前列腺素E2誘導前列腺間質細胞肌成纖維細胞表型轉化和白細胞介素-8的表達

田亞瓊，張 琚，彭雁飛，劉樹業(yè)△

(1.天津市第三中心醫(yī)院檢驗科 300170；2.南開大學生物活性材料教育部重點實驗室,天津 300071；3.天津中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合學院生物化學教研室，天津 300193)

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·論 著·

前列腺素E2誘導前列腺間質細胞肌成纖維細胞表型轉化和白細胞介素-8的表達

田亞瓊1，張 琚2，彭雁飛3，劉樹業(yè)1△

(1.天津市第三中心醫(yī)院檢驗科 300170；2.南開大學生物活性材料教育部重點實驗室,天津 300071；3.天津中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合學院生物化學教研室，天津 300193)

目的 探討前列腺素E2(PGE2)在前列腺間質活化過程中的作用。方法 體外培養(yǎng)人前列腺間質細胞人正常前列腺基質永生化細胞(WPMY-1)，用二甲基亞砜(DMSO)和10-9mol/L前列腺素E2(PGE2)處理后進行免疫熒光染色，檢測肌成纖維細胞表型的變化。實時定量聚合酶鏈反應(PCR)檢測細胞中炎性因子白細胞介素-8(IL-8)的表達，并測定IL-8的濃度。結果 PGE2顯著增加WPMY-1細胞中α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)和波形蛋白共定位的細胞比例。PGE2促進WPMY-1細胞中IL-8的表達。結論 PGE2能增加體外培養(yǎng)的WPMY-1肌成纖維細胞表型，促進IL-8的表達，在前列腺癌發(fā)生、發(fā)展中具有重要的作用。

間質細胞活化； 熒光染色； 成纖維細胞表型

上皮細胞轉變成活化的間質細胞[1]，活化間質在前列腺上皮內瘤(PIN)組織中出現，表現出波形蛋白和α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)共定位的肌成纖維細胞表型[2]。從前列腺癌組織中分離出的活化間質細胞與良性前列腺增生的上皮細胞系BPH-1在裸鼠體內重構能夠誘導出前列腺癌，而從正常前列腺組織中分離的間質細胞沒有這個作用，表明活化的間質細胞能促進前列腺癌發(fā)生[3]?；罨拈g質細胞能夠分泌胰島素樣生長因子-1(IGF-1)和肝細胞生長因子(HGF)促進癌細胞增殖和侵襲[4]，分泌CXCL12促進血管生成和癌細胞遷移[5]，分泌白細胞介素(IL)-6促進上皮細胞增殖[6]。

與正常組織相比，前列腺癌和PIN組織中環(huán)氧合酶-2(COX-2)的表達升高[7]，其產物PGE2在前列腺癌組織中的表達顯著升高[8]。PGE2能夠促進PIN細胞和癌細胞的增殖以及血管形成[9-11]，也通過PI3K/Akt/mTOR信號通路介導癌細胞的遷移和侵襲[12]。研究發(fā)現PGE2能夠通過誘導前列腺間質細胞旁分泌基質衍生因子-1(SDF-1)從而促進癌細胞的遷移[13]，提示PGE2可能誘導間質細胞活化。文獻報道，IL-8能夠促進前列腺間質細胞的活化，增加α-SMA和波形蛋白共定位的肌成纖維細胞的表型[14]。本研究檢測了PGE2對人正常前列腺基質永生化細胞(WPMY-1)中IL-8表達和肌成纖維細胞表型的調節(jié)，結果表明，PGE2能夠促進IL-8的mRNA和蛋白表達，同時發(fā)現PGE2能夠顯著增加共表達α-SMA和波形蛋白的細胞比例。

1 材料與方法

1.1 材料 人前列腺間質細胞WPMY-1 購自美國模式菌種收集中心(ATCC)。

1.2 試劑 改良杜氏伊格爾(DMEM)培養(yǎng)液，購于美國Sigma公司；5%胎牛血清，購于美國Invirogen公司；PGE2，購于美國Cayman Chemical公司；α-SMA抗體，購于北京博奧森公司；Vimentin，購于武漢博士德公司；熒光二抗Alexa Fluor?488 驢抗兔IgG(H+L)及Alexa Fluor?594 驢抗小鼠IgG(H+L)，購于美國Invitrogen公司；M-MLV反轉錄試劑盒，購于美國Promega公司；UltraSYBR Mixture，購于北京康為世紀公司；人IL-8引物，購于生工生物工程(上海)股份有限公司；酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒，購于武漢博士德公司。

1.3 實驗設備 熒光實時定量聚合酶鏈反應(PCR)儀，購于美國MJ Research公司；倒置熒光顯微鏡，購于Nikon公司；紫外光可見光分光光度計，購于Pharmacia公司。

1.4 方法

1.4.1 細胞培養(yǎng)人前列腺間質細胞WPMY-1使用含有5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4.2 免疫熒光染色將體外培養(yǎng)的WPMY-1細胞種植在直徑為1.5 cm的圓玻璃片上，細胞貼壁后，換成含有1%活性炭處理血清繼續(xù)培養(yǎng)36 h，分別使用DMSO和10-9mol/L PGE2處理細胞96 h。預冷的丙酮固定細胞后使用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，再用含有10%胎牛血清的PBS封閉。α-SMA抗體和Vimentin用來孵育細胞玻片，熒光二抗為Alexa Fluor?488驢抗兔IgG(H+L)及Alexa Fluor?594驢抗小鼠IgG(H+L)。

1.4.3 實時定量PCR檢測細胞中IL-8的表達將體外培養(yǎng)的WPMY-1種植在6孔板中，細胞貼壁后，換成含有1%活性炭處理血清繼續(xù)培養(yǎng)36 h，分別使用二甲基亞砜(DMSO)和10-9mol/L PGE2處理細胞24 h。Trizol法提取細胞總RNA，對RNA進行反轉錄，進行實時定量聚合酶鏈反應(PCR)檢測。人IL-8引物上游序列：5′-CTC TGG CAG CCT TCC TGA TT-3′;下游序列:5′-TAT GCA CTG ACA TCT AAG TTC TTT AGC-3′。

1.4.4 條件培養(yǎng)液中IL-8濃度的測定將體外培養(yǎng)的WPMY-1種植在6孔板中，細胞貼壁后，換成含有1%活性炭處理血清繼續(xù)培養(yǎng)36 h，分別使用DMSO和10-9mol/L PGE2處理細胞48 h。收集各孔細胞的條件培養(yǎng)液，并對每孔細胞進行計數。檢測條件培養(yǎng)液中IL-8的濃度，并根據細胞數計算同等細胞數IL-8 分泌的差別。

2 結 果

2.1 PGE2增加體外培養(yǎng)的WPMY-1肌成纖維細胞表型 體外培養(yǎng)的WPMY-1,分別種植在6張圓玻璃片上,1%活性炭血清處理36 h后，分別用DMSO和10-9mol/L PGE2處理WPMY-196 h，通過α-SMA(綠色熒光)和Vimentin(紅色熒光)的表達檢測細胞表型的變化，該實驗重復3次，每張圓片隨機選取5個視野，使用熒光顯微鏡進行拍照分析。結果表明，PGE2顯著增加WPMY-1中α-SMA和Vimentin共定位的細胞比例。

2.2 PGE2促進WPMY-1細胞中IL-8的表達 將體外培養(yǎng)的WPMY-1細胞分別種植在兩個6孔板中，1%活性炭血清培養(yǎng)36 h后，每板中3個孔作為對照組，3個孔用10-9mol/L PGE2處理，24 h后提取總RNA，在48 h后收集兩組細胞的條件培養(yǎng)液并細胞計數。通過實時定量PCR檢測兩組細胞中IL-8 mRNA相對持家基因HpRT的表達量，用2-ΔΔCT方法進行計算，結果表明PGE2能夠上調WPMY-1細胞中IL-8的表達。同時，ELISA分析顯示PGE2處理的WPMY-1細胞的條件培養(yǎng)液中IL-8蛋白的濃度顯著高于DMSO處理組。見圖1。

注：A為PGE2處理WPMY-1細胞24 h后；B為PGE2處理WPMY-1細胞48 h后。與對照組比較，*P<0.05；**P<0.01。

圖1 WPMY-1細胞中IL-8 mRNA的表達和IL-8蛋白的濃度

3 討 論

腫瘤微環(huán)境是近十年來發(fā)展最快的研究領域之一，越來越多的證據表明前列腺癌的發(fā)展很大程度上依賴于其所處的微環(huán)境。前列腺間質細胞在前列腺癌發(fā)生、發(fā)展的過程中轉變?yōu)轭愃朴趽p傷修復過程中出現的肌成纖維細胞表型，因此也有學者將癌癥稱為永不愈合的損傷。癌間質中的肌成纖維細胞也被稱為癌相關成纖維細胞(CAF)，通過旁分泌細胞因子和炎癥因子構建適合癌細胞生長和有利于免疫逃逸的微環(huán)境，因此可作為癌癥治療中的有效靶標?；罨g質細胞的確切來源目前還不是十分清楚，其主要來源被認為是由病灶周圍正常的成纖維細胞通過間質-間質轉化(MMT)轉變?yōu)榫哂屑〕衫w維細胞表型的活化間質細胞[15]。間質細胞活化的機制還不完全清楚，文獻表明轉化生長因子β(TGF-β)、IL-6和IL-8是介導前列腺間質細胞活化的關鍵因子[14,16-17]。

PGE2是COX-2催化花生四烯酸產生的一種重要物質，能夠通過與細胞膜受體的結合激活下游信號通路，引起細胞生理改變，COX-2/PGE2信號通路在介導炎性反應和癌癥進程中起到關鍵作用。然而，COX-2/PGE2信號通路與CAF的關系仍不清楚，研究表明，PGE2能夠誘導體外培養(yǎng)的前列腺間質細胞WPMY-1中IL-8的表達，并且能夠誘導WPMY-1細胞轉變?yōu)榧〕衫w維細胞。這一結果表明，前列腺癌中高表達的COX-2，可以通過局部PGE2濃度的升高誘導前列腺間質細胞的活化，并且IL-8可能參與介導了這一過程。

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Prostaglandin E2 induced myofibrolast phenotype inversion and interleukin 8 expression in prostate stromal cells

TIANYaqiong1,ZHANGJu2,PENGYanfei3,LIUShuye1△

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,TianjinMunicipalThirdCentralHospital,Tianjin300170,China;2.KeyLaboratoryofBioactiveMaterialsofEducationMinistry,NankaiUniversity,Tianjin300071,China;3.TeachingandResearchSectionofBiochemistry,ChineseandWesternMedicineInstituteTianjinChineseMedicineUniversity,Tianjin300193,China)

Objective To investigate the effects of prostaglandin E2(PGE2) in prostate mesenchymal cell activation.Methods To culture human prostate stromal cells WPMY-1 in vitro,implement immunofluorescence staining after treating with DMSO and 10-9mol/L PGE2 and detect the change of the myofibroblast phenotype.The expression of cellular inflammatory factor interleukin 8(IL-8) was detected by real-time quantitative PCR and the concentration of IL-8 was detected.Results PGE2 significantly increased the cellular proportion of colocalization with alpha SMA and Vimentin in WPMY-1 cells.PGE2 promoted the expression of IL-8 in WPMY-1 cells.Conclusion PGE2 can increase myofibroblast phenotype in human prostate mesenchymal cells WPMY-1 in vitro culture,promotes the IL-8 expression,which has an important role in the occurrence and development of prostate cancer.

mesenchymal cell activation; immunofluorescence staining; myofibroblast phenotype

田亞瓊，女，技師，主要從事代謝組學以及分子生物學的研究?！?/p>

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.23.023

A

1673-4130(2016)23-3300-03

2016-04-28

2016-07-12)