RP-HPLC法同時測定菥蓂藥材中7種黃酮苷的含量

程麗媛，梁 勇，羅 軒，劉 旭，楊 華，王立升

(1.廣西大學化學化工學院， 廣西南寧530004；2.南寧驕陽醫(yī)藥科技有限公司， 廣西南寧530003)

RP-HPLC法同時測定菥蓂藥材中7種黃酮苷的含量

程麗媛1，梁 勇2，羅 軒1，劉 旭1，楊 華1，王立升1

(1.廣西大學化學化工學院， 廣西南寧530004；2.南寧驕陽醫(yī)藥科技有限公司， 廣西南寧530003)

建立了一種可以對菥蓂藥材中5, 7-二羥基-4′-O-(6″-O-β-D-葡萄糖)-β-D-葡萄糖黃酮、異肥皂草苷、異葒草苷、牡荊苷、異牡荊苷、木犀草苷和大波斯菊苷的含量進行同時測定的RP-HPLC法。色譜條件：色譜柱為Agilent C18柱(4.6×150 mm, 3.5 μm)；流動相為乙腈-0.4%冰醋酸水溶液，梯度洗脫；流速1.0 mL/min；檢測波長273 nm；柱溫35 ℃。結果表明，在上述色譜條件下，5, 7-二羥基-4′-O-(6″-O-β-D-葡萄糖)-β-D-葡萄糖黃酮、異肥皂草苷、異葒草苷、牡荊苷、異牡荊苷、木犀草苷和大波斯菊苷的質(zhì)量濃度分別在5.67～56.7 μg/mL(r=0.999 7)，10.92～109.2 μg/mL(r=0.999 4)，5.76～57.6 μg/mL(r=0.999 8)，4.92～49.2 μg/mL(r=0.999 8)，13.95～139.5 μg/mL(r=0.999 9)，5.25～52.5 μg/mL(r=0.999 8)，5.22～52.2 μg/mL(r=0.999 7)范圍內(nèi)與色譜峰的峰面積呈現(xiàn)良好的線性關系，平均加樣回收率均在97%～101%，RSD均小于2.7%。該分析方法簡便、快速、準確且重現(xiàn)性好，為有效地監(jiān)控菥蓂藥材的質(zhì)量提供了可靠方法。

菥蓂；RP-HPLC；黃酮苷；含量同時測定

菥蓂(ThlaspiarvenseL.) 系十字花科菥蓂屬一年生草本植物，又名遏藍菜、敗醬草、犁頭草、寨卡等。我國菥蓂資源極為豐富，全國各地均有分布[1]。菥蓂作為我國傳統(tǒng)中草藥，其全草、嫩苗、種子均可入藥，具有清肝明目、清熱利尿等功效，臨床上可用于治療腎炎、子宮內(nèi)膜炎等疾病[2-4]。同時，菥蓂是廣西花紅片的重要成分[5]。菥蓂及菥蓂籽均具備抑菌和顯著的體外抗腫瘤活性[6-7]。

黃酮類化合物廣泛存在于自然界中，是植物體次級代謝產(chǎn)生的一類天然有機化合物，具有抗炎、保護心腦血管以及抗癌等活性[8-11]。菥蓂中黃酮成分含量較高且種類豐富。成日青等[12]將菥蓂經(jīng)石油醚脫脂，使用70%乙醇加熱回流提取，測得總黃酮含量為5.26 mg /g；于金英等[13]通過高效液相色譜—電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用技術，對菥蓂水提醇沉物中的主要黃酮成分進行分析和鑒定，共鑒定出 15 個黃酮類化合物。

筆者所在課題組的研究表明，菥蓂中的黃酮具有較強的抗炎活性，這與菥蓂治療炎癥疾病的作用相符[14]。但傳統(tǒng)研究僅限于菥蓂黃酮類化合物的分離，缺乏對各黃酮單體含量的測定研究，因此，有必要對菥蓂黃酮活性單體的含量進行分析，為有效地保證其臨床療效提供參考。

反相液相色譜法 (RP-HPLC)是一種常用于中草藥中多種化學成分含量同時測定的方法，該法簡便、快速、準確、重復性好[15]。

本研究建立了菥蓂藥材中5, 7-二羥基-4′-O-(6″-O-β-D-葡萄糖)-β-D-葡萄糖黃酮、異肥皂草苷、異葒草苷、牡荊苷、異牡荊苷、木犀草苷和大波斯菊苷等7種黃酮苷(化學結構式見表1)的RP-HPLC同時測定法，旨在為更有效全面的監(jiān)控菥蓂藥材的質(zhì)量提供理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent 1260 高效液相色譜儀，Agilent 化學工作站( 美國安捷倫科技有限公司);FA1104B電子分析天平(上海越平科學儀器有限公司);ZK-82B干燥箱(上海博迅實業(yè)有限公司);HH-S2數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市醫(yī)療儀器廠);UV-T6紫外-可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)。

甲醇(色譜純，西隴化工股份有限公司);冰醋酸(分析純，上海申博化工有限公司);水(純凈水，娃哈哈集團有限公司);異葒草苷、牡荊苷、異牡荊苷、木犀草苷和大波斯菊苷對照品(含量質(zhì)量分數(shù)≥98%，成都植標化純生物科技有限公司);5, 7-二羥基-4′-O-(6″-O-β-D-葡萄糖)-β-D-葡萄糖黃酮和異肥皂草苷(實驗室自制，經(jīng)核磁和質(zhì)譜確證結構，采用HPLC峰面積歸一化法計算含量，純度均大于98%)；菥蓂藥材樣品由廣西壯族自治區(qū)柳州花紅藥業(yè)股份有限公司鑒定并提供。

表1 菥蓂中7種黃酮苷的化學結構
Tab.1 Structures of seven flavonoids inThlaspiarvenseL.

化合物結構5，7-二羥基-4′-O-(6″-O-β-D-葡萄糖)-β-D-葡萄糖黃酮異肥皂草苷異葒草苷牡荊苷異牡荊苷木犀草苷大波斯菊苷

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱為Agilent C18柱(4.6×150 mm，3.5 μm)；流動相為乙腈(A)-0.4%冰醋酸水溶液(B)；梯度洗脫：0 min: A-B(5∶95)，20 min: A-B(10∶90)，90 min: A-B(30∶70)； 流速為1.0 mL/min；檢測波長為273 nm；柱溫30 ℃；進樣量20 μL。

在上述色譜條件下，取供試品溶液進樣分析，進樣量20 μL，理論塔板數(shù)不低于7 000。5, 7-二羥基-4′-O-(6″-O-β-D-葡萄糖)-β-D-葡萄糖黃酮、異肥皂草苷、異葒草苷、牡荊苷、異牡荊苷、木犀草苷和大波斯菊苷的相鄰色譜峰之間分離良好，分離度大于1.5，符合分離要求[16-17]。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備

精密稱定7種黃酮苷對照品，使用體積分數(shù)80%甲醇水溶液進行溶解，并分別轉移至10 mL容量瓶中稀釋至刻度，搖勻，得各對照品儲備液，4 ℃冷藏，備用。分別精密量取各對照品儲備液適量置于同一50 mL容量瓶中，加80%甲醇水溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，得到5, 7-二羥基-4′-O-(6″-O-β-D-葡萄糖)-β-D-葡萄糖黃酮141.75 μg/mL，異肥皂草苷273.00 μg/mL, 異葒草苷144.00 μg/mL，牡荊苷123.00 μg/mL，異牡荊苷348.75 μg/mL，木犀草苷131.25 μg/mL，大波斯菊苷130.65 μg/mL的混合對照品儲備液。

2.2.2 供試品溶液的制備

稱取干燥菥蓂全草粗粉1.0 g，置于50 mL圓底燒瓶中，精密加入80%甲醇20 mL，稱定重量并記錄，80 ℃水浴加熱回流萃取1.0 h，冷卻至室溫后滴加80%甲醇補足失重，搖勻。于3 000 r/min下離心5 min，取上清液，使用0.45 μm微孔濾膜過濾，取濾液即得供試品溶液。

2.3 線性關系的考察

精密移取上述對照品儲備液1.0、1.5、2.5、5、7.5、10 mL，分別置于25 mL容量瓶中，加80%甲醇水溶液稀釋至刻度，搖勻，得不同濃度的混合對照品溶液。按“2.1節(jié)”色譜條件，使用高效分析液相進行分析。以對照品溶液濃度(X)為橫坐標，以峰面積(Y)為縱坐標，繪制標準曲線并進行回歸計算，得到7種黃酮苷的標準曲線回歸方程，見表2。

表2 回歸方程、線性范圍和相關系數(shù)(n=6)
Tab.2 Regression equations, linear ranges and correlation coefficients(n=6)

化合物回歸方程相關系數(shù)R線性范圍/(μg·mL-1)5，7-二羥基-4′-O-(6″-O-β-D-葡萄糖)-β-D-葡萄糖黃酮y=50273x+954509997567～567異肥皂草苷y=42498x+0161099941092～1092異葒草苷y=42943x-1079209998576～576牡荊苷y=40424x-542209998492～492異牡荊苷y=51347x-6634099991395～1395木犀草苷y=39749x-1388609998525～525大波斯菊苷y=38807x-252209997522～522

2.4 精密度實驗

取混合對照品溶液，按照“2.1節(jié)”色譜條件，連續(xù)重復進樣6次，記錄色譜圖，測定其峰面積，5, 7-二羥基-4′-O-(6″-O-β-D-葡萄糖)-β-D-葡萄糖黃酮、異肥皂草苷、異葒草苷、牡荊苷、異牡荊苷、木犀草苷和大波斯菊苷峰面積的RSD分別0.80%、1.05%、0.74%、0.73%、0.91%、0.85%、0.76%，均不超過2%，結果表明色譜儀的精密度符合要求。

2.5 穩(wěn)定性試驗

制取一供試品溶液，在室溫下放置，按“2.1節(jié)”色譜條件，分別在0，2，4，6，8，12，24 h進樣分析，測定其峰面積。結果表明，7種黃酮苷成分在24 h內(nèi)穩(wěn)定，5, 7-二羥基-4′-O-(6″-O-β-D-葡萄糖)-β-D-葡萄糖黃酮、異肥皂草苷、異葒草苷、牡荊苷、異牡荊苷、木犀草苷和大波斯菊苷峰面積的RSD分別為1.35%, 0.80%, 0.73%, 0.73%, 0.91%, 0.85%, 0.76，均不超過2%，符合穩(wěn)定性要求。

2.6 重復性試驗

準確稱取菥蓂藥材樣品6份，每份1.0 g，依“2.2.2節(jié)”的方法操作，在“2.1節(jié)”色譜條件下測得菥蓂藥材中5, 7-二羥基-4′-O-(6″-O-β-D-葡萄糖)-β-D-葡萄糖黃酮平均含量為32.55 μg/mL，RSD為1.9 %;異肥皂草苷平均含量為77.21 μg/mL，RSD為1.3 %;異葒草苷平均含量為17.17 μg/mL，RSD為1.4 %;牡荊苷平均含量為12.56 μg/mL，RSD為1.5 %;異牡荊苷平均含量為12.56 μg/mL，RSD為1.6 %;木犀草苷平均含量為23.02 μg/mL，RSD為1.2 %;大波斯菊苷平均含量為17.57 μg/mL，RSD為1.5 %。說明重復性良好。

2.7 加樣回收率試驗

精密稱定已知含量的菥蓂藥材樣品9份，每份1.0 g，按低、中、高濃度分別加入1.0、2.0、3.0 mL的混合對照品溶液，每一濃度平行操作3次，按“2.2.2節(jié)”下的方法操作，在“2.1節(jié)”色譜條件下進行測定，記錄色譜圖測量峰面積，計算回收率，結果見表3。

表3 加樣回收率試驗結果(n=9)
Tab.3 Results of recovery test (n=9)

化合物回收率/%低中高平均回收率/%RSD/%5，7-二羥基-4′-O-(6″-O-β-D-葡萄糖)-β-D-葡萄糖黃酮964101998899027異肥皂草苷9721014101099823異葒草苷97399899798914牡荊苷974100099699014異牡荊苷972100299799116木犀草苷96899199898615大波斯菊苷97799699698911

2.8 樣品含量的測定

取3批菥蓂藥材，按“2.2.2節(jié)”的方法操作，制備供試品溶液并在上述色譜條件下進行測定，每份平行測定3次，采用外標法分別計算菥蓂藥材樣品中5, 7-二羥基-4′-O-(6″-O-β-D-葡萄糖)-β-D-葡萄糖黃酮 (a)、異肥皂草苷 (b)、異葒草苷 (c)、牡荊苷 (d)、異牡荊苷 (e)、木犀草苷 (f)和大波斯菊苷 (e)的含量。標準品和供試品液相譜分別如圖1和圖2所示。結果表明，5, 7-二羥基-4′-O-(6″-O-β-D-葡萄糖)-β-D-葡萄糖黃酮平均含量為0.65 mg/g，異肥皂草苷平均含量為1.34 mg/g，異葒草苷平均含量為0.34 mg/g，牡荊苷平均含量為0.25 mg/g，異牡荊苷平均含量為1.57 mg/g，木犀草苷平均含量為0.46 mg/g，大波斯菊苷平均含量為0.35 mg/g。

圖1 混合對照品液相色譜圖

Fig.1 Chromatograms of the mixture of standards

圖2 供試樣品液相色譜圖

Fig.2 Chromatograms of the sample

3 討 論

3.1 提取方法

文獻[16-17]中，分別使用50%甲醇和80%甲醇作為提取溶劑進行提取，使用高效分析液相對提取液進行分析，結果表明，使用20倍量的80%甲醇回流提取1 h,總黃酮含量較高，可見選擇該方法為最佳提取方法。

3.2 流動相系統(tǒng)

考察了甲醇—水、乙腈—水、甲醇-0.05%磷酸水溶液及乙腈-0.04%冰醋酸水溶液流動相系統(tǒng)，結果顯示，采用乙腈-0.04%冰醋酸水溶液系統(tǒng)為流動相時所得到的色譜圖基線平穩(wěn)，7種黃酮苷的分離效果較好，因此，選擇乙腈-0.04%冰醋酸水進行梯度洗脫。

3.3 檢測波長的選擇

圖3 紫外全波長掃描Fig.3 The results of UV wavelength scanning

取上述7種黃酮類成分的混合對照品進行紫外全波長掃描，結果如圖3所示，273 nm處有最大吸收峰，故選擇273 nm作為檢測波長進行測定，各成分均能得到較好的響應值。

3.4 結果分析

采用本文建立的RP-HPLC法對菥蓂藥材中7種黃酮苷成分的含量進行同時測定，結果如圖2、圖3所示，表明廣西壯族自治區(qū)柳州花紅藥業(yè)股份有限公司所提供的菥蓂藥材中7種黃酮苷成分的平均含量由高到低依次為異牡荊苷、異肥皂草苷、5, 7-二羥基-4′-O-(6″-O-β-D-葡萄糖)-β-D-葡萄糖黃酮、木犀草苷、大波斯菊苷、異葒草苷。其中，異牡荊苷和異肥皂草苷在菥蓂藥材中含量較高。

3.5 結 論

針對菥蓂藥材中主要含有的7種黃酮苷類單體化合物，本研究首次建立了相應RP-HPLC法對其含量進行同時測定。該方法重復性好，準確快速，可為菥蓂藥材的質(zhì)量控制提供重要參考。

[1] 中國科學院中國植物志編輯委員會.中國植物志: 33卷[M]. 北京: 科學出版社，2005: 80-81.

[2] 南京中醫(yī)藥大學.中藥大辭典(上下冊)[M]. 上海: 上?？萍汲霭嫔? 2006: 1985-1994.

[3] 林珊如,尹貸旭.扶正祛邪治療慢性子宮內(nèi)膜炎40例療效觀察[J]. 福建中醫(yī)藥, 1998, 29(2): 11-11.

[4] 楊榮平,鐘國躍,張麗，等.治療痛風的藥物組合物及其制備方法和用途: 中國, CN102626444A[P]. 2012-08-08.

[5] 彭妹,龐麗,張艷華,等.花紅片中七種中草藥抗氧化活性研究[J]. 廣西大學學報(自然科學版), 2013, 38(3): 554-558.

[6] PEDRAS M S C, CHUMALA P B, SUCHY M.Phytoalexins fromThlaspiarvenseL, a wild crucifer resistant to virulent leptosphaeria maculans: structures, syntheses and antifungal activity[J]. Phytochemistry, 2003, 64: 949-956.

[7] 江南,曾瑾,清源,等.寨卡提取物體外對人結腸癌細胞凋亡的誘導作用及其作用機制研究[J]. 時珍國醫(yī)國藥, 2009, 20(10): 2605-2608.

[8] 俸婷婷,謝體波,林冰,等.桑白皮總黃酮的鎮(zhèn)痛抗炎藥理作用研究[J]. 時珍國醫(yī)國藥,2013,24(11):2580-2582.

[9] HARNAFI H, AMRANI S.Flavonoids as potent phytochemicals in cardiovascular diseases prevention[J]. Pharmacognosy Reviews.2007, 1(2): 193-202.

[10]SOFIA C, MONICA R, GARCIA R, et al.Supercritical fluid extraction of antioxidant compounds from oregano: chemical and functional characterization via LC-MS and in vitro assays[J]. The Journal of Supercritical Fluids, 2006, 38(1): 62-69.

[11]HOU Q, SUN X N, HOU L Z, et al.Molecular mechanism of daidzein-induced MCF-7 apoptosis in mammary cancer[J]. Journal of Clinical Rehabilitation, 2006, 10(11): 117-119.

[12]成日青,錢宇,郭慧卿,等.菥蓂子總黃酮含量的測定[J]. 中國中醫(yī)藥科技, 2012, 19(5): 430-431.

[13]于金英,王云紅,劉國強,等.HPLC-ESI-MS/MS分析鑒定菥蓂中黃酮類成分[J]. 中成藥, 2015, 37(3): 556-561.

[14]龐賽,王立升,史新,等.菥蓂藥材中異牡荊苷的分離鑒定及指紋圖譜研究[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學, 2012, 39(1): 105-107.

[15]李曉英,陳佳正,張?zhí)K陽,等.HPLC測定十三味菥蓂丸中的大葉茜草素[J]. 華西藥學雜志,2012,27(2):198-199.

[16]甘秀海,梁志遠,趙超,等.RP-HPLC同時測定冷水花屬3 種植物中2 種黃酮苷的含量[J]. 云南大學學報(自然科學版), 2015, 37(1): 129-133.

[17]逢楠楠,畢開順,閏寶慶,等.RP-HPLC法同時測定蕪花藥材中種黃酮類成分的含量[J]. 藥物分析雜志,2010,30(4): 633-637.

(責任編輯 張曉云 裴潤梅)

Simultaneous determination of seven flavonoids in Thlaspi arvense L.by RP-HPLC

CHENG Li-yuan1, LIANG Yong2, LUO Xuan1, LIU Xu1, YANG Hua1, WANG Li-sheng1

(1.School of Chemistry and Chemical Engineering, Guangxi University, Nanning 530004, China;2.Nanning Jiaoyang Pharmaceutical Technology Co., Ltd., Nanning 530003, China)

A RP-HPLC method for simultaneous determination of 5, 7-dihydroxy-flavone-4′-(6″-O-β-D-glucopyranoside)-O -β-D-glucopyranoside, isosaponarin, isoorientin, vitexin, isovitexin, luteolin-7-O-β-D-glucoside and apigenin-7-O-β-D-glucoside inThlaspiarvenseL was established. The separation was performed on an Agilent C18column (4.6×150 mm, 3.5 μm) with a gradient elution composed of acetonitrile and 0.4% acetic acid aqueous solution. The column temperature was set at 35 ℃, and the flow rate was 1.0 mL/min. The detective wavelength was set at 273 nm. The results indicated that the linear range was 5.67～56.7 μg/mL (r=0.999 7)，10.92～109.2 μg/mL (r=0.999 4)，5.76～57.6 μg/mL (r=0.999 8)，4.92～49.2 μg/mL (r=0.999 8)，13.95～139.5 μg/mL (r=0.999 9)，5.25～52.5 μg/mL (r=0.999 8)，and 5.22～52.2 μg/mL (r=0.999 7), respectively (n=6). The average recoveries (n=3) of seven flavonoids were 97%～101%, and the RSDs were less than 2.7%. The method is simple, rapid, accurate and reproducible, and can be effectively used for the quality control ofThlaspiarvenseL.

ThlaspiarvenseL; RP-HPLC; flavonoids;simultaneous determination

2016-05-17；

2016-06-27

廣西自然科學基金重點項目(2010GXNSFD013040); 廣西科技攻關項目(桂科攻11107010-3-5)

王立升(1965—)，男，黑龍江湯原人，廣西大學教授；E-mail: w_lsheng@163.com。

程麗媛，梁勇，羅軒，等.RP-HPLC法同時測定菥蓂藥材中7種黃酮苷的含量[J].廣西大學學報(自然科學版)，2016，41(6)：2053-2059.

10.13624/j.cnki.issn.1001-7445.2016.2053

R917

A

1001-7445(2016)06-2053-07