銀杏二萜內(nèi)酯對(duì)缺血/再灌注大鼠腦組織中神經(jīng)遞質(zhì)的影響

張 雯，宋俊科，何國(guó)榮，張 雪，周啟蒙，王振中，蕭 偉，肖智勇，周文霞，杜冠華

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所，北京市藥物靶點(diǎn)研究與新藥篩選重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050；2.中藥制藥過(guò)程新技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇 連云港 222001；3.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所，抗毒藥物與毒理學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100850)

◇論 著◇

銀杏二萜內(nèi)酯對(duì)缺血/再灌注大鼠腦組織中神經(jīng)遞質(zhì)的影響

張 雯1，宋俊科1，何國(guó)榮1，張 雪1，周啟蒙1，王振中2，蕭 偉2，肖智勇3，周文霞3，杜冠華1

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所，北京市藥物靶點(diǎn)研究與新藥篩選重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050；2.中藥制藥過(guò)程新技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇 連云港 222001；3.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所，抗毒藥物與毒理學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100850)

目的 探討銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液對(duì)缺血/再灌注大鼠腦內(nèi)氨基酸類和單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的影響。方法 采用線栓法制備大鼠腦缺血/再灌注模型，缺血1.5 h，再灌注24 h，尾靜脈給予不同劑量銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液后，用高效液相色譜串聯(lián)電化學(xué)檢測(cè)器(HPLC-ECD)測(cè)定腦內(nèi)氨基酸類和單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量。結(jié)果 銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液可以抑制缺血/再灌注導(dǎo)致的腦內(nèi)天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸和γ-氨基丁酸的升高；降低缺血腦區(qū)皮層和海馬內(nèi)去甲腎上腺素、二羥苯乙酸、5-羥色胺、5-羥吲哚乙酸的濃度，抑制皮層內(nèi)腎上腺素的減少。結(jié)論 銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液可以通過(guò)調(diào)節(jié)腦內(nèi)氨基酸類和單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的水平，對(duì)大鼠腦缺血/再灌注引起的損傷發(fā)揮治療作用。

銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液；腦缺血/再灌注；氨基酸類遞質(zhì)；單胺類遞質(zhì)；HPLC-ECD；代謝組學(xué)

腦血管疾病是我國(guó)中老年人死亡的頭號(hào)殺手，在腦血管疾病中，急性缺血性疾病的發(fā)病率居于首位，嚴(yán)重威脅著人類健康。神經(jīng)遞質(zhì)包括氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)和單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，是維持中樞神經(jīng)功能的重要物質(zhì)[1-2]。中樞神經(jīng)遞質(zhì)的含量和比例決定了中樞神經(jīng)功能，在腦缺血過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)廣泛存在于大腦各個(gè)區(qū)域，興奮性氨基酸(EAA)和抑制性氨基酸(IAA)在腦內(nèi)維持興奮-抑制平衡，對(duì)認(rèn)知、運(yùn)動(dòng)等功能具有重要的調(diào)節(jié)作用。腦缺血狀態(tài)下，興奮與抑制性氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的平衡被破壞[3-5]，影響中樞神經(jīng)功能；單胺類神經(jīng)遞質(zhì)也發(fā)生明顯變化，并能夠通過(guò)促進(jìn)自由基產(chǎn)生、促進(jìn)EAA釋放和細(xì)胞內(nèi)鈣超載等多種途徑，引發(fā)一系列病理生理效應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或壞死，成為影響腦缺血/再灌注(CIR)損傷的重要因素[6-7]。因此，調(diào)節(jié)氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的平衡和單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的釋放是防治CIR的重要途徑。

銀杏葉的治療作用在我國(guó)古代醫(yī)書中早有記載，現(xiàn)代研究證明，銀杏提取物具有抑制血小板聚集、抗過(guò)敏、抗炎、抗休克，以及保護(hù)心腦血管、促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶、防治老年癡呆等作用。銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液(DGMI)主要成分為銀杏內(nèi)酯A(35%)、銀杏內(nèi)酯B(60%)、銀杏內(nèi)酯C(2%)、銀杏內(nèi)酯K(2%)等，輔料為葡甲胺、檸檬酸、氯化鈉，臨床用于腦梗死的治療[8]。DGMI對(duì)神經(jīng)元保護(hù)作用[9]及其防治腦血管疾病的研究雖已有報(bào)道[10-12]，但確切機(jī)制以及該藥對(duì)CIR腦組織中神經(jīng)遞質(zhì)的影響尚需進(jìn)一步研究。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液(簡(jiǎn)稱銀杏二萜內(nèi)酯，縮寫為DGMI)，江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品；金納多(EGb761)，購(gòu)自臺(tái)灣濟(jì)生化學(xué)制藥廠股份有限公司；多巴胺(DA)、二羥苯乙酸(DOPAC)、5-羥色胺(5-HT)、5-羥吲哚乙酸(5-HIAA)、去甲腎上腺素(NE)、腎上腺素(E)、異丙腎上腺素(IP)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)、甘氨酸(Gly)、?；撬?Tau)、γ-氨基丁酸(GABA)、絲氨酸(Ser)、辛烷磺酸鈉(OSA)均購(gòu)自Sigma-Aldrich。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 HR-120電子天平，日本AND公司；BeckMan Allegra X-22R冷凍離心機(jī)，美國(guó)Beckman公司；HPLC-ECD 5300高效液相色譜庫(kù)侖電化學(xué)分析系統(tǒng)，美國(guó)ESA公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)♂ SD大鼠，體質(zhì)量240 g～260 g，購(gòu)自北京維通利華動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)：SCXK(京)2014-0001。

1.4 動(dòng)物模型建立 采用線栓法制備大腦中動(dòng)脈閉塞/再灌注(MCAO/R)模型。380 mg·kg-110%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，仰臥位固定，頸正中線切口，鈍性分離，沿胸鎖乳突肌內(nèi)緣分離肌肉和筋膜，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)、頸外動(dòng)脈(ECA)和頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)。用1號(hào)縫合線勒緊CCA近心端及ICA，結(jié)扎ECA遠(yuǎn)心端，并于ECA下埋線用于固定線栓，ECA上剪出斜行切口，插入線栓，進(jìn)入18 mm左右，固定線栓。缺血1.5 h后，拔出線栓，實(shí)現(xiàn)再灌注，同時(shí)尾靜脈注射給藥。銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液：低劑量(1 mg·kg-1)、中劑量(3 mg·kg-1)、高劑量(10 mg·kg-1)；陽(yáng)性對(duì)照組金納多：5 mg·kg-1。逐層縫合傷口，大鼠歸籠飼養(yǎng)。

1.5 藥效學(xué)評(píng)價(jià) 再灌注24 h，處死動(dòng)物前采用Bederson’s標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分。斷頭處死大鼠，迅速取出腦組織凍于-20℃冰箱20 min，然后進(jìn)行冠狀切片，將腦切片置于0.5% TTC溶液中，于37℃避光孵育20 min，之后置于4%多聚甲醛溶液中固定。拍照，采用Image J圖像分析軟件計(jì)算腦組織梗死體積。另取大鼠斷頭處死后取腦，稱濕重，然后將腦組織置于100℃恒溫干燥箱中，烘干24 h至恒重，稱重即為干重，按下式計(jì)算水腫百分比：水腫百分比/%=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.6 氨基酸類遞質(zhì)含量檢測(cè)

1.6.1 溶液配制 0.1 mol·L-1四硼酸鈉(Na2B4O7·10H2O)溶液，調(diào)節(jié)pH至9.3；OPA/β-Me貯存液的配制：稱取鄰苯二甲醛(OPA)27 mg，溶于1 mL甲醇中，再加入5 μL β-巰基乙醇(β-Me)及9 mL 0.1 mol·L-1四硼酸鈉，貯于棕色瓶中。用時(shí)1 mL貯存液加3 mL 0.1 mol·L-1四硼酸鈉稀釋即可；標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液的配制：稱取各標(biāo)準(zhǔn)品適量，溶于1 mL雙蒸水：甲醇=1 ∶1(V∶V)溶液中貯存；內(nèi)標(biāo)液的配制：0.05 mol·L-1高氯酸，含Ser 40 μg·mL-1。

1.6.2 色譜條件 流動(dòng)相：0.1 mol·L-1Na2HPO4水溶液含0.13 mmol·L-1EDTA.Na2和28%甲醇，用濃磷酸調(diào)pH至6.00，0.22 μm微孔濾膜抽濾脫氣；固定相：Column MD-150，3 μm填充不銹鋼柱。工作電壓400 mV，柱溫40℃，流速0.6 mL·min-1。

1.6.3 氨基酸類遞質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線 分別配制Asp、Glu、Gln、Gly、Tau、GABA系列濃度標(biāo)準(zhǔn)品，以Ser為內(nèi)標(biāo)，在相應(yīng)色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，分別以Asp、Glu、Gln、Gly、Tau、GABA峰面積與Ser的比值對(duì)Ser濃度作線性回歸，考察其線性情況。

1.6.4 動(dòng)物取材 大鼠行為學(xué)檢測(cè)結(jié)束后，頸椎脫臼處死，迅速取全腦冰上分離皮層、海馬，存于液氮備用。

1.6.5 樣品的處理 取腦組織精確稱重，每100 mg加入200 μL的0.2 mol·L-1高氯酸，超聲粉碎60 s，4℃ 12 000 r·min-1離心30 min取上清液，即為樣品溶液。

1.6.6 衍生化反應(yīng) 20 μL標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣品溶液加入20 μL內(nèi)標(biāo)液，混勻后取20 μL加入40 μL衍生化工作液(OPA/β-Me工作液)，冰上反應(yīng)2 min，取30 μL進(jìn)樣，用于檢測(cè)。

1.7 單胺類遞質(zhì)含量檢測(cè)

1.7.1 溶液配制 稱取DA、DOPAC、5-HT、5-HIAA、NE、E6種待檢測(cè)遞質(zhì)，溶解于0.05 mol·L-1的高氯酸中，得終濃度為0.2 g·L-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液；配制0.02 mol·L-1高氯酸(含IP 1.0 μmol·L-1, EDTA 0.5 mmol·L-1)作為勻漿液。

1.7.2 色譜條件 流動(dòng)相：0.1 mol·L-1NaH2PO4水溶液含0.85 mmol·L-1OSA、0.5 mmol·L-1EDTA.Na2和11%甲醇，用濃磷酸調(diào)pH至3.25，0.22 μm微孔濾膜抽濾脫氣；固定相：Column MD-150，3 μm填充不銹鋼柱。工作電壓400 mV，柱溫35℃，流速0.6 mL·min-1，進(jìn)樣量30 μL。

1.7.3 單胺類遞質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線 分別配制DA、DOPAC、5-HT、5-HIAA、NE、E濃度為2 500、1 000、500、250、100、50、25、10 ng·g-1的系列標(biāo)準(zhǔn)品，以IP為內(nèi)標(biāo)，在相應(yīng)色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，分別以DA、DOPAC、5-HT、5-HIAA、NE、E峰面積與IP的比值對(duì)IP濃度作線性回歸，考察其線性情況。

1.7.4 動(dòng)物取材 方法同“1.6.4”。

1.7.5 樣品的處理 取凍存組織，每100 mg加入200 μL預(yù)冷勻漿緩沖液，超聲40 s，4℃ 12 000 r·min-1離心30 min，取上清液30 μL進(jìn)樣，進(jìn)行檢測(cè)。

Fig 1 DGMI protects against MACO/R induced brain injury in rats

2 結(jié)果

2.1 DGMI對(duì)MCAO/R大鼠腦損傷的治療作用 大鼠腦缺血1.5 h，再灌注24 h，缺血側(cè)半球出現(xiàn)大面積梗死(梗死體積達(dá)28%)。DGMI中高劑量組和5 mg·kg-1EGb761均可減小腦梗死體積，與模型組相比，分別降低22%、32%和25%(Fig 1A 和Fig 1B)；DGMI可以劑量依賴的減輕MCAO/R引起的腦水腫，與模型組比較，3個(gè)劑量組的水腫程度分別降低9%、10%和12%，5 mg·kg-1EGb761可降低腦水腫11%(Fig 1C)；高劑量DGMI和5 mg·kg-1EGb761治療組能夠明顯降低MCAO/R引起的大鼠神經(jīng)行為學(xué)缺損評(píng)分(Fig 1D)。

2.2 DGMI對(duì)MCAO/R大鼠腦組織內(nèi)氨基酸類遞質(zhì)含量的影響

2.2.1 氨基酸類遞質(zhì)專屬性考察 如Fig 2所示，在實(shí)驗(yàn)所采用的HPLC條件下，Asp、Glu、Gln、Gly、Tau、GABA與Ser保留時(shí)間分別為1.8、3.0、5.4、8.9、14.8、22.6和4.7 min，各組分間可以完全分離，并且腦組織中內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)測(cè)定沒(méi)有干擾。

Fig 2 Chromatographic peak of Asp,Glu,Gln,Gly,Tau,GABA and Ser

2.2.2 HPLC法測(cè)定氨基酸類遞質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線 如Tab 1所示，Asp、Glu、Gln、Gly、Tau、GABA在25～1 000 μg·g-1范圍內(nèi)擬合校正曲線(權(quán)重：1/X)相關(guān)系數(shù)(r2)大于0.99。

Tab 1 Calibration curve of Asp, Glu,Gln,Gly,Tau,GABA in rat brain

2.2.3 DGMI對(duì)MCAO/R大鼠腦組織內(nèi)興奮性氨基酸類遞質(zhì)的影響 如Fig 3所示，與正常對(duì)照組相比，模型組缺血側(cè)皮層和海馬興奮性氨基酸類遞質(zhì)Asp、Glu、Gln的含量都明顯升高；與模型組相比，DGMI中、高劑量組可以明顯降低皮層和海馬中Glu的含量(Fig 3B)，高劑量組可以明顯降低皮層和海馬中Gln的含量(Fig 3C)，但對(duì)于Asp含量卻無(wú)明顯影響(Fig 3A)。2.2.4 DGMI對(duì)MCAO/R大鼠腦組織內(nèi)抑制性氨基酸類遞質(zhì)的影響 如Fig 4所示，與正常對(duì)照組相比，模型組缺血側(cè)皮層和海馬抑制性氨基酸GABA和皮層中的Gly含量有所上升，皮層和海馬內(nèi)的Tau以及海馬中的Gly沒(méi)有明顯變化；與模型組相比，DGMI各劑量均可明顯降低皮層中Gly的含量，中、高劑量的DGMI可以降低GABA的含量，但對(duì)于其他氨基酸含量無(wú)明顯影響。

2.2.5 腦組織中氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)變化特征 對(duì)各組大鼠腦組織皮層和海馬中氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)進(jìn)行PCA分析，依據(jù)兩個(gè)主成分采用SIMCA-P做出平面圖，直觀表現(xiàn)原始數(shù)據(jù)代表的樣本狀態(tài)[13-16]。PCA分析得到的圖譜如Fig 5所示，皮層(Fig 5A)和海馬(Fig 5B)中每一個(gè)樣本在PCA圖上的位置由氨基酸含量的定量數(shù)值決定。正常對(duì)照組、MCAO/R組以及DGMI治療組各自出現(xiàn)在PCA圖譜的相近位置，由此表示各組內(nèi)樣本含有的氨基酸濃度相近，具有相似生理狀態(tài)。從圖中可以看出，MCAO/R組樣品點(diǎn)遠(yuǎn)離正常對(duì)照組，說(shuō)明MCAO/R引起了皮層和海馬中氨基酸含量變化。與MCAO/R組相比，DGMI治療組降低了與正常對(duì)照組樣品點(diǎn)的離散程度，樣品點(diǎn)不同程度向正常對(duì)照組聚集。

Fig 3 Effects of DGMI treatment on levels of Asp (A); Glu (B) and Gln (C) in cortex and hippocampus after 1.5 h of MCAO followed by 24 h reperfusion

Fig 4 Effects of DGMI treatment on levels of Gly (A); Tau (B) and GABA(C) in cortex and hippocampus after 1.5 h of MCAO followed by 24 h reperfusion

Fig 5 PCA for effects of DGMI on levels of amino acid neurotransmitters in cortex (A) and hippocampus (B) after 1.5 h of MCAO followed by 24 h reperfusion

2.3 DGMI對(duì)MACO/R大鼠腦組織單胺類遞質(zhì)含量的影響

2.3.1 單胺類遞質(zhì)專屬性考察 如Fig 6所示，在實(shí)驗(yàn)所采用的HPLC條件下，NE、E、DOPAC、DA、5-HIAA、5-HT與IP保留時(shí)間分別為1.8、2.4、4.1、5.3、7.2、14.6、和8.9 min，各組分之間可以完全分離，并且腦組織中內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)測(cè)定沒(méi)有干擾。

2.3.2 HPLC法測(cè)定單胺類遞質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線 如Tab 2所示，NE、E、DOPAC、DA、5-HIAA、5-HT在10～2 500 ng·g-1范圍內(nèi)擬合校正曲線(權(quán)重：1/X)相關(guān)系數(shù)(r2)大于0.99。

2.3.3 DGMI對(duì)MCAO/R大鼠腦組織內(nèi)多巴胺類遞質(zhì)含量的影響 如Fig 7所示，結(jié)果表明，與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠受損腦區(qū)皮層中DA水平有所降低；而海馬中DA水平略有升高。與模型組相比，DGMI治療后，能夠升高缺血側(cè)大腦皮層DA水平(Fig 7A)。腦缺血1.5 h再灌注24 h，缺血側(cè)皮層和海馬DOPAC含量均明顯升高，與模型組相比，DGMI各劑量組都能夠降低DOPAC含量(Fig 7B)。另外，對(duì)各組大鼠皮層、海馬中的DOPAC/DA的值進(jìn)行了計(jì)算和比較。結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，模型組DOPAC/DA水平明顯升高；與模型組相比，DGMI高劑量治療組可以降低海馬中DOPAC/DA水平(Fig 7C)。

Tab 2 Calibration curve of NE,E,DOPAC, DA,5-HIAA,5-HT in rat brain

Fig 6 Chromatographic peak of NE,E,DOPAC,DA,5-HIAA,5-HT and IP

Fig 7 Effects of DGMI treatment on levels of DA (A); DOPAC (B) and DOPAC/DA (C) in cortex and hippocampus after 1.5 h of MCAO followed by 24 h reperfusion

Fig 8 Effects of DGMI treatment on levels of 5-HIAA (A); 5-HT (B) and 5-HIAA/5-HT (C) in cortex and hippocampus after 1.5 h of MCAO followed by 24 h reperfusion

2.3.4 DGMI對(duì)MCAO/R大鼠腦組織內(nèi)5-HT類遞質(zhì)含量的影響 如Fig 8所示，與正常對(duì)照組相比，模型組缺血側(cè)皮層和海馬5-HIAA含量均明顯升高；與模型組相比，DGMI高劑量組能夠降低5-HIAA含量(Fig 8A)。腦缺血1.5 h再灌注24 h，缺血側(cè)皮層和海馬5-HT含量均明顯升高，與模型組相比，DGMI中、高劑量組都能夠明顯降低5-HT含量(Fig 8B)。同時(shí)，對(duì)各組大鼠皮層、海馬中的5-HIAA/5-HT的值進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，模型組海馬中5-HIAA/5-HT水平明顯升高；與模型組相比，DGMI治療組對(duì)5-HIAA/5-HT水平?jīng)]有明顯影響(Fig 8C)。

2.3.5 DGMI對(duì)MCAO/R大鼠腦組織去甲腎上腺素與腎上腺素含量影響 如Fig 9所示，與正常對(duì)照組相比，模型組缺血側(cè)皮層、海馬NE和E的含量均明顯升高，而與模型組相比，DGMI高劑量組，能夠降低NE含量。與模型組相比，DGMI治療組缺血側(cè)皮層和海馬中E的水平均沒(méi)有明顯變化。

2.3.6 腦組織中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)PCA分析 對(duì)各組大鼠腦組織皮層和海馬中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)進(jìn)行PCA分析，由兩個(gè)主成分采用SIMCA-P做出平面圖。如Fig 10所示，正常對(duì)照組、MCAO/R組以及DGMI治療組各自出現(xiàn)在PCA圖譜的相近位置，由此表示各組內(nèi)樣本含有的單胺類遞質(zhì)濃度相近，具有相似生理狀態(tài)。MCAO/R組遠(yuǎn)離正常對(duì)照組樣品點(diǎn)，說(shuō)明MCAO/R引起皮層(Fig 10A)和海馬(Fig 10B)中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量變化。DGMI治療組能夠不同程度降低樣品點(diǎn)離散程度，向正常對(duì)照組聚集。

3 討論

腦缺血/再灌注可以導(dǎo)致一系列繼發(fā)性病理、生理變化，其中腦內(nèi)興奮與抑制性氨基酸遞質(zhì)濃度失衡是造成腦組織損傷的重要因素之一[1]。興奮性氨基酸(EAA)是廣泛存在于哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，參與突觸興奮傳遞、學(xué)習(xí)記憶形成[17]。由于缺血/缺氧，神經(jīng)元去極化，釋放大量EAA。EAA毒性作用對(duì)腦組織的損傷主要表 現(xiàn)為：過(guò)多的EAA引起突觸后神經(jīng)元去極化，大量K+外流，Na+內(nèi)流，Cl-及H2O被動(dòng)內(nèi)流引起以神經(jīng)元滲透性水腫為主的急性損傷，誘導(dǎo)細(xì)胞壞死和凋亡；通過(guò)刺激EAA受體，啟動(dòng)Ca2+通道，Ca2+大量?jī)?nèi)流，激活一系列依賴于Ca2+的酶系統(tǒng)，造成遲發(fā)性神經(jīng)元變性壞死[18-19]。

Fig 9 Effects of DGMI treatment on levels of NE (A); and E (B) in cortex and hippocampus after 1.5 h of MCAO followed by 24 h reperfusion

Fig 10 PCA for effects of DGMI on levels of monoamine neurotransmitters in cortex (A) and hippocampus (B) after 1.5 h of MCAO followed by 24 h reperfusion

作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的IAA，GABA是三羧酸循環(huán)中Glu在谷氨酸脫羧酶誘導(dǎo)生成的產(chǎn)物，GABA可通過(guò)突觸后膜超極化、減少離子內(nèi)流、降低細(xì)胞代謝及氧消耗，使突觸后神經(jīng)元處于保護(hù)性抑制狀態(tài)，抑制神經(jīng)元興奮，減輕細(xì)胞損傷；并通過(guò)突觸前抑制減少Glu的釋放，減輕EAA毒性作用[20-21]。

MCAO/R損傷后，EAA局部濃度升高，Na+、Cl-和水大量流入細(xì)胞內(nèi)，造成神經(jīng)元的急性腫脹，產(chǎn)生興奮性毒性[22]。同時(shí)MCAO/R引起的能量缺乏，導(dǎo)致神經(jīng)和膠質(zhì)細(xì)胞攝取功能下降，造成細(xì)胞外EAA濃度升高；鈣離子超載，自由基及腺苷酸含量升高將進(jìn)一步刺激Glu和Asp濃度升高，使細(xì)胞外堆積大量的EAA。同時(shí)為了達(dá)到機(jī)體內(nèi)興奮—抑制平衡，IAA水平升高[23-24]。DGMI可以調(diào)節(jié)MCAO/R大鼠腦組織內(nèi)EAA和IAA的水平，降低EAA含量以減少EAA對(duì)神經(jīng)元產(chǎn)生的興奮性毒性，降低IAA水平以恢復(fù)腦組織中興奮—抑制平衡?？偟膩?lái)說(shuō)，DGMI可以調(diào)節(jié)MCAO/R大鼠腦內(nèi)EAA、IAA水平，使腦組織中異常升高的EAA和IAA趨向于恢復(fù)正常，抑制MCAO/R造成的神經(jīng)元壞死，改善腦組織損傷。

1974年Wrutman等根據(jù)臨床和實(shí)驗(yàn)資料提出缺血性腦損傷的單胺類遞質(zhì)假說(shuō)，認(rèn)為單胺類遞質(zhì)的過(guò)度釋放是腦缺血后腦血管痙攣、血流障礙的主要原因。同時(shí)單胺類遞質(zhì)釋放增加又可加速組織脂質(zhì)過(guò)氧化，促使線粒體氧化磷酸化分離，加重腦缺血，最后產(chǎn)生腦水腫，形成惡性循環(huán)[6]。但是目前對(duì)于單胺類遞質(zhì)在MCAO/R損傷中的具體作用及其過(guò)程尚未有明確定論。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MCAO/R損傷后DA大量釋放，直接發(fā)揮神經(jīng)毒性作用、介導(dǎo)EAA和自由基的毒性作用，導(dǎo)致細(xì)胞脂質(zhì)微環(huán)境破壞，微血管損傷，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、DNA、RNA、氨基酸及高糖分子氧化、交聯(lián)、變性，線粒體呼吸功能受到抑制，細(xì)胞內(nèi)鈣超載、最終導(dǎo)致神經(jīng)元損傷壞死、凋亡[25]。DOPAC是DA的代謝產(chǎn)物，其比值反映了DA的代謝率水平。MCAO/R會(huì)導(dǎo)致DA代謝加強(qiáng)。再灌注24 h，DOPAC含量明顯增加，海馬中DA水平略有升高而皮層中DA含量略有下降，并且DOPAC/DA明顯增加，說(shuō)明，DA分解加強(qiáng)大于合成加強(qiáng)，此過(guò)程消耗大量能量，能量的過(guò)分需求使原本已經(jīng)損傷的產(chǎn)能系統(tǒng)—線粒體的負(fù)荷進(jìn)一步加重，導(dǎo)致神經(jīng)元損傷加重或壞死[26]。

腦缺血時(shí)，腦組織中大量的E能夠引起血管強(qiáng)烈收縮，從而加重腦缺血損傷及血管源性腦水腫。E的釋放會(huì)加劇神經(jīng)元代謝，并增加缺血組織血流與代謝需求的失衡[27]。

腦缺血后細(xì)胞外5-HT濃度迅速升高。缺血/缺氧后內(nèi)皮屏障被破壞，5-HT則可進(jìn)入平滑肌引起血管收縮。同時(shí)5-HT能夠加強(qiáng)EAA的神經(jīng)毒性，使EAA引起的興奮性去極化幅度和時(shí)相加強(qiáng)，伴隨細(xì)胞內(nèi)鈣離子的快速聚集。同時(shí)5-HT使花生四烯酸代謝加強(qiáng)，產(chǎn)生多種有毒產(chǎn)物，加重缺血/再灌注損傷[28]。5-HIAA是5-HT的代謝產(chǎn)物，其比值反映了5-HT的代謝率水平。MCAO/R會(huì)導(dǎo)致5-HT濃度迅速升高，代謝加強(qiáng)，5-HIAA含量明顯增加，并且5-HIAA/5-HT明顯升高。

DGMI治療組能夠抑制DA含量增加，并且抑制其代謝。同時(shí)可以抑制5-HT的產(chǎn)生，并且降低其代謝產(chǎn)物5-HIAA的含量。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DGMI可以改善由于能量衰竭、去極化導(dǎo)致遞質(zhì)外流和重?cái)z取障礙，抑制MCAO/R導(dǎo)致的腦內(nèi)Asp、Glu、Gln、Gly、GABA升高；降低缺血腦區(qū)皮層和海馬內(nèi)NE、DOPAC、5-HT、5-HIAA的表達(dá)，抑制皮層內(nèi)E的降低，從而對(duì)MCAO/R大鼠發(fā)揮腦保護(hù)作用。

綜上所述，MCAO/R導(dǎo)致腦組織中神經(jīng)遞質(zhì)變化，DGMI可以有效調(diào)節(jié)其腦內(nèi)濃度，減輕缺血引起的變化，這種作用可能是DGMI促進(jìn)損傷組織修復(fù)的基礎(chǔ)，也可能是由于其他途徑促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞功能恢復(fù)影響了遞質(zhì)的變化，其詳細(xì)機(jī)制有待進(jìn)一步研究?？梢源_定的是，DGMI治療腦缺血損傷與神經(jīng)遞質(zhì)的變化有密切關(guān)系。

[1] Vallon M, Chang J, Zhang H, et al. Developmental and pathological angiogenesis in the central nervous system[J].CellMolLifeSci,2014,71(18):3489-506.

[2] 劉青青,郭 虹,王少峽,等.腦缺血損傷機(jī)制的研究進(jìn)展[J]. 中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2012,30(6):1228-30.

[2] Liu Q Q, Guo H, Wang S X, et al. Research advance on mechanisms of brain ischemic injury[J].ChinArchTraditChinMed,2012,30(6):1228-30.

[3] 王軍玲,楊 陽(yáng),高 健,等.基于氨基酸代謝的抗腦缺血益氣解毒配伍中藥協(xié)同作用研究[J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2014,30(5):725-31.

[3] Wang J L, Yang Y, Gao J, et al. Synergistic and protective effects of various combination of major components of YiQiJieDu (YQJD) on focal cerebral ischemia injury based on amino acid metabonomics[J].ChinPharmacolBull,2014,30(5):725-31.

[4] Guo Z L, Zhu Y, Su X T, et al. DanHong injection dose-dependently varies amino acid metabolites and metabolic pathways in the treatment of rats with cerebral ischemia[J].ActaPharmacolSin,2015,36(6):748-57.

[5] 劉宗文,張 艷,賈丹輝,等.阿米替林對(duì)腦缺血/再灌注大鼠大腦皮層中氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的影響[J]. 中國(guó)藥學(xué)雜志,2008,43(17):1305-8.

[5] Liu Z W, Zhang Y, Jia D H, et al. Effects of amitriptyline on amino acids in ischemic areas in rats subjected to focal cerebral ischemia reperfusion[J].ChinPharmJ,2014,20(17): 1305-8.

[6] Wurtman R J, Zervas N T. Monoamine neurotransmitters and the pathophysiology of stroke and central nervous system trauma[J].JNeurosurg, 1974,40(1):34-6.

[7] 張 艷,賈丹輝,劉宗文,等. 阿米替林對(duì)局灶性腦缺血/再灌注損傷腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的影響[J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2007,23(8):1077-80.

[7] Zhang Y, Jia D H,Liu Z W, et al. Effects of amitriptyline on monoamines of brain tissue in rats with focal cerebral ischemia reperfusion injury[J].ChinPharmacolBull, 2007,23(8):1077-80.

[8] 伍清龍,孫永成,萬(wàn) 琴,等.HPLC-ELSD法測(cè)定注射用銀杏二萜內(nèi)酯中銀杏內(nèi)酯A、B、C、K[J]. 現(xiàn)代藥物與臨床,2014,29(3):255-8.

[8] Wu Q L, Sun W C, Wan Q, et al. Determination of ginkgolide A, B, C, and K in diterpene lactones from ginkgo biloba for injection by HPLC-ELSD[J].DrugsClin,2014,29(3):255-8.

[9] 劉 秋,許治良,周 軍,等.銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液對(duì)缺糖缺氧損傷的SH-SY5Y細(xì)胞保護(hù)作用[J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2015,31(7):994-9.

[9] Liu Q, Xu Z L, Zhou J, et al. Neuroprotective effects of YXETNZ injection on SH-SY5Y cells against injury induced by oxygen-glucose deprivation[J].ChinPharmacolBull,2015,31(7):994-9.

[10]陳春苗,周 軍,陳 健,等. 銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液對(duì)大鼠急性腦缺血/再灌注損傷的影響[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2014,20(17):133-6.

[10]Chen C M, Zhou J, Chen J, et al. Protective effects of ginkgo terpene lactones meglumine injection on focal cerebral ischemia reperfusion injury in rats[J].ChinJExpTraditMedFormul,2014,20(17): 133-6.

[11]章晨峰,曹 亮,鄧 奕,等.銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液對(duì)腦缺血/再灌注大鼠行為學(xué)和腦脊液成分的影響[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2015,21(20):118-22.

[11]Zhang C F, Cao L, Deng Y, et al. Effect of ginkgo terpene lactones meglumine injection on behavior and cerebrospinal fluid in rats with cerebral ischemia/reperfusion[J].ChinJExpTraditMedFormul,2015,21(20):118-22.

[12]Jin G, He X R, Chen L P. The protective effect of ginkobilboa leaves injection on the brain dopamine in the rat model of cerebral ischemia/reperfusion injury[J].AfrHealthSci, 2014,14(3):725-8.

[13]邢 婕,原曙春,孫惠敏,等.基于1H NMR代謝組學(xué)和偏最小二乘法的小柴胡湯證判別研究[J]. 藥學(xué)學(xué)報(bào),2015,50(8):1032-7.

[13]Xing J, Yuan S C, Sun H M, et al. Discrimination of patients with Xiao-Chaihu Tang syndrome using 1H NMR metabonomics and partial least square analysis[J].ActaPharmSin,2015,50(8):1032-7.

[14]Gao J, Zheng X G, Li Z H, et al. Metabonomic study on chronic unpredictable mild stress and intervention effects of Xiaoyaosan in rats using gas chromatography coupled with mass spectrometry[J].JEthnopharmacol,2011,137(1):690-9.

[15]Li X W, Zhang F S, Wang D Q, et al. NMR-based metabonomic and quantitative real-time PCR in the profiling of metabolic changes in carbon tetrachloride-induced rat liver injury[J].JPharmBiomedAnal,2014,89:42-9.

[16]Gao X X, Guo B R, Yang L, et al. Selection and dynamic metabolic response of rat biomarkers by metabonomics and multivariate statistical analysis combined with GC-MS[J].PharmacolBiochemBehav,2014,117:85-91.

[17]Melan A, Panton L, Corsi C, et al. Striatal outflow of adenosine, excitatory amino acids, gamma-aminobutyric acid, and taurine in awake freely moving rats after middle cerebral artery occlusion: correlations with neurological deficit and histopathological damage[J].Stroke,1999,30(11):2448-54.

[18]宋文婷,徐 立,劉建勛.腦缺血后谷氨酸及其受體介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷及相關(guān)藥物研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2012,28(6):747-50.

[18]Song W T, Xu L, Liu J X. Role of plasminogen system in myofibroblast apoptosis and tissue fibrosis[J].ChinPharmacolBull,2012,28(6): 747-50.

[19]梅和珊,王永利.腦缺血時(shí)谷氨酸釋放機(jī)制[J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2005,21(4):393-6.

[19]Mei H S, Wang Y L. The mechanisms of glutamate release in cerebral ischemia[J].ChinPharmacolBull,2005,21(4):393-6.

[20]Vemuganti R. Decreased expression of vesicular GABA transporter, but not vesicular glutamate, acetylcholine and monoamine transporters in rat brain following focal ischemia[J].NeurochemInt,2005,47(1-2):136-42.

[21]周偉勤.淫羊藿苷對(duì)快速老化小鼠SAMP8學(xué)習(xí)記憶的影響及作用機(jī)理研究 [D].北京:北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院, 2009:29-42.

[21]Zhou W Q. The study on the effects and mechanism of icariin on learning and memory in senescence accelerated mouse prone/8 (SAMP8)[D]. Beijing: PUMC, 2009:29-42.

[22]Wang T, Li Y, Zhao P, et al. Effects of oxysophoridine on amino acids after cerebral ischemic injury in mice[J].AnnIndianAcadNeurol,2014, 17(3):313-6.

[23]Benveniste H. Glutamate, microdialysis, and cerebral ischemia: lost in translation[J].Anesthesiology,2009,110(2):422-5.

[24]Krayznowska W, Pomierny B, Budziszewska B, et al. N-acetylcysteine and ceftriaxone as preconditioning strategies in focal brain ischemia: influence on glutamate transporters expression[J].NeurotoxRes, 2016,29(4):539-50.

[25]Zhang N, Liu P, He X R. Effect of single-use versus combined-use moschus and diazepam on expression of amino acid neurotransmitters in the rat corpus striatum[J].NeuRegeneratRes,2012,7(3):182-6.

[26]鐘 明,陳 虹,姜 勇,等.松果菊苷對(duì)腦缺血大鼠雙側(cè)腦組織中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的影響[J]. 中國(guó)新藥雜志,2012,21(11):1283-7.

[26]Zhong M, Chen H, Jiang Y, et al. Effect of echinacoside on monoamine neurotransmitters in bilateral brain tissue of rats with cerebral ischemia[J].ChinJNewDrugs,2012,21(11):1283-7.

[27]陶 冶.急性腦缺血/再灌注皮層單胺類神經(jīng)遞質(zhì)動(dòng)態(tài)變化及中藥干預(yù)作用[D].北京:北京中醫(yī)藥大學(xué), 2008:19-34.

[27]Tao Y. Dynamic changes on monoamine neurotransmitter and effects of Chinese medicine after cerebral ischemia and reperfusion in rats[J]. Beijing: Beijing University of Chinese Medicine, 2008:19-34.

[28]Yao J, Shen X N, Shen H, et al. Effects of theanine on monoamine neurotransmitters and related genes in cerebral ischemia-reperfusion injury rats[J].ChinPrevMed,2012,46(7):635-9.

Effects of diterpene ginkgolides meglumine injection on neurotransmitters in cerebral ischemia-reperfusion injury rats

ZHANG Wen1, SONG Jun-ke1, HE Guo-rong1, ZHANG Xue1,ZHOU Qi-meng1,WANG Zhen-zhong2, XIAO Wei2, XIAO Zhi-yong3, ZHOU Wen-xia3,DU Guan-hua1

(1.BeijingKeyLaboratoryofDrugTargetIdentificationandDrugScreening,InstituteofMateriaMedica,ChineseAcademyofMedicalSciencesPekingUnionMedicalCollege,Beijing100050,China; 2.StateKeyLaboratoryofNew-techforChineseMedicinePharmaceuticalProcess,JiangsuKanionPharmaceuticalCo.,Ltd.,LianyungangJiangsu222001,China；3.StateKeyLaboratoryofToxicologyandMedicalCountermeasures,InstituteofPharmacologyandToxicology,AcademyofMilitaryMedicalScience,Beijing100850,China)

Aim To investigate the effects of diterpene ginkgolides meglumine injection (DGMI) on amino acids and monoamine neurotransmitters in rats with cerebral ischemia/reperfusion injury. Methods Intraluminal suture was applied to establish middle cerebral artery occlusion (MCAO/R) model with ischemia for 1.5 h and reperfusion for 24 h. After the administration of DGMI (i.v.), the levels of amino acid and monoamine neurotransmitters in brain tissue were detected through HPLC-ECD. Results DGMI down-regulated the concentrations of aspartic acid, glutamic acid, glycine and γ-aminobutyric acid which were increased in MCAO/R group. DGMI also reduced the levels of norepinephrine epinephrine, glyoxylic acid, serotonin and 5-HIAA in cortex and hippocampus, and increased adrenaline content compared to the model group. Conclusion DGMI exhibits a protective role in rats with cerebral ischemia /reperfusion injury through regulating amino acids and monoamine neurotransmitters.

DGMI; cerebral ischemia-reperfusion; amino acid neurotransmitters, monoamine neurotransmitters; HPLC-ECD; metabonomics

時(shí)間：2016-12-5 15:14

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161205.1514.010.html

2016-08-02,

2016-09-20

國(guó)家科技部“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)資助項(xiàng)目(No 2013ZX09508104，2013ZX09402203)；抗毒藥物與毒理學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題(No TMC201510)；國(guó)家自然科學(xué)青年基金項(xiàng)目(No 81603100)；北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生創(chuàng)新基金項(xiàng)目(No 2015-1007-07)

張 雯(1990-)，女，博士生，研究方向：神經(jīng)藥理學(xué)與新藥發(fā)現(xiàn)，Tel：010-63131571，E-mail：zhangwen9010@imm.ac.cn; 杜冠華(1956-)，男，博士，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向：神經(jīng)藥理學(xué)、心腦血管藥理學(xué)與新藥發(fā)現(xiàn)，通訊作者,Tel：010-63165184，E-mail：dugh@imm.ac.cn

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.12.005

A

1001-1978(2016)12-1648-09

R-332；R282.71；R322.81；R341.7；R347；R743.310.531