糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)大鼠原代培養(yǎng)杏仁核神經(jīng)元的凋亡

許光明，張曉靜，劉 藝，張 悅，文 迪，叢 斌

(河北醫(yī)科大學(xué) 1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，2. 臨床診斷學(xué)教研室，河北 石家莊 050017)

糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)大鼠原代培養(yǎng)杏仁核神經(jīng)元的凋亡

許光明1，張曉靜1，劉 藝1，張 悅2，文 迪1，叢 斌1

(河北醫(yī)科大學(xué) 1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，2. 臨床診斷學(xué)教研室，河北 石家莊 050017)

目的 探討糖皮質(zhì)激素(GC)對(duì)大鼠杏仁核神經(jīng)元凋亡的影響。方法 原代培養(yǎng)大鼠杏仁核神經(jīng)元，首先采用免疫熒光技術(shù)對(duì)培養(yǎng)的原代神經(jīng)元及其是否存在豐富的糖皮質(zhì)激素受體分別進(jìn)行了鑒定，并用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度的人工合成糖皮質(zhì)激素地塞米松(10-9～10-6mol·L-1)對(duì)杏仁核神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的影響。然后將實(shí)驗(yàn)分為4組：對(duì)照組(CON)、地塞米松(DEX)刺激組、地塞米松和米非司酮(受體抑制劑)共同刺激組(DEX+MIF)、米非司酮刺激組(MIF)。用TUNEL原位技術(shù)檢測(cè)各組的凋亡情況，并用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)各組Bax mRNA的表達(dá)變化。結(jié)果 (1)與CON組相比，不同濃度的DEX作用于神經(jīng)元后，神經(jīng)元凋亡率明顯升高(P<0.05)，且呈濃度依賴(lài)性；(2)TUNEL染色結(jié)果顯示， DEX組細(xì)胞凋亡率明顯高于CON組(P<0.05)，而與DEX組相比，DEX+ MIF組凋亡率明顯降低(P<0.05)，MIF組與CON組相比無(wú)明顯差異(P>0.05)；(3)與CON組相比，DEX組Bax mRNA的表達(dá)量明顯升高(P<0.05)，而與DEX組相比，DEX+ MIF組的Bax mRNA的表達(dá)量明顯降低(P<0.05)，MIF組與CON組相比無(wú)明顯差異(P>0.05)。結(jié)論 糖皮質(zhì)激素可以通過(guò)其受體誘導(dǎo)大鼠原代培養(yǎng)杏仁核神經(jīng)元的凋亡。

應(yīng)激；糖皮質(zhì)激素；杏仁核；神經(jīng)元；凋亡；原代培養(yǎng)

下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸(hypothalamus-hypophysis-adrenal cortex axis, HPA)興奮，外周血糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid, GC)分泌增多是應(yīng)激主要的神經(jīng)內(nèi)分泌反應(yīng)之一。近年來(lái)研究證實(shí)，GC濃度持續(xù)升高，不僅會(huì)抑制HPA軸，導(dǎo)致內(nèi)分泌紊亂，并且能夠透過(guò)血腦屏障，作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，造成神經(jīng)元突起的萎縮、神經(jīng)元可塑性降低、甚至死亡[1-4]。因此GC對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷作用有可能是應(yīng)激引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙的重要機(jī)制之一。

杏仁核(amygdala)是邊緣系統(tǒng)中最重要的核團(tuán)之一，它的纖維聯(lián)系和功能極其廣泛，是調(diào)節(jié)情緒、控制恐懼記憶的神經(jīng)中樞，在情感的形成和貯存方面起著至關(guān)重要的作用，對(duì)應(yīng)激反應(yīng)十分敏感。研究證實(shí)，杏仁核神經(jīng)元凋亡與創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙等多種精神疾患密切相關(guān)。因此研究GC對(duì)杏仁核的損傷作用對(duì)于揭示心理應(yīng)激引起精神損傷的機(jī)制具有重要科學(xué)意義。而目前GC是否可以引起杏仁核神經(jīng)元凋亡尚不清楚。本研究旨在從細(xì)胞水平來(lái)探討GC對(duì)原代培養(yǎng)大鼠杏仁核神經(jīng)元凋亡的影響，為揭示應(yīng)激對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷作用機(jī)制提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 新生24 h內(nèi)SD乳鼠，♀♂不限，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 主要試劑 DMEM/F12培養(yǎng)基、Neurobasal培養(yǎng)基、B27培養(yǎng)基添加劑、胎牛血清，Hank’s液均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；多聚賴(lài)氨酸、0.25%胰蛋白酶、0.05%胰蛋白酶、DNA酶均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司； 100×青/鏈霉素溶液購(gòu)自?shī)W地利PAA公司； 10×PBS、4%多聚甲醛溶液、抗熒光衰減封片劑和DEPC處理水均購(gòu)自北京Solarbio有限公司；TRIzol、Plat SYBR Green qPCR SuperMix UDG購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司； Revert Aid First cDNA Synthesis Kit購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；Eastep Super總RNA提取試劑盒購(gòu)自上海Promega有限公司；地塞米松(dexamethasone, DEX)和米非司酮(mifepristone, MIF)購(gòu)自上海梯希愛(ài)公司；抗體稀釋液和山羊血清工作液購(gòu)自北京中杉生物試劑有限公司；兔抗MAP2多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司；兔抗GR多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Affinity公司；TUNEL原位凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；流式FITC-AnnexinV/PI試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司；其他生化試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。所用引物由美國(guó)Invitrogen公司根據(jù)設(shè)計(jì)合成，見(jiàn)Tab 1。

Tab 1 Sequences for primers

1.3 主要方法

1.3.1 原代杏仁核神經(jīng)元的培養(yǎng) 根據(jù)Colin、Beaudoin等[2,5,6]的文獻(xiàn)報(bào)道，全程無(wú)菌操作，取新生24 h內(nèi)的乳鼠，75%乙醇全身浸泡消毒3 min，于冰上迅速斷頭取腦；將腦組織置于預(yù)冷的DMEM培養(yǎng)液中，置冰上，解剖顯微鏡下分離雙側(cè)杏仁核，并剝除多余的血管膜、被膜等組織；用顯微剪將收集的杏仁核組織剪成大約1 mm3的小塊，移入15 mL離心管中；0.125%胰蛋白酶消化，37 ℃，15 min，期間震蕩混勻2次；1 200 r·min-1，離心5 min；棄上清，用含10%血清的DMEM/F12完全培養(yǎng)基終止消化，重新懸浮沉淀；1 mL口徑的吸管輕柔吹打成單細(xì)胞懸液；400目無(wú)菌尼龍篩網(wǎng)過(guò)濾；1 000 r·min-1，離心5min，并用DMEM/F12完全培養(yǎng)基重新懸浮沉淀吹打成單細(xì)胞懸液；細(xì)胞計(jì)數(shù)，按合適濃度接種于多聚賴(lài)氨酸包被的細(xì)胞培養(yǎng)板中；將培養(yǎng)板放入37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)；3～5 h后，更換DMEM/F12完全培養(yǎng)基為Neurobasal+B27神經(jīng)元培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；3 d換液1次，神經(jīng)元發(fā)育成熟后，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 神經(jīng)元鑒定 杏仁核神經(jīng)元培養(yǎng)至d 10，4%多聚甲醛固定20 min；0.2% TritonX-100室溫靜置15 min；滴加山羊血清工作液正常封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，37℃孵育30 min；加兔抗MAP2(1 ∶200稀釋)抗體，4℃過(guò)夜；37℃復(fù)溫30 min后，用0.01 mol·L-1PBS低速搖床上清洗3次，每次5 min；滴加Dylight488標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1 ∶100稀釋)，37℃避光孵育1 h；抗熒光衰減封片劑封片，共聚焦顯微鏡下觀察MAP2表達(dá)并采集圖像。

1.3.3 GR檢測(cè)杏仁核神經(jīng)元 培養(yǎng)至d 10， 4%多聚甲醛固定20 min；0.2%TritonX-100室溫靜置15 min；滴加山羊血清工作液正常封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，37℃孵育30 min；加兔抗GR(1 ∶100稀釋)抗體，4℃過(guò)夜；37℃復(fù)溫30 min后，用0.01 mol·L-1PBS低速搖床上清洗3次，每次5 min；滴加Dylight594標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1 ∶100稀釋)，37℃避光孵育1 h；DAPI復(fù)染，抗熒光衰減封片劑封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察GR表達(dá)并采集圖像；

1.3.4 流式細(xì)胞術(shù)FITC-AnnexinV/PI檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 6孔板各孔細(xì)胞加入不同濃度的DEX(10-9～10-6mol·L-1)作用48 h，用0.05%的胰蛋白酶消化制備成單細(xì)胞懸液，各組均加入5 μL FITC標(biāo)記的AnnexinV和5 μL PI，混勻后室溫避光孵育15 min；加入1×Binding buffer補(bǔ)足至500 μL；立即上流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組的凋亡率。

1.3.5 實(shí)驗(yàn)分組 后續(xù)實(shí)驗(yàn)分為4組：(1)CON組：用神經(jīng)元培養(yǎng)液正常培養(yǎng)；(2)DEX組：用10-6mol·L-1的DEX培養(yǎng)；(3)DEX+MIF組：用10-6mol·L-1的DEX和10-6mol·L-1的MIF共同培養(yǎng)；(4)MIF組：用10-6mol·L-1的MIF單獨(dú)培養(yǎng)。各組加入的培養(yǎng)液量一致，均作用48 h。

1.3.6 TUNEL檢測(cè)凋亡率 待藥物作用48 h后，1%多聚甲醛室溫固定10 min；浸洗后再用預(yù)冷的乙醇醋酸(2 ∶1配制)溶液于-20℃進(jìn)行再固定5 min；然后滴加平衡液Equilibration Buffer，室溫下反應(yīng)；加TdT工作液，蓋上塑料蓋玻片，濕盒中37℃孵育1 h；放入終止液中，搖動(dòng)15 s后室溫放置10 min以終止反應(yīng)；0.01 mol·L-1PBS低速搖床上清洗3次，每次2 min；滴加熒光抗體工作液，蓋上塑料蓋玻片，室溫濕盒中避光孵育30 min；0.01 mol·L-1PBS低速搖床上清洗3次，每次2 min；DAPI復(fù)染，抗熒光衰減封片劑封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察染色結(jié)果(TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞標(biāo)記為綠色，DAPI標(biāo)記細(xì)胞核為藍(lán)色)。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野(×200)，所采集的每幅圖像都盡量包含相同的細(xì)胞數(shù)目，以陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)來(lái)表示凋亡率。

1.3.7 Real-time PCR檢測(cè)BAX mRNA的表達(dá) 用Eastep Super總RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，用NanoQ微型分光光度計(jì)檢測(cè)儀測(cè)定總RNA含量及濃度，并根據(jù)定量結(jié)果調(diào)整RNA濃度為250 mg·L-1。按照Revert Aid First cDNA Synthesis Kit說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。總反應(yīng)體積為20 μL，各成分為：Oligol(dT)18引物1 μL，RiboLockTM RNA酶抑制劑1 μL，RevertAidTM M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶1 μL，10-2mol·L-1dNTP Mix 2 μL，5×Reaction Buffer 4 μL，RNA2 μL (500 ng)，無(wú)核酶水9 μL。反應(yīng)條件為：42℃ 60 min，70℃ 5 min，4℃ forever。得到cDNA后按照Plat SYBR Green qPCR SuperMix UDG試劑盒進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)?？偡磻?yīng)體積為20 μL，各成分為：SYBR Green qPCR SuperMix UDG 10 μL，F(xiàn)orward Primer(10-5mol·L-1)0.5 μL，Reward Primer(10-5mol·L-1)0.5 μL，cDNA 2 μL，無(wú)核酶水7 μL。擴(kuò)增條件為：50℃ 2 min，95℃ 2 min；95℃ 15 s，60℃ 30 s，45個(gè)循環(huán)，以GAPDH作為內(nèi)參基因，用△△Ct法分析基因的相對(duì)表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 杏仁核神經(jīng)元原代培養(yǎng)結(jié)果 倒置顯微鏡下觀察，剛接種的杏仁核神經(jīng)元呈圓形，單個(gè)分布，體積較小，細(xì)胞透亮；培養(yǎng)4～6 h后，絕大部分神經(jīng)元已經(jīng)貼壁，并且個(gè)別神經(jīng)元長(zhǎng)出1～2個(gè)小的突起，見(jiàn)Fig 1A；培養(yǎng)至d 10時(shí)，神經(jīng)元胞體變大變圓，立體感較強(qiáng)，突起也進(jìn)一步延長(zhǎng)，相互交織形成致密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，見(jiàn)Fig 1B。此時(shí)的神經(jīng)元發(fā)育成熟，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

Fig 1 Morphological characteristics of primary cultured amygdaloid neurons

A:Primary cultured amygdaloid neurons on 2 d(×200).B: Primary cultured amygdaloid neurons on 8 d(×200)

2.2 原代培養(yǎng)的杏仁核神經(jīng)元MAP-2免疫熒光鑒定 用神經(jīng)元特異性標(biāo)記物MAP-2多克隆抗體標(biāo)記神經(jīng)元，MAP-2陽(yáng)性細(xì)胞胞質(zhì)及突起呈綠色， DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核呈藍(lán)色，神經(jīng)元突起相互交織成網(wǎng)絡(luò)。神經(jīng)元純度為MAP-2標(biāo)記的神經(jīng)元占DAPI標(biāo)記的神經(jīng)元總細(xì)胞數(shù)的比值，結(jié)果顯示神經(jīng)元細(xì)胞純度>90%，見(jiàn)Fig 2。

2.3 原代培養(yǎng)的杏仁核神經(jīng)元GC受體的表達(dá) 原代杏仁核神經(jīng)元培養(yǎng)成熟后，用GR的抗體標(biāo)記杏仁核神經(jīng)元內(nèi)的GR，GR陽(yáng)性為細(xì)胞胞質(zhì)呈現(xiàn)紅色，DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核呈藍(lán)色。激光共聚焦顯微鏡下顯示，原代培養(yǎng)杏仁核神經(jīng)元含有豐富的GR陽(yáng)性表達(dá)，見(jiàn)Fig 3。

Fig 2 Neuron purity of rat primary cultured amygdaloid neurons

A:×200；B:×400. Immunofluorescence staining with anti-MAP2(green 1 ∶200),with blue fluorescent dyes DAPI(1.25 mg·L-1)used to stain DNA in nucleus. The percentage of amygdaloid neurons to the total cells was neuron purity. Results showed the purity in the present study was more than 90%

Fig 3 Expression of GC receptor in primary cultured amygdaloid neurons(×400)

A:Two fluorescence channels merge; B: Only one fluorescence channel. Immunofluorescence staining with anti-GR(red 1 ∶100),with blue fluorescent dyes DAPI(1.25 mg·L-1)used to stain DNA in nucleus.

2.4 不同濃度的GC對(duì)杏仁核神經(jīng)元凋亡的影響 流式細(xì)胞術(shù)AnnexinV-FITC/PI雙標(biāo)法檢測(cè)不同濃度的DEX(10-9～10-6mol·L-1)對(duì)杏仁核神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的影響。與CON組相比，10-8mol·L-1至10-6mol·L-1的DEX作用于杏仁核神經(jīng)元48 h后，神經(jīng)元凋亡率明顯升高(P<0.05)，且呈濃度依賴(lài)性；10-9mol·L-1組的凋亡率與CON組相比差異無(wú)顯著性(P>0.05)，見(jiàn)Fig 4、Tab 2。

Tab 2 Effect of different concentrations of DEX on apoptosis of amygdaloid ±s,n=3)

*P<0.05vscontrol，**P<0.01vscontrol

2.5 TUNEL檢測(cè)神經(jīng)元凋亡率 TUNEL染色可見(jiàn)，DEX組細(xì)胞凋亡率明顯高于CON組(P<0.05)。而與DEX組相比，DEX+MIF組細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.05)，MIF組與CON組相比差異無(wú)顯著性(P>0.05)，見(jiàn)Fig 5、Tab 3。

Fig 4 Effect of different concentrations of DEX on apoptosis of amygdaloid neurons

Fig 5 GR participated in GC-induced amygdaloid neuron apoptosis

2.6 Real-time PCR檢測(cè)Bax mRNA的表達(dá) 采用Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)促凋亡基因Bax mRNA的表達(dá)，結(jié)果可見(jiàn)，與CON組相比，DEX組BAX mRNA的表達(dá)量明顯升高(P<0.05)；而與DEX組相比，DEX+ MIF組的Bax mRNA的表達(dá)量明顯降低(P<0.05)，而MIF組與CON組相比差異無(wú)顯著性(P>0.05)，見(jiàn)Fig 6、Tab 4。

Tab 3 GR participated in GC-induced amygdaloid neuron ±s,n=7)

**P<0.01vscontrol.##P<0.01vsDEX treatment

GroupRQCON0.91±0.15DEX1.13±0.16*DEX+MIF0.76±0.15#MIF0.78±0.20

*P<0.05vscontrol.#P<0.05vsDEX treatment

Fig 6 Effect of DEX on mRNA levels of Bax

3 討論

杏仁核是邊緣系統(tǒng)的重要組成部分，在結(jié)構(gòu)上由13個(gè)核團(tuán)組成，它們有著廣泛的核團(tuán)間和核團(tuán)內(nèi)的纖維聯(lián)系。而其重要功能的發(fā)揮主要為3個(gè)核團(tuán)：皮質(zhì)內(nèi)側(cè)核團(tuán)(MeA)、基底外側(cè)核團(tuán)(BLA)和杏仁核中央核(CeA)。其中BLA和CeA是負(fù)責(zé)恐懼學(xué)習(xí)和記憶的重要中樞，BLA進(jìn)行感覺(jué)信息的傳輸與處理，CeA負(fù)責(zé)恐懼行為的表達(dá)[7]。杏仁核參與情緒、記憶的產(chǎn)生、識(shí)別以及調(diào)節(jié)，是控制恐懼記憶的神經(jīng)中樞，在情感記憶的形成和貯存方面起重要作用，是調(diào)節(jié)HPA軸活性的高位中樞，對(duì)應(yīng)激反應(yīng)十分敏感并且容易遭受損傷，從而導(dǎo)致恐懼學(xué)習(xí)、記憶的缺失，情感記憶障礙。研究證實(shí)[8-9]，杏仁核的變性和凋亡能夠?qū)е翽TSD的發(fā)生；杏仁核的萎縮和退化能夠加劇阿爾茨海默病的發(fā)生發(fā)展[10]。

有研究表明，束縛應(yīng)激能夠誘導(dǎo)大鼠海馬神經(jīng)元的凋亡，其機(jī)制與促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)有關(guān)[11]。并且應(yīng)激引起的GC升高能夠引起大鼠海馬、杏仁核及前皮質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[12]。這些研究均提示HPA軸相關(guān)激素對(duì)海馬、杏仁核等情感腦區(qū)的損傷作用可能是應(yīng)激引起精神損傷的機(jī)制之一。因此研究GC對(duì)杏仁核的損傷作用對(duì)于揭示應(yīng)激引起的精神損傷機(jī)制具有重要科學(xué)意義。本研究為了模擬機(jī)體束縛應(yīng)激時(shí)HPA軸紊亂，外周血GC水平增高的環(huán)境，在離體水平探討了GC對(duì)原代培養(yǎng)杏仁核神經(jīng)元凋亡的影響。

GC是通過(guò)糖皮質(zhì)激素受體(GC receptor, GR)發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的，目前已知的受體主要包括α受體和變異片段的β受體兩種亞型。而糖皮質(zhì)激素主要是通過(guò)與α受體結(jié)合，發(fā)揮其生理及藥理功能，α受體幾乎在所有組織和有核細(xì)胞中均有表達(dá)，尤以神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分布居多，在絕大多數(shù)細(xì)胞中其含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)β受體[13]。Morimoto等[14]研究發(fā)現(xiàn)，成年SD大鼠杏仁核腦區(qū)高表達(dá)GRα。本實(shí)驗(yàn)成功在體外進(jìn)行了原代杏仁核神經(jīng)元的培養(yǎng)，經(jīng)MAP-2鑒定，神經(jīng)元純度>90%，并且采用免疫熒光技術(shù)用GRα多克隆抗體對(duì)原代培養(yǎng)的杏仁核神經(jīng)元進(jìn)行了標(biāo)記，結(jié)果顯示，原代杏仁核神經(jīng)元高表達(dá)GRα，這與Morimoto等的研究結(jié)果一致。

本課題組在預(yù)實(shí)驗(yàn)中采用FITC-AnnexinV/PI流式雙標(biāo)染色檢測(cè)了不同濃度的DEX對(duì)杏仁核神經(jīng)元凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)DEX作用后，杏仁核神經(jīng)元會(huì)出現(xiàn)不同程度的凋亡。進(jìn)一步采用TUNEL檢測(cè)了DEX與MIF共同作用后對(duì)杏仁核神經(jīng)元凋亡的影響，結(jié)果顯示DEX作用于神經(jīng)元后，細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組，而MIF作用后，細(xì)胞凋亡率明顯降低。MIF是一種GR拮抗劑，它可抑制GC與其受體結(jié)合，使得GC無(wú)法發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[15]。該結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了GC能夠誘導(dǎo)原代培養(yǎng)杏仁核神經(jīng)元的凋亡，而GR拮抗劑MIF能夠有效的降低杏仁核神經(jīng)元的凋亡，說(shuō)明GC通過(guò)受體機(jī)制誘導(dǎo)杏仁核神經(jīng)元凋亡。同時(shí)用Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)了促凋亡基因Bax mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果顯示DEX組神經(jīng)元Bax mRNA的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，而DEX+MIF共同刺激組Bax mRNA的表達(dá)水平又比DEX組明顯降低，這與TUNEL結(jié)果一致。

綜上所述，本研究成功進(jìn)行了大鼠杏仁核神經(jīng)元的原代培養(yǎng)，在細(xì)胞水平觀察了不同濃度的GC對(duì)杏仁核神經(jīng)元凋亡的影響，并通過(guò)觀察神經(jīng)元病理學(xué)形態(tài)變化和Bax mRNA的表達(dá)水平的改變，證實(shí) GC通過(guò)GC受體可以誘導(dǎo)原代培養(yǎng)杏仁核神經(jīng)元的凋亡。這一發(fā)現(xiàn)為束縛應(yīng)激致大鼠杏仁核神經(jīng)元的損傷提供了理論依據(jù)，為正確評(píng)價(jià)GC在應(yīng)激反應(yīng)中的作用以及應(yīng)激所致精神損傷的早期診斷和治療提供了一定的科學(xué)依據(jù)。而GC通過(guò)GR誘導(dǎo)杏仁核神經(jīng)元凋亡的具體分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)所有研究?jī)?nèi)容均在河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系實(shí)驗(yàn)室完成，參與人員有許光明、張曉靜、劉藝，感謝叢斌教授在課題設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)思路中給予的悉心指導(dǎo)，感謝在實(shí)驗(yàn)中給予幫助的張曉靜老師、張悅老師、文迪老師。)

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網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-12-5 15:14 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161205.1514.024.html

Glucocorticoid-induced rat primary amygdaloid neuron apoptosis

XU Guang-ming1, ZHANG Xiao-jing1, LIU Yi1, ZHANG Yue2, WEN Di1, CONG Bin1

(1.DeptofForensicMedicine,BasicMedicalCollege；2.DeptofClinicalDiagnostics,HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050017,China)

Aim To investigate the role of GC in inducing apoptosis of amygdaloid neurons. Methods Culturing primary neurons of amygdala, the neurons were identified by immunefluorescence techniques with antibody against microtubule associated protein-2(MAP2) and antibody against GC receptor. Using flow cytometry to detect the effects of different concentrations of dexamethasone on the amygdala neuron apoptosis. Then the experiment was divided into four groups: CON, DEX, DEX+MIF and MIF. The rate of apopto-sis of the four groups was detected by TUNEL technique and the expressions of BAX mRNA of four groups by Real-time PCR technique.Results (1) Compared with the control group, the percentage of apoptotic cells increased significantly with DEX(10-8mol·L-1～10-6mol·L-1) treatment in a concentration-dependent manner. (2) the TUNEL test showed that the percentage of apoptotic cells of DEX group increased significantly, compared with control group. While it decreased significantly in DEX+MIF group, compared with DEX group. There was no difference between MIF group and control group. (3) Compared with control group, the expressions of BAX mRNA of DEX group increased significantly. While the expressions of BAX mRNA of DEX+MIF group decreased significantly, compared with the DEX group.There was no difference between MIF group and control group.Conclusion GC can independently induce the apoptosis of primary cultured neurons in the amygdala by combining with GC receptor.

stress; glucocorticoid; amygdala; neuron; apoptosis; primary culture

時(shí)間：2016-12-5 15:14

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161205.1514.022.html

2016-07-08,

2016-09-20

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81430047)

許光明(1989-)，男，碩士，研究方向：神經(jīng)系統(tǒng)疾病，E-mail：fyguangming@163.com; 叢 斌(1957-)，男，博士，教授，研究方向：神經(jīng)系統(tǒng)疾病，通訊作者，Tel：0311-86265602，E-mail:hbydcongbin@126.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.12.011

A

1001-1978(2016)12-1688-07

R-332；R322.81；R329.25；R392.11；R977.11