TmAFP抗凍蛋白與冰面結(jié)合的穩(wěn)定因素的研究

李 鵬，王 巖

(石河子大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，新疆 石河子 832000)

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TmAFP抗凍蛋白與冰面結(jié)合的穩(wěn)定因素的研究

李 鵬，王 巖*

(石河子大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，新疆 石河子 832000)

抗凍蛋白能特異的結(jié)合到冰晶的表面，抑制冰晶的生長和聚合，從而保護(hù)有機(jī)體不受大冰晶的傷害。基于蛋白質(zhì)與冰晶之間的結(jié)構(gòu)匹配關(guān)系和識(shí)別行為的研究，抗凍蛋白與冰面結(jié)合的相對(duì)穩(wěn)定，依靠抗凍蛋白的特定氨基酸序列組成的空間結(jié)構(gòu)恰好與冰面的空間結(jié)構(gòu)能良好的相互匹配，并且又通過氫鍵作用，使抗凍蛋白與冰面結(jié)合得更加穩(wěn)定，從而使蛋白質(zhì)與冰面結(jié)合不易脫落。

昆蟲；抗凍蛋白；空間結(jié)構(gòu)匹配；氫鍵；穩(wěn)定

0 引言

抗凍蛋白(antifreeze protein，AFP)是Devries發(fā)現(xiàn)南極硬骨魚體內(nèi)有抗冷凍物質(zhì)時(shí)提出的概念[1]，抗凍蛋白的另一名字是熱滯蛋白，是有機(jī)體為適應(yīng)過冷環(huán)境，在體內(nèi)生成的一類蛋白質(zhì)[2]?？箖龅鞍拙哂泻芨叩目箖龌钚裕词乖谳^低的濃度下也會(huì)產(chǎn)生高效的抗凍活性，比較乙二醇、NaCl等化學(xué)抗凍試劑時(shí)，生物抗凍物質(zhì)的抗凍活性要高出20～500倍，從而使有機(jī)體具有更高的防凍性能[3]?？箖龅鞍卓捎糜陂L期保存細(xì)胞[4]?，F(xiàn)今已在細(xì)菌、植物體、昆蟲、魚類等體內(nèi)發(fā)現(xiàn)眾多種抗凍蛋白[5,6]?？箖龅鞍椎淖饔迷砘臼窍嗤腫7-10]，抗凍蛋白與冰面結(jié)合，來抑制冰晶的生長速率和冰晶的重聚合。

昆蟲抗凍蛋白主要包括甲蟲(Dendroides canadensis AFP，DcAFP)、云杉卷夜蛾(Choristoneura Fumiferana AFP，CfAFP)和黃粉蟲(Tenebrio molitor AFP，TmAFP)。昆蟲抗凍蛋白的分子量大都在7～20kDa之間，昆蟲抗凍蛋白可以把水的凝結(jié)點(diǎn)降低5℃左右，而魚類抗凍蛋白只能把水凝結(jié)點(diǎn)降低1.4℃左右，昆蟲抗凍蛋白比大多數(shù)已發(fā)現(xiàn)的其它抗凍蛋白的活性都要強(qiáng)[11]。

冰晶中存在很多種不同結(jié)構(gòu)的冰面[12]。不同的冰面有不同的晶格參數(shù)和氧原子排列方式，不同的生物能產(chǎn)生不同的抗凍蛋白來適應(yīng)不同的冰面結(jié)構(gòu)，不同的冰面也就會(huì)被不同的抗凍蛋白所結(jié)合[13,14]。

黃粉甲抗凍蛋白(TmAFP)，每個(gè)單體的分子量為8.4kDa。它是一種富含半胱氨酸和蘇氨酸的凈百個(gè)氨基酸殘基的抗凍蛋白[15]。它是具有右手平行β螺旋結(jié)構(gòu)的小分子蛋白質(zhì)，并且蛋白質(zhì)分子中還有多個(gè)二硫鍵。它的β螺旋結(jié)構(gòu)是由12個(gè)連續(xù)重復(fù)的氨基酸殘基(TCTXSXXCXXAX)[16](C-半胱氨酸，T-蘇氨酸，S-絲氨酸，A-丙氨酸)組成7股螺旋折疊呈柱狀，在螺旋的一側(cè)，由三個(gè)保守氨基酸殘基T-C-T形成一個(gè)非常有規(guī)則的平坦β層面。在TCT面上，T羥基上的氧原子都指向環(huán)外，而C的殘基指向環(huán)內(nèi)構(gòu)成8個(gè)二硫鍵，維持著分子的形態(tài)(見圖1a)。

(a)螺旋內(nèi)的黃顏色的短線就是二硫鍵，該圖也表示在沒改變氨基酸的初始結(jié)構(gòu)(綠紅色表示蘇氨酸)；(b)表示一個(gè)蘇氨酸突變?yōu)槔野彼?紅色箭頭指的是酪氨酸)圖1 氨基酸結(jié)構(gòu)Fig.1 The structure of amino acid

1 結(jié)合面的測定

科學(xué)家們假設(shè)了TmAFP的TCT面是與冰面的結(jié)合面，并且采用定位突變技術(shù)[17]。將TmAFP的β片層面中的T(蘇氨酸)變?yōu)閅(酪氨酸)(見圖1b)或?qū)(蘇氨酸)變?yōu)長(亮氨酸)結(jié)果表明：將T(蘇氨酸)變?yōu)閅(酪氨酸)，抗凍蛋白活性降低約90%。說明Y(酪氨酸)大的空間結(jié)構(gòu)阻礙了冰面與其他殘基的結(jié)合從而使蛋白質(zhì)的活性降低，而將T(蘇氨酸)變?yōu)閅(酪氨酸)，抗凍蛋白活性只降低了25%。由此說明TmAFP抗凍活性與β片層中的氨基酸殘基的體積大小有關(guān)[18,19]。

通過誘變，證實(shí)了科學(xué)家的假設(shè)：TmAFP的TCT面就是蛋白質(zhì)與冰相互作用的結(jié)合面。

2 TmAFP與冰面的相互作用

2.1 TmAFP與冰面相互識(shí)別

TmAFP的結(jié)合面與冰面的結(jié)合面有很高的相似性，所以二者能很好的相互識(shí)別，這一點(diǎn)在“冰蝕”實(shí)驗(yàn)中完美的揭示了這一觀點(diǎn)[20]，這個(gè)觀點(diǎn)也已被科學(xué)家們認(rèn)可。此圖(見圖2a)是TmAFP與其結(jié)合的冰面模型，冰{0100}冰面為TmAFP的冰最佳約束面，構(gòu)建抗凍蛋白與冰的作用體制[12]。

冰晶中的氧原子是被固定了的，所以跟蹤蛋白質(zhì)蘇氨酸羥基上的氧原子之間的距離變化，可以反映出蛋白質(zhì)與冰晶之間的結(jié)構(gòu)匹配關(guān)系和識(shí)別行為[21]。

先對(duì)TmAFP的同一側(cè)相鄰兩股螺旋的蘇氨酸上的氧原子間的距離進(jìn)行跟蹤分析，位于同一側(cè)相鄰的第4股和第5股螺旋上蘇氨酸羥基上的氧原子O453-O600(氧原子后的數(shù)字表示氧原子的位置如圖2b，下同)之間的距離進(jìn)行跟蹤分析，從500Ps動(dòng)態(tài)過程中的變化情況來看，O453-O600之間的平均距離基本保持在4.55?左右(見圖3a)；同樣分析O283-O453之間的平均距離在4.39?左右；O600-O766的平均距離為4.76?。由于氧原子之間的距離是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的過程，所以相鄰兩個(gè)氧原子之間的距離與冰晶延a軸方向上兩氧原子之間的距離基本維持在4.5?，說明TmAFP在冰面a軸方向上具有良好的匹配性。

在對(duì)TmAFP同一個(gè)環(huán)上的蘇氨酸羥基氧原子之間的距離變化作分析，以第5股螺旋相鄰兩個(gè)蘇氨酸羥基氧原子O600-O624之間的距離為例(見圖3b)，從500Ps動(dòng)態(tài)過程中的變化情況來看，O600-O624之間的平均距離在7.44?左右，同理O283-O307，O453-O477，O766-O790的平均距離分別為6.69?，7.07?，7.13?。由于氧原子之間的距離是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的過程，所以相鄰兩個(gè)氧原子之間的距離與冰晶延c軸方向上兩氧原子之間的距離基本維持在7.35?。以上說明TmAFP的結(jié)合面在冰面c軸方向上有很好的匹配能力。

圖2 (a)左側(cè)顯示的是TmAFP在冰面的結(jié)合類型，右側(cè)是描述空間的坐標(biāo)系；(b)標(biāo)示了蘇氨酸殘基上的氧原子的位置Fig.2 (a) Left image shows the ice TmAFP binding type, the right is to describe the spatial coordinate system; (b) Icon showing the location of the oxygen atoms of the threonine residues

圖3 (a)O453-O600之間的距離隨時(shí)間的變化圖；(b)O600-O624之間的距離隨時(shí)間的變化圖。橫軸表示時(shí)間(ps)，縱軸表示距離(?)Fig.3 The distance between the O453-O600 at any time (a); The distance between the O600-O624 with the time changed. The horizontal axis represents time (ps), the vertical axis represents the distance (?)

進(jìn)一步跟蹤TCT面上4個(gè)氨基酸羥基上的氧原子O453-O600-O624-O477組成的平面發(fā)現(xiàn)，這4個(gè)氧原子組成的平面始終在0°左右震蕩，說明在水溶液中TmAFP的蘇氨酸殘基基本保持在同一平面上。通過跟蹤監(jiān)測對(duì)TmAFP與冰面的識(shí)別特性分析，TmAFP的TCT面與冰面形成了很好的結(jié)構(gòu)匹配，這樣的匹配有利于它們的相互作用(氫鍵，范德華力)更加穩(wěn)定進(jìn)行。

2.2 抗凍蛋白與冰面結(jié)合產(chǎn)生相互作用力[22]

Devries提出了“氫鍵匹配”模型[23]。在這個(gè)特異的冰晶結(jié)合棱面被認(rèn)證后[14]，發(fā)現(xiàn)這種“氫鍵匹配”模型也可適用于一些其它的冰晶表面上[23]。

Knight是“晶格占有”模型的提出者[17]，他是在Devries的基礎(chǔ)上演變來的，AFPs中的部分基團(tuán)“占有”了冰晶表面上的位置，從而與臨近的水分子能形成更多的氧鍵，可以使得氫鍵的數(shù)量大大增加，繼而使AFPs與冰面之間形成了不可逆結(jié)合，變得更加穩(wěn)定。

TmAFP的TCT面與冰面發(fā)生相互作用時(shí)，蘇氨酸的殘基會(huì)與冰面形成氫鍵來穩(wěn)固蛋白質(zhì)與冰面的結(jié)合。由于蘇氨酸的殘基上有氫(-H)，羥基(-OH)，還有甲基(-CH3)，3種不同的基團(tuán)，所以就會(huì)有3種不同大小的鍵或力。

2.2.1 強(qiáng)氫鍵

由TmAFP接合面的蘇氨酸殘基的羥基上的氧原子與冰面中的水分子的氫原子形成氫鍵或蘇氨酸殘基的羥基上的氫原子與冰面中的水分子的氧原子形成氫鍵，像這一類的結(jié)合都屬于強(qiáng)氫鍵。按照重疊電荷密度值的大小，結(jié)合蛋白與冰面作用的幾何構(gòu)型，將滿足圖4A的結(jié)合方式找出。TmAFP與冰面的接合面上有9個(gè)蘇氨酸，所以就可以形成9個(gè)強(qiáng)的氫鍵，并算得強(qiáng)氫鍵電荷密度占整個(gè)體系的36.16%。

2.2.2 弱氫鍵

由TmAFP接合面中的蘇氨酸殘基的-CH上的氫與冰面中的水分子上的氧原子結(jié)合生成的氫鍵(見圖4B)。C478與冰晶上的氧Oice之間的距離為2.89?，鍵角為167°，說明C478-H485…Oice滿足形成氫鍵的條件。但是重疊電荷密度數(shù)值較小(0.003)，不足以形成強(qiáng)氫鍵，因此把這類氫鍵稱為弱氫鍵。計(jì)算得弱氫鍵電荷密度占整個(gè)體系的32.29%。

2.2.3 范德華力

由除了強(qiáng)弱氫鍵以外的相互作用稱為范德華作用力。蘇氨酸殘基上的甲基上的碳原子與冰面上水分子上的氧原子相互作用為范德華力(見圖4C)。計(jì)算得相互作用力占整個(gè)體系的31.55%。

TmAFP與冰面相互作用方式中，氫鍵占據(jù)主導(dǎo)作用。強(qiáng)弱氫鍵對(duì)整個(gè)體系相互作用貢獻(xiàn)了68.45%，而范德華力作用占31.55%。相互作用力的產(chǎn)生使冰面與TmAFP的結(jié)合變得穩(wěn)定。

圖4 抗凍蛋白與冰面的相互作用類型A圖表示蘇氨酸上的殘基中的羥基與冰面上的水分子的氫原子所生成的強(qiáng)氫鍵，記作C-O…Hice；B圖表示蘇氨酸的殘基中的氫原子與冰面上的水分子的氧原子所生成的弱氫鍵,記作C-H…Oice；C圖表示蘇氨酸的殘基中的甲基與冰面中的水分子氧原子產(chǎn)生的范德華力,記作C-C…Oice。Fig.4 The interaction diagram type between antifreeze proteins and ice indicatesA for antifreeze proteins and ice indicates strong hydrogen bonding hydrogen atoms of water molecules on threonine residues of the hydroxyl group with the ice generated, referred to as C-O…Hice. B for the representation of an oxygen atom of the water molecule threonine residues of hydrogen atoms with the ice generated by weak hydrogen bonds, referred to as C-H…Oice. C for the diagram showing threonine residues methyl Van der Waals forces with ice water molecule oxygen atoms produced, referred to as C-C…Oice.

3 總結(jié)

抗凍蛋白(TmAFP)分子在與冰面的相互作用過程中，TmAFP的與冰面有很高的匹配性，空間的匹配為TmAFP能與冰面形成氫鍵打下一個(gè)穩(wěn)定的基礎(chǔ)，氫鍵的形成使TmAFP的結(jié)合更加穩(wěn)定，這些都可以提高TmAFP與冰面結(jié)合的穩(wěn)定性，有效的提高了抗凍活性。

[1] DEVRIES A L,KOMATSU S K,FEENEY R E.Chemical and physical properties of freezing point-depressing glycoprotein from Antarctic fishes[J].J Biol Chem,1970,245(11):2901-2908.

[2] DENG C,CHENG C H C,YE H,et al.Evolution of an antifreeze protein by neofunctionalization under escape from adaptive conflict[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,2010,107(50):21593-21598.

[3] 張暉，張艷杰， 王立， 等. 抗凍蛋白在食品工業(yè)中的應(yīng)用現(xiàn)狀及前景[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2012，31(9)：897-903.

[4] ZACHARIASSEN K E,KRISTIANSEN E.Ice nucleation and antinucleation in nature[J].Cryobiology,2000,41(4):257-279.

[5] GILBERT J A,HILL P J,DODD C E,et al.Demonstration of antifreeze protein activity in Antarctic lake bacteria[J].Microbiology,2004,150(Pt 1):171-80.

[6] GRAETHER S P,SYKES B D.Cold survival in freeze-intolerant insects:the structure and function of beta-helical antifreeze proteins[J].European Journal of Biochemistry,2004,271(16):3285-3296.

[7] KRISTIANSEN E,ZACHARIASSEN K E.The mechanism by which fish antifreeze proteins cause thermal hysteresis[J].Cryobiology,2005,51(3):262-280.

[8] YEH Y,FEENEY R E.Antifreeze Proteins: Structures and Mechanisms of Function[J].Chemical Reviews,1996,96(2):601-617.

[9] EWART K V,LIN Q,HEW C L.Structure, function and evolution of antifreeze proteins[J].Cellular & Molecular Life Sciences Cmls,1999,55(2):271-283.

[10]謝文靜.第一類魚抗凍蛋白對(duì)冰晶生長界面層結(jié)構(gòu)的影響[D/OL].呼和浩特：內(nèi)蒙古大學(xué)，2011：66-76.(2012-06-23)[2016-05-25].http://xueshu.baidu.com/s?wd=paperuri%3A%28df160024ce8affef3e060a955c4c2528%29&filter=sc_long_sign&tn=SE_xueshusource_2kduw22v&sc_vurl=http%3A%2F%2Fwww.docin.com%2Fp-195710557.html&ie=utf-8&sc_us=9380004131514190095.

[11]YANG Z,ZHOU Y,LIU K, et al.Computational Study on the Function of Water within a β -Helix Antifreeze Protein Dimer and in the Process of Ice-Protein Binding[J].Biophysical Journal,2003,85(4):60.

[12]BRENT WATHEN,MICHAEL KUIPER,VIRGINIA WALKER A,et al.A new model for simulating 3-D crystal growth and its application to the study of antifreeze proteins[J].Journal of the American Chemical Society,2003,125(3):729-737.

[13]HOBBS P V.Ice physics[J].Oxford Clarendon Press,1974,1(11):71-72.

[14]GRAETHER S P,KUIPER M J,GAGNE S M,et al.Beta-helix structure and ice-binding properties of a hyperactive antifreeze protein from an insect[J].Nature,2000,406(6793):325-328.

[15]LIOU Y C,THIBAULT P,WALKER V K,et al.A complex family of highly heterogeneous and internally repetitive hyperactive antifreeze proteins from the beetle Tenebrio molitor[J].Biochemistry,1999,38(35):11415-11424.

[16]?KKES ATICI,NALBANTOGLU B.Antifreeze proteins in higher plants[J].Phytochemistry,2003,64(7):1187-1196.

[17]KNIGHT C A,DRIGGERS E,Al D V.Adsorption to ice of fish antifreeze glycopeptides 7 and X[J].Biophysical Journal,1993,64(1):252-259.

[18]DANIEL D,TYSHENKO M G,KUIPER M J,et al.Structure-function relationships in spruce budworm antifreeze protein revealed by isoform diversity[J].European Journal of Biochemistry,2000,267(19):6082-6088.

[19]MARSHALL C B,DALEY M E,GRAHAM L A,et al.Identification of the ice-binding face of antifreeze protein from Tenebrio molitor[J].Febs Letters,2002,529(2-3):261-267.

[20]HEW C L,WANG N C,JOSHI S,et al.Multiple genes provide the basis for antifreeze protein diversity and dosage in the ocean pout,Macrozoarces americanus[J].Journal of Biological Chemistry,1988,263(24):12049-12055.

[21]MADURA J D,BARAN K,WIERZBICKI A.Molecular recognition and binding of thermal hysteresis proteins to ice[J].Journal of Molecular Recognition,2000,13(2):101-113.

[22]劉愷.抗凍蛋白與冰晶相互作用本質(zhì)的理論研究[D/OL].北京：中國科學(xué)院理化技術(shù)研究所，2005：16-18. (2005-12-01)[2016-05-22]. http://xueshu.baidu.com/s?wd=paperuri%3A%28849d8f6d84207db8e96fc7ed598b9afc%29&filter=sc_long_sign&tn=SE_xueshusource_2kduw22v&sc_vurl=http%3A%2F%2Fd.wanfangdata.com.cn%2FThesis%2FY796887&ie=utf-8&sc_us=8082405857330202996.

[23]DEVRIES A L.Antifreeze peptides and glycopeptides in cold-water fishes[J].Annual Review of Physiology,1983,45(45):245-260.

Study on the stable factors of TmAFP antifreeze proteins combined with ice bound

LI Peng,WANG Yan*

(School of Medicine,Shihezi University,Shihezi,Xinjiang 832000,China)

Antifreeze proteins can specifically bind to the surface of ice crystals to inhibit the growth of ice crystals and inhibit polymerization of ice to protect the organism against large ice damage. On the basis of the study of the structure matching relation and recognition behavior between protein and ice crystals, antifreeze proteins combined with ice is relatively stable. The spatial structure of a particular amino acid sequence consisting of antifreeze protein can match exactly with the spatial structure of the ice, and then through hydrogen, the antifreeze protein combined with the ice surface can be more stable. So, the protein and won’t easily fall off the ice surface.

insects; antifreeze protein; the complementary spatial structure; hydrogen bonding; stability

1004—5570(2016)06-0088-05

2016-06-17

李 鵬(1997-)，男，研究方向：蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，E-mail:1343559619@qq.com.

*通訊作者：王 巖(1984-)，男，博士，副教授，研究方向：昆蟲分子生物學(xué)，E-mail:2272772511@qq.com.

TS201.2

A