress，CUS)致大鼠抑郁行為與端腦和海馬色氨酸羥化酶2(tryptophan hydroxylase-2，TPH2)、多巴脫羧酶(dopa-decarboxylase，DDC)及單胺氧化酶A(monoamine oxidase-A，MAO-A)mRNA及蛋白表達(dá)的關(guān)系。方法 30只♂ SD大鼠隨機(jī)分為模型組(MG)與對照組(CG)，每組15只。采用孤養(yǎng)結(jié)合CUS連續(xù)刺激28 d建立大鼠抑郁模型；以開場實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)評價大鼠抑郁行為；采用實(shí)時熒光定量PCR與Western blot方法分別檢測大鼠端腦和海馬TPH2、DDC、MAO-A mRNA及蛋白表達(dá)。結(jié)果 與對照組大鼠相比，模型組大鼠開場實(shí)驗(yàn)運(yùn)動得分明顯降低(P<0.01)、強(qiáng)迫游泳不動時間明顯延長(P<0.01)；端腦和海馬TPH2和DDC mRNA及蛋白表達(dá)明顯下降(P<0.01，P<0.05)、MAO-A mRNA及蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.01，P<0.05)。結(jié)論 CUS誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生抑郁癥樣行為，其機(jī)制可能與TPH2、DDC及MAO-A異常表達(dá)有關(guān)。

慢性不可預(yù)見刺激；抑郁癥；色氨酸羥化酶2；多巴脫羧酶；單胺氧化酶A；單胺遞質(zhì)

抑郁癥是一種嚴(yán)重危害人類健康的全球性精神障礙疾病，近年來其發(fā)病率、致殘率和死亡率逐年升高[1]。抑郁癥的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及環(huán)境、遺傳等多方面因素，目前尚未完全闡明。研究顯示[2]，單胺遞質(zhì)系統(tǒng)功能紊亂、免疫及炎癥系統(tǒng)的激活等多種因素均與抑郁癥的發(fā)病密切相關(guān)，其中單胺遞質(zhì)系統(tǒng)功能紊亂，即“單胺學(xué)說”備受關(guān)注。該假說認(rèn)為神經(jīng)突觸間隙的5-羥色胺(serotonin，5-HT)、去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)以及多巴胺(dopamine, DA)水平低下是導(dǎo)致抑郁發(fā)病的重要原因[3]。色氨酸是人體必需氨基酸，是合成單胺遞質(zhì)的重要前體物質(zhì)。色氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TPH)是腦內(nèi)生物合成5-HT的限速酶，催化色氨酸生成5-羥色氨酸，然后經(jīng)多巴脫羧酶脫羧為5-HT。TPH分為TPH1、TPH2兩種亞型，其中TPH2對中樞5-HT的合成具有重要意義。TPH表達(dá)和/或活性降低均可導(dǎo)致5-HT合成不足，誘發(fā)中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂[4]。多巴脫羧酶(dopa-decarboxylase，DDC)又稱色氨酸脫羧酶(tryptophan decarboxylase，AAD)，是L-氨基酸脫羧酶的一種，除了能直接參與合成5-HT外，還可催化L-3，4-二羥基苯丙氨酸(L-DOPA)脫羧合成DA，間接影響NE的生物合成[5]。臨床研究顯示，DDC與多種神經(jīng)精神疾病的發(fā)生密切有關(guān)，如帕金森綜合癥、邊緣型人格障礙、雙相情感障礙、產(chǎn)后抑郁癥等，但尚缺乏系統(tǒng)研究[6-8]。單胺氧化酶(monoamine oxidase，MAO)是催化單胺類神經(jīng)遞質(zhì)代謝的主要酶類之一，臨床研究發(fā)現(xiàn)抑郁癥患者M(jìn)AO-A高表達(dá)、各腦區(qū)MAO-A含量明顯升高[9-10]，提示MAO-A與抑郁癥的發(fā)生密切相關(guān)。

目前，臨床常用的抗抑郁藥主要作用于突觸前膜的單胺遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體如5-HT再攝取抑制劑等，但該類藥物均存在藥物延遲效應(yīng)，且部分患者無明顯療效。端腦作為高級中樞參與了運(yùn)動、認(rèn)知、情緒等調(diào)控，海馬是邊緣系統(tǒng)的重要組成部分，對學(xué)習(xí)、記憶、行為、情緒等發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，兩者均是應(yīng)激反應(yīng)的高位調(diào)節(jié)中樞，與抑郁癥發(fā)生密切相關(guān)。為此，本實(shí)驗(yàn)采用孤養(yǎng)結(jié)合慢性不可預(yù)見刺激(chronically unpredicted stress，CUS)建立大鼠抑郁模型，從大鼠抑郁行為與端腦和海馬TPH2、DDC、MAO-A表達(dá)的變化來研究單胺遞質(zhì)合成和代謝異常與大鼠抑郁行為的關(guān)系，探索藥物作用的新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 動物 清潔級♂ Sprague-Dawley(SD)大鼠30只，180 g～220 g，重慶醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，醫(yī)學(xué)動物許可證號：SYXK(渝)2012-2001。

1.2 試劑與儀器 蛋白定量BCA試劑盒(碧云天公司)；TPH2、DDC、MAO-A抗體(美國Abcam公司)；PCR引物、TIAN-Script cDNA第一鏈合成試劑盒、RNA store保存液、TRIzol總RNA提取劑(寶生物工程大連有限公司)；凝膠成像系統(tǒng)、定量PCR儀、WB垂直電泳儀(美國Bio-Rad公司)；低溫高速離心機(jī)(德國Sigma公司)。

1.3 方法

1.3.1 分組及建模 30只♂ SD大鼠，自由攝食飲水，室溫25 ℃左右，在通風(fēng)良好及正常光照節(jié)律條件下適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，進(jìn)行開場實(shí)驗(yàn)，篩選水平與垂直運(yùn)動的得分之和在30～120分之間的大鼠為合格大鼠，并隨機(jī)分為對照組(control group，CG)和模型組(model group，MG)，每組各15只。CG組5只/籠，自由攝食飲水。參照本實(shí)驗(yàn)室前期報道的建模方法[11]，采用孤養(yǎng)結(jié)合CUS建立實(shí)驗(yàn)性大鼠抑郁模型。刺激方式包括夾尾1 min,禁飲、禁食24 h，水平震蕩10 min，晝夜顛倒，通宵照明，45°傾斜鼠籠24 h,45 ℃熱環(huán)境5 min，閃頻3 h，4 ℃冰水游泳5 min，90分貝噪音3 h，潮濕墊料24 h，共11種刺激，大鼠每日隨機(jī)接受1種刺激，連續(xù)刺激28 d，相同刺激4 d內(nèi)不連續(xù)出現(xiàn)。

1.3.2 開場實(shí)驗(yàn)(open-field test，OFT) 參照文獻(xiàn)[12]并稍作修改，使用100 cm×100 cm×40 cm的木制敞箱，木箱內(nèi)部漆成黑色，底部均為25個20 cm×20 cm的小方格，在昏暗安靜的環(huán)境下，將大鼠置于敞箱底部中央，觀察在5 min內(nèi)大鼠的活動情況，記錄其水平得分(四肢均進(jìn)入方格的穿越格數(shù))與垂直得分(直立次數(shù))，將兩項得分相加即為開場實(shí)驗(yàn)運(yùn)動得分。

1.3.3 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)(forced-swimming test，F(xiàn)ST) 參照文獻(xiàn)[13]并稍作修改，使用高60 cm、直徑20 cm、水深30 cm的透明圓柱形玻璃體，水溫保持在25℃左右。在安靜環(huán)境下，將大鼠放入水中適應(yīng)2 min后，觀察并記錄5 min內(nèi)大鼠的累計不動時間(大鼠在水中保持固定姿勢超過2 s則記錄為不動時間)。

1.3.4 端腦和海馬TPH2、DDC、MAO-A mRNA表達(dá)測定 造模結(jié)束后，每組隨機(jī)取5 只大鼠，用4%水合氯醛麻醉后斷頭取腦，分離海馬和端腦，保存于-80℃。參照Gene Bank 大鼠基因序列合成TPH2、DDC、MAO-A和β-actin引物，引物序列及擴(kuò)增片段見Tab 1。以TRIzol法按試劑盒說明書提取海馬和端腦總RNA；取1 μg總RNA按1 μg/20 μL反應(yīng)體系逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA， PCR 擴(kuò)增分別采用TPH2、DDC、MAO-A和β-actin引物，擴(kuò)增條件： 95 ℃ 30 s解鏈、95 ℃ 5 s變性、60 ℃ 30 s 退火、72 ℃延伸45 s，循環(huán) 40次后，72 ℃充分延伸10 min。反應(yīng)結(jié)果以 Ct值表示，以2-△△Ct計算目的基因的相對表達(dá)量。

Tab 1 Primer sequence and product size of TPH2, DDC, MAO-A

GenePrimersequenceProductsize/bpTPH2Forward:5'-TAAATACTGGGCCAG-GAGAGG-3'100Reverse:5'-GAAGTGTCTTTGCCGCT-TCTC-3'DDCForward:5'-TCCAGTGTACCCTGACGTG-GAG-3'193Reverse:5'-CGCAAGCATAGCTGGGTAG-GA-3'MAO-AForward:5'-GCTCGGGAATTTGCGTATC-3'102Reverse:5'-CCGCCATTGGTAACTGAGAA-3'β-actinForward:5'-CGTAAAGACCTCTATGC-CAACA-3'100Reverse:5'-TAGGAGCCAGGGCAGTAATC-3'

Fig 1 Effect of CUS on rat behaviors

**P<0.01vsCG group

1.3.5 端腦和海馬TPH2、DDC、MAO-A蛋白表達(dá)測定 取凍存的海馬和端腦剪碎、碾磨、加裂解液處理后提取蛋白，采用BCA試劑盒按說明書定量蛋白 濃度。采用Western blot方法檢測端腦和海馬TPH2、DDC及MAO-A 蛋白表達(dá)。每孔上樣量為40 μg，依次進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，分別加入TPH2、DDC、MAO-A一抗4℃孵育過夜、TBST洗膜3次，加入二抗室溫封閉30 min后，TBST洗膜3次，ECL顯色，凝膠成像系統(tǒng)成像，以β-actin為內(nèi)參校正DDC、TPH2和MAO-A的蛋白表達(dá)。

Fig 2 Effect of CUS on TPH2 mRNA and protein expression in rat brain hippocampus (A) and ±s，n=4)*P<0.05,**P<0.01 vs CG group

2 結(jié)果

2.1 CUS對大鼠行為的影響 開場實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組大鼠相比，模型組大鼠開場實(shí)驗(yàn)運(yùn)動得分明顯降低(P<0.01)(Fig 1A)；強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組大鼠相比，模型組大鼠強(qiáng)迫游泳不動時間明顯延長(P<0.01)(Fig 1B)。

2.2 CUS對大鼠端腦和海馬TPH2 mRNA及蛋白表達(dá)的影響 與對照組大鼠相比，模型組大鼠端腦和海馬TPH2 mRNA及蛋白表達(dá)均明顯降低(mRNA表達(dá)：端腦P<0.01，海馬P<0.01；蛋白表達(dá)：端腦P<0.05，海馬P<0.01)(Fig 2)。

2.3 CUS對大鼠端腦和海馬DDC mRNA及蛋白表達(dá)的影響 與對照組大鼠相比，模型組大鼠端腦和海馬DDC mRNA及蛋白表達(dá)均明顯降低(mRNA表達(dá)：端腦P<0.01，海馬P<0.01；蛋白表達(dá)：端腦P<0.05，海馬P<0.05)(Fig 3)。

2.4 CUS對大鼠端腦和海馬MAO-A mRNA及蛋白表達(dá)的影響 與對照組大鼠相比，模型組大鼠端腦和海馬MAO-A mRNA及蛋白表達(dá)均明顯升高(mRNA表達(dá)：端腦P<0.01，海馬P<0.01；蛋白表達(dá)：端腦P<0.05，海馬P<0.05)(Fig 4)。

3 討論

Fig 3 Effect of CUS on DDC mRNA and protein expression in rat brain hippocampus (A) and telencephalon ±s，n=4)*P<0.05,**P<0.01 vs CG group

抑郁癥是一種臨床常見的心境障礙性疾病，近年來因其高患病率和自殺率備受關(guān)注。CUS抑郁模型模擬社會環(huán)境中多變的外源性刺激，誘導(dǎo)大鼠抑郁癥的發(fā)生，是國內(nèi)外進(jìn)行抑郁癥發(fā)病機(jī)制研究的經(jīng)典的、廣泛認(rèn)可的動物模型之一。OFT通過觀察大鼠在新異環(huán)境中探究行為的改變評價其焦慮抑郁狀態(tài)，F(xiàn)ST通過觀察大鼠在狹小環(huán)境中不動時間的變化評價其絕望抑郁狀態(tài)，兩者均是評估大鼠抑郁行為的經(jīng)典方法[14]。本研究以CUS建立大鼠抑郁模型，采用OFT和FST評價大鼠抑郁行為。結(jié)果顯示，與對照組大鼠相比，模型組大鼠開場實(shí)驗(yàn)探究行為明顯減少，運(yùn)動得分明顯降低，強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)不動時間明顯延長，提示CUS成功誘導(dǎo)大鼠抑郁行為的產(chǎn)生。

腦內(nèi)單胺遞質(zhì)系統(tǒng)功能紊亂是比較公認(rèn)的抑郁癥發(fā)病的生化機(jī)制之一。突觸間隙的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)如5-HT、NE、DA水平低下、單胺類神經(jīng)遞質(zhì)受體及轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)和/或功能異常等都可能參與抑郁癥的發(fā)生發(fā)展[15]。5-HT是中樞重要的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)之一，調(diào)節(jié)多種腦功能如情感、睡眠、學(xué)習(xí)、記憶、攝食等。近年來，新的“5-HT學(xué)說”指出，5-羥色胺能神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)功能不足是抑郁癥發(fā)生的關(guān)鍵因素，也是目前臨床藥物治療的靶系統(tǒng)之一[16]。選擇性5-HT轉(zhuǎn)運(yùn)體再攝取抑制劑是臨床常用的一類抗抑郁藥物，其通過阻斷5-HT轉(zhuǎn)運(yùn)體、提高突觸間隙的5-HT水平發(fā)揮抗抑郁作用，但此類藥物存在明顯的延遲效應(yīng)。因此，進(jìn)一步研究5-HT通路具有十分重要的意義。5-HT的合成和代謝直接影響腦內(nèi)5-HT遞質(zhì)水平。TPH是催化色氨酸合成5-HT的限速酶，其中TPH2是腦內(nèi)合成5-HT的關(guān)鍵亞型。臨床研究發(fā)現(xiàn)TPH2基因多態(tài)性與抑郁癥發(fā)生密切相關(guān)[17-18]，基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)TPH2基因敲除小鼠出現(xiàn)明顯的皮層和海馬5-HT水平降低及抑郁行 為[19]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠端腦和海馬TPH2 mRNA及蛋白表達(dá)下降與抑郁行為的發(fā)生密切相關(guān)，提示TPH2異常表達(dá)參與了抑郁癥的發(fā)生。

Fig 4 Effect of CUS on MAO-A mRNA and protein expression in rat brain hippocampus(A) and telencephalon(B)±s，n=4)*P<0.05,**P<0.01 vs CG group

DDC是一種L-氨基酸脫羧酶，可催化5-羥色氨酸轉(zhuǎn)化為5-HT，同時可催化左旋多巴脫羧為DA，DA還可經(jīng)多巴胺β羥化酶作用轉(zhuǎn)化為NE，繼而間接影響NE的生物合成。大量研究已證明5-HT、DA、NE作為腦內(nèi)重要的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，均與抑郁癥的發(fā)生密切相關(guān)。因此，DDC功能異?？赏ㄟ^影響腦內(nèi)5-HT、DA及NE等單胺類遞質(zhì)水平，參與抑郁癥的發(fā)生。臨床研究顯示，DDC參與了情感障礙性疾病的發(fā)生，其基因多態(tài)性與產(chǎn)后焦慮、抑郁行為密切相關(guān)[7-8]。目前，對DDC的研究主要集中在腫瘤、帕金森病、阿爾茨海默病等方面，而與抑郁癥的關(guān)系尚缺乏系統(tǒng)研究。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠端腦和海馬DDC mRNA及蛋白表達(dá)均較對照組大鼠明顯降低，提示DDC表達(dá)下降參與了大鼠抑郁癥的發(fā)生。 5-HT、DA等單胺類遞質(zhì)降解增多也是抑郁癥發(fā)生的重要原因之一。MAO是腦內(nèi)代謝單胺類遞質(zhì)的主要酶類之一，有MAO-A和MAO-B兩種亞型。MAO可催化代謝多種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)包括5-HT、DA、NE，最終產(chǎn)生醛類物質(zhì)和過氧化氫。MAO-A高表達(dá)及其胺類代謝產(chǎn)物均與神經(jīng)精神疾病的發(fā)生密切相關(guān)。臨床研究顯示，MAO-A基因多態(tài)性與抑郁癥發(fā)生密切相關(guān)[20]。正電子發(fā)射斷層成像技術(shù)檢測顯示，抑郁癥患者各腦區(qū)MAO-A含量均明顯升高[10]。MAO-A高表達(dá)與女性雙相情感障礙和重度抑郁癥的發(fā)生有明顯相關(guān)性[11]，而MAO抑制劑可有效改善抑郁狀態(tài)。上述研究均提示MAO功能異常與抑郁癥發(fā)病相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠端腦和海馬MAO-A mRNA及蛋白表達(dá)與對照組相比明顯升高，提示MAO-A可能通過加速單胺類遞質(zhì)代謝、協(xié)同降低遞質(zhì)水平誘導(dǎo)大鼠抑郁癥的發(fā)生。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示單胺遞質(zhì)合成酶TPH2、DDC表達(dá)降低，代謝酶MAO-A表達(dá)升高與大鼠抑郁癥的發(fā)生具有相關(guān)性，提示抑郁癥發(fā)生可能與腦內(nèi)單胺遞質(zhì)合成不足而代謝增多，最終發(fā)生遞質(zhì)耗竭密切相關(guān)。

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Experimental study on abnormal expression of TPH2,DDC and MAO-A involved in depression-like behaviors of rats induced by CUS

CUI Ting1, XIE Wei2, FU Xiao-yan1, LI Hai-yan1, JIANG Xin-hui1, QIU Hong-mei1

(1.DeptofPharmacology,ChongqingMedicalUniversity,DeptofBiochemistryandMolecularPharmacology,Chongqing400016,China；2.DeptofGeneralSurgery,People′sHospitalofChongqing,Chongqing, 400013,China)

Aim To investigate the role of tryptophan hydroxylase-2 (TPH2), dopa-decarboxylase (DDC) and monoamine oxidase-A(MAO-A) in depression-like behaviors induced by chronic unpredictable stress(CUS).Methods 30 male SD rats were randomly divided into model group(MG) and control group(CG). Rat depression model was developed by CUS for 28 consecutive days in a solitary condition. The depression-like behaviors of rats were evaluated by open-field test(OFT) and forced-swimming test(FST). The real time PCR and Western blot test were used to determine the mRNA and protein expression of TPH2,DDC and MAO-A in rat telencephalon and hippocampus. Results The movement scores of rats were obviously decreased in OFT(P<0.01). The immobility time was obviously increased in FST(P<0.01). The mRNA and protein expressions of TPH2 and DDC were decreased significantly(P<0.01,P<0.05) and the MAO-A mRNA and protein expressions were increased significantly(P<0.01,P<0.05) in telencephalon and hippocampus of MG rats, when compared with those in CG rats.Conclusion The TPH2, DDC and MAO-A in rat telencephalon and hippocampus were closely related with the depression-like behaviors of rats induced by CUS.

CUS; depression; TPH2; DDC; MAO-A; monoamine neurotransmitter

時間：2016-12-5 15:14

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161205.1514.018.html

2016-07-15，

2016-08-13

國家自然科學(xué)基金資助項目(No 31400881)；重慶市教委科學(xué)技術(shù)項目(No KJ1400208)

崔 婷(1992-)，女，碩士，研究方向：神經(jīng)精神藥理學(xué)，E-mail：1129244017@qq.com; 邱紅梅(1978-)，女，博士，副教授，研究方向：神經(jīng)精神藥理學(xué)，通訊作者，E-mail：qiuhongmei@cqmu.edu.cn

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.12.009

A

1001-1978(2016)12-1677-07

R-332；R322.81；R749.42；R977.3；R977.6