維甲酸誘導(dǎo)成釉細(xì)胞瘤細(xì)胞分化的研究*

雷印濤 王旭霞 孫 鋼

(1.泰山醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院口腔科，山東 泰安 271000； 2.山東大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院口腔頜面外科，山東 濟(jì)南 250012；3.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院口腔頜面外科，浙江 杭州 310009)

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維甲酸誘導(dǎo)成釉細(xì)胞瘤細(xì)胞分化的研究*

雷印濤1王旭霞2孫 鋼3

(1.泰山醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院口腔科，山東 泰安 271000； 2.山東大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院口腔頜面外科，山東 濟(jì)南 250012；3.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院口腔頜面外科，浙江 杭州 310009)

目的 探討全反式維甲酸對成釉細(xì)胞瘤細(xì)胞分化的影響。方法 實(shí)驗(yàn)采用10-4M，10-5M，10-6M三種濃度梯度的全反式維甲酸對原代培養(yǎng)的成釉細(xì)胞瘤細(xì)胞進(jìn)行48小時(shí)，4天，5天，7天四個(gè)階段的體外誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)。利用MTT，流式細(xì)胞術(shù)和透射電鏡技術(shù)對細(xì)胞的增殖，細(xì)胞周期和凋亡的改變進(jìn)行檢測。結(jié)果 發(fā)現(xiàn)ATRA10-6M組作用5天效果最好，增殖抑制率31%，細(xì)胞S期減少13%，提高了靜止期細(xì)胞數(shù)，凋亡指數(shù)由初始細(xì)胞的8.7%升高到39.3%，細(xì)胞形態(tài)也發(fā)生相應(yīng)變化。結(jié)論 維甲酸可能促進(jìn)成釉細(xì)胞瘤細(xì)胞誘導(dǎo)分化的作用。

全反式維甲酸；成釉細(xì)胞瘤；分化

成釉細(xì)胞瘤作為最常見的牙源性腫瘤,具有局部浸潤性生長等惡性腫瘤的特征，屬臨界腫瘤，但罕見轉(zhuǎn)移，多見于青壯年，目前主要治療手段是外科治療，手術(shù)切除后復(fù)發(fā)率較高，這與其生長方式有關(guān)，為了減少復(fù)發(fā)，常常需要擴(kuò)大切除范圍，給患者的容貌和口腔功能造成很大的破壞。因此有必要從其發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)基礎(chǔ)上進(jìn)行深入研究，認(rèn)識疾病機(jī)制，探索新的有效防治方法。維甲酸具有調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞生長、分化的功能，通過細(xì)胞核內(nèi)DNA結(jié)合蛋白調(diào)節(jié)有關(guān)基因的表達(dá)而發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。臨床上常用于粘膜、皮膚病的治療。國內(nèi)外學(xué)者應(yīng)用其進(jìn)行了大量的細(xì)胞誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)，包含干細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、上皮細(xì)胞、成骨細(xì)胞，以及牙周膜細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和成釉細(xì)胞等諸多方面，取得了滿意的效果[1-4]。成釉細(xì)胞瘤細(xì)胞是上皮細(xì)胞，類似于幼稚的未成熟的前成釉細(xì)胞和星網(wǎng)狀層細(xì)胞，分化水平保持在牙胚發(fā)育的帽狀期/鐘狀期，具備向正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化的潛能。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用全反式維甲酸誘導(dǎo)成釉細(xì)胞瘤分化，檢測其生物學(xué)性狀的變化。

1 材料與方法

1.1 原代培養(yǎng)成釉細(xì)胞瘤細(xì)胞，選取第二代細(xì)胞

1.1.1 在超凈工作臺內(nèi)將取材標(biāo)本在雙抗瓶中取出，放入無血清的培養(yǎng)基中5 min，將組織塊剪成小塊，直至成0.5 mm2大小為止。加入4.5 ml含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，加0.5 mlⅠ型膠原酶(2000 u/ml)，蓋好橡膠塞，放在37 ℃水浴中消化4 h，用吸管反復(fù)吹打，使大部分組織塊自然下沉，然后將細(xì)胞懸液移入消毒的離心管中，離心1000 r/min 8 min，吸去上清，加入6 ml DMEM培養(yǎng)基，吹打混勻，取樣計(jì)數(shù)。

1.1.2 接種培養(yǎng) 用Ⅰ型膠原鋪底的25 ml培養(yǎng)瓶接種1 ml細(xì)胞懸液，加4 ml 培養(yǎng)液，蓋緊瓶塞，放入37 ℃ 5% CO2恒溫恒濕箱中孵育。培養(yǎng)3天后觀察，5天換液，以后每隔3天換一次培養(yǎng)液，同時(shí)每天觀察細(xì)胞形態(tài)，有無污染。

1.1.3 細(xì)胞傳代培養(yǎng) 加入5滴0.25%胰蛋白酶，轉(zhuǎn)動培養(yǎng)瓶，使其侵過整個(gè)瓶底，室溫下放置3 min，反轉(zhuǎn)瓶子，觀看細(xì)胞單層，如出現(xiàn)小孔狀間隙，再消化1 min。加入3 ml培養(yǎng)液中止消化，用吸管吸取培養(yǎng)液反復(fù)沖擊瓶底的細(xì)胞層，直至細(xì)胞全部被沖下，再輕輕吹打混勻，制成單細(xì)胞懸液，然后吸取1 ml懸液加入新的25 ml培養(yǎng)瓶中。原瓶留下1 ml細(xì)胞懸液，并向每個(gè)瓶中加培養(yǎng)液5 ml，蓋好瓶塞，放入37 ℃恒溫箱中孵育。

1.1.4 光鏡下觀察，免疫組化研究(免疫組織化學(xué)SABC法)進(jìn)行角蛋白CK-18,CK-19、波形蛋白、bcl-2抗體的免疫組化實(shí)驗(yàn)。

1.2 誘導(dǎo)分化后的形態(tài)學(xué)觀察 用含體積分?jǐn)?shù)為0.1%的無水乙醇的DMEM對照液將全反式維甲酸(ATRA)稀釋成10-4，10-5，10-6mol/L(M)濃度后，加入已培養(yǎng)24 h的細(xì)胞培養(yǎng)液中，分別于48 h、4天，5天，7天，在倒置相差顯微鏡下觀察實(shí)驗(yàn)組和對照組腫瘤細(xì)胞的形態(tài)變化。

1.3 MTT法檢測細(xì)胞抑制率

1.3.1 實(shí)驗(yàn)組分別加入終濃度10-4、10-5、10-6mol/L三種不同濃度去全反式維甲酸。對照組加入DMEM(含體積分?jǐn)?shù)為0.1%的無水乙醇)。加藥后2、4、5、7 天各取一板,每孔加入(5 mg/ml)的四甲基偶氮唑鹽(MTT)20 μl, 150 μl的二甲亞砜(DMSO) 。酶聯(lián)免疫檢測儀檢測，波長為570 nm，測定各孔光吸收值，記錄結(jié)果。

1.3.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn) 應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，計(jì)量資料描述用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P≤0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測 根據(jù)MTT檢測結(jié)果，選擇最高和最低濃度組進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。第二代細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中加入終濃度10-4M、10-6M兩種不同濃度全反式維甲酸，對照組加入DMEM(含體積分?jǐn)?shù)為0.1 %的無水乙醇)。收集維甲酸處理5天的成釉細(xì)胞瘤細(xì)胞，加1 ml 50 mg/ml碘化丙碇(PI)綜合染液。在4 ℃ DNA染色20 min,離心，在Elite ESP型流式細(xì)胞儀(Coulter公司)上檢測，激光光源為氬離子激光，波長488 nm，檢測前以標(biāo)準(zhǔn)微球液核準(zhǔn)儀器使其變異系數(shù)(CV)<2%，測出各標(biāo)本DNA含量，以G0/G1前期亞2倍峰為凋亡峰，通過FCM-Elite隨機(jī)軟件進(jìn)行分析計(jì)算出各值。

1.5 透射電鏡觀察 根據(jù)維甲酸對成釉細(xì)胞瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的MTT法和FCM檢測結(jié)果，選擇作用效果最好的維甲酸濃度10-6M組為實(shí)驗(yàn)組，作用瘤細(xì)胞5天，收集同期對照組和藥物處理后的細(xì)胞。日立H-600IV型透射電鏡觀察、照像。

2 結(jié) 果

2.1 病理結(jié)果 肉眼見標(biāo)本約7 cm×9 cm大小，位于下頜角和升支，浸潤骨組織，骨吸收明顯，腫瘤表面包膜不完整，剖面有囊性和實(shí)性混合存在，實(shí)性區(qū)灰白色，取實(shí)性區(qū)。切片HE染色光鏡下見腫瘤上皮形成多個(gè)上皮島，中心由多邊或多角形細(xì)胞構(gòu)成，細(xì)胞間疏松連接，有囊液，周邊圍繞柱狀和立方狀細(xì)胞，細(xì)胞柵欄狀排列，核極性倒置，島間夾雜一些中間層和成纖維細(xì)胞，有玻璃樣變(圖1)。

圖1 濾泡型成釉細(xì)胞瘤病理切片(HE)由類似牙囊的腫瘤細(xì)胞島組成，島中央囊性變

2.2 原代培養(yǎng)細(xì)胞生長特點(diǎn)

2.2.1 第一代成釉細(xì)胞瘤細(xì)胞形態(tài) 原代培養(yǎng)8天后，成釉細(xì)胞瘤細(xì)胞圍繞組織塊呈鋪路石子樣緊密排列，形態(tài)多邊形(圖2)。

圖2 第一代AM細(xì)胞形態(tài) 200×

2.2.2 第二代細(xì)胞形態(tài) 第一代培養(yǎng)1周后，成釉細(xì)胞瘤細(xì)胞布滿瓶底90%左右,形態(tài)正常，進(jìn)行消化傳代，一傳二。腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)少量小的多角細(xì)胞，有些散在分布在簇外，形態(tài)稍長，多邊形，胞核大，有少量細(xì)胞出現(xiàn)空泡性變，主要在簇中位置，懸浮的死亡細(xì)胞稍增多，成纖維細(xì)胞也開始增多(圖3)。

圖3 AM細(xì)胞第二代形態(tài) 200×

2.3 免疫組化結(jié)果 先用HE染色定位細(xì)胞，瘤細(xì)胞成簇生長，周圍有散在分布的少量成纖維細(xì)胞(圖4)。成釉細(xì)胞瘤細(xì)胞屬于上皮細(xì)胞，鏡下示扁平多角形，對上皮特異性抗體角蛋白18、19表達(dá)陽性，在胞漿染色黃色，胞核不著色(圖5，6)。波形蛋白主要是間葉組織抗體，腫瘤細(xì)胞不染色，表達(dá)陰性(圖7)。在腫瘤細(xì)胞周圍存在的成纖維細(xì)胞是間質(zhì)細(xì)胞，染色正好相反，角蛋白抗體染色陰性，而波形蛋白抗體染色呈陽性。Bcl-2抗體是凋亡抗體，表達(dá)陽性(圖8)。

圖4 HE染色定位細(xì)胞 200×

圖5 角蛋白18染色陽性 200×

圖6 角蛋白19染色陽性 200×

圖7 波形蛋白染色陰性 200×

圖8 bcl-2染色陽性 200×

2.4 MTT結(jié)果 成釉細(xì)胞瘤細(xì)胞生長慢，3種濃度維甲酸處理48 h細(xì)胞生長抑制率變化不明顯，濃度組間差異明顯，10-6M抑制效果最好，而10-4M組效果最差。隨時(shí)間延長，抑制率逐漸提高，在作用5天后，抑制作用達(dá)到最高峰，各組都有顯著提高，仍是10-6M濃度組抑制效果最好，成釉細(xì)胞瘤細(xì)胞生長減慢，主要是壞死細(xì)胞增多，細(xì)胞量減少。形態(tài)由立方形向長星形轉(zhuǎn)化，用藥組轉(zhuǎn)化慢。第7天抑制率又明顯下降，各組間差別不顯著。見表1～4。

表1 ATRA對AM細(xì)胞誘導(dǎo)作用48 h的OD值及抑制率

表2 ATRA對AM細(xì)胞誘導(dǎo)作用4天的OD值及抑制率

表3 ATRA對AM細(xì)胞誘導(dǎo)作用5天的OD值及抑制率

表4 ATRA對AM細(xì)胞誘導(dǎo)作用7天的OD值及抑制率

2.5 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果 根據(jù)MTT結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)在維甲酸誘導(dǎo)第5天，增殖抑制效果最好，其中又以10-6M組效果最佳，而10-4M組效果最差。我們選取維甲酸效果最好與最差兩個(gè)濃度組細(xì)胞，即10-6M和10-4M，作為實(shí)驗(yàn)組，添加0.1%無水乙醇的成釉細(xì)胞瘤細(xì)胞作為對照組，誘導(dǎo)第5天進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期和凋亡情況。發(fā)現(xiàn)10-6M組細(xì)胞S期和G2/M期細(xì)胞數(shù)都減少，相應(yīng)G1期細(xì)胞數(shù)增多。10-4M組變化不明顯，和對照組沒有差異。見表5。

2.6 超微結(jié)構(gòu)觀察 在透射電鏡下觀察，成釉細(xì)胞瘤細(xì)胞核較大，不規(guī)則，有深核溝，核內(nèi)以常染色質(zhì)為主，胞漿內(nèi)核糖體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富，胞漿內(nèi)見少量微絲，糖原豐富。經(jīng)過維甲酸誘導(dǎo)后細(xì)胞核膜完整，核呈橢圓形，線粒體清楚，結(jié)構(gòu)好，糖原少，微絲多，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，形態(tài)向正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化。見圖12,13。

表5 ATRA對AM細(xì)胞誘導(dǎo)作用5天的SPF值及PI

三組的凋亡指數(shù)AI有明顯差異，10-6M組最高為39.3%，10-4M組為10.7%，而對照組最低為8.7%。見圖9～11。

圖9 對照組細(xì)胞凋亡指數(shù)8.7%

圖10 10-4M組細(xì)胞凋亡指數(shù)10.7%

圖11 10-6M組細(xì)胞凋亡指數(shù)為39.3%

圖12 透射電鏡觀察AM細(xì)胞細(xì)胞核較大，不規(guī)則，有深核溝，核糖體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富，微絲少，糖原豐富。

圖13 透射電鏡觀察經(jīng)維甲酸處理的AM細(xì)胞，核膜完整，核呈橢圓形的，線粒體結(jié)構(gòu)好，微絲多，糖原少，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張。

3 討 論

維甲酸(ratinoic acid，RA)是維主素A的衍生物，通過細(xì)胞核上不同受體產(chǎn)生包括細(xì)抱分化、代謝等多種生物學(xué)效應(yīng)。維甲酸系統(tǒng)具有大量不同的靶基因，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄和非轉(zhuǎn)錄等多種作用。維甲酸受體可以分為兩大類：維甲酸受體(RAR)和維甲類X受體(RXR)，都屬于核受體超家族。正常情況下，RAR和RXR形成異二聚體，與靶基因啟動子部位的特定序列-維甲酸反應(yīng)元件特異地結(jié)合而發(fā)揮功能[5]。維甲酸與RARα結(jié)合，改變其構(gòu)象，導(dǎo)致共抑制因子復(fù)合物從RARα上解離，使共激活因子與其結(jié)合，激活轉(zhuǎn)錄。由此轉(zhuǎn)錄合成的一些調(diào)節(jié)蛋白又可以激活下游的基因表達(dá)，這樣就形成一個(gè)連鎖反應(yīng)，最后維甲酸介導(dǎo)的信號就被傳遞到龐大的信息網(wǎng)絡(luò)中，產(chǎn)生極其多樣化的生物學(xué)效應(yīng)[6]。1987年我國首次報(bào)導(dǎo)應(yīng)用全反式維甲酸治療急性早幼粒細(xì)胞白血病(APL)獲得成功，在腫瘤領(lǐng)域掀起了研究其機(jī)制的高潮。維甲酸在胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中發(fā)揮多種作用。維甲酸具有不同的生物效應(yīng)，可以調(diào)整成骨細(xì)胞的增殖、牙周膜細(xì)胞分化為成牙骨質(zhì)細(xì)胞和成骨細(xì)胞形成礦化組織。研究[7]表明，維甲酸類化合物可能通過調(diào)節(jié)蛋白激酶C(PKC)和蛋白激酶A(PKA)途徑，影響細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)系統(tǒng)，進(jìn)而影響細(xì)胞內(nèi)mRNA和蛋白質(zhì)的合成，在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞向正常細(xì)胞分化中發(fā)揮作用。

通過MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，維甲酸針對成釉細(xì)胞瘤(AM)細(xì)胞，可以使其增殖減弱，抑制增殖作用在第5天最強(qiáng)，三個(gè)濃度梯度組中，尤以10-6M組最明顯，達(dá)到31%，10-4M組作用最弱。我們繼而選擇這兩個(gè)濃度梯度組進(jìn)行下一步流式細(xì)胞儀(FCM)的檢測，發(fā)現(xiàn)維甲酸誘導(dǎo)成釉細(xì)胞瘤5天后，細(xì)胞周期改變，靜止期細(xì)胞增多，合成期及分裂期細(xì)胞減少，改變幅度不大，平均降低15%左右，這可能與AM細(xì)胞增殖活力不強(qiáng)有關(guān)。更重要的是凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增加，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的凋亡，經(jīng)過誘導(dǎo)后腫瘤細(xì)胞的凋亡率從8.7%升到39.3%，作用非常顯著。AM細(xì)胞浸潤生長特性與抑制凋亡有關(guān)，通過抑制凋亡有可能會改變成釉細(xì)胞生長特性。實(shí)驗(yàn)證實(shí)維甲酸的不同濃度產(chǎn)生不同的效應(yīng)，10-6M濃度產(chǎn)生的誘導(dǎo)作用最強(qiáng)，增加濃度反而降低了效應(yīng)。另外還與作用時(shí)間有關(guān)，誘導(dǎo)48 h沒有產(chǎn)生明顯效果，5天效果最好，以后就逐漸減弱，這與藥物效力和腫瘤細(xì)胞對其耐受有關(guān)。細(xì)胞分化主要表現(xiàn)在形態(tài)和功能兩個(gè)方面。形態(tài)分化是細(xì)胞分化的表形特征, 也是最基本的特征,能客觀地反應(yīng)分化誘導(dǎo)劑對細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用。透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)成釉細(xì)胞瘤細(xì)胞核較大，不規(guī)則，有核溝，胞漿內(nèi)核糖體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富，胞漿內(nèi)見少量微絲，糖原豐富，表明瘤細(xì)胞活性大，蛋白合成旺盛。經(jīng)過維甲酸誘導(dǎo)后細(xì)胞核膜完整，核呈橢圓形，線粒體清楚，結(jié)構(gòu)好，糖原少，微絲多，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，形態(tài)向正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化，合成作用減弱，活性減低。

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Role of retinoic acid in the differentiation of ameloblastoma cells

LEI Yin-tao1WANG Xu-xia2SUN Gang3

(1.Affiliated Hospital of Taishan Medical University, Taian 271000, China;2.School of Stomatology, Shandong University,Jinan 250012,China;3.Second Affiliated Hospital of Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou 310009, China)

Objective: To explore the affection of all-trans retinoic acid (ATRA) in progression and occurrence of the ameloblastoma. Methods： Primacy AM cells were cultivated. The cells' morphous and growth were observed, and detected with specific antibody. AM cell was induced by ATRA(10-4M,10-5M,10-6M)for two, four, five and seven days. By phase-contrast microscopy, transmission electron microscope, MTT, FCM and immunohistochemistry, the proliferation index, growth inhibittion ratio, cell cycle and apoptotic index were obtained. Results: AM cells in primary culture maintained epithelial cell morphology and expressed cytokeratins K18 and K19, but none expressed vimentin. Furthermore, bcl-2 protein, which prevented apoptosis, was expressed. AM cells underwent senescent within twenty-eight days. Time course and dose response had the effect on ATRA induced AM cells activity. Treated with 10-6M ATRA for five days, the effect on the differentiation of AM cell was the most significant. Proliferative activity of AM cell decreased and growth inhibition ratio was 31%. After being induced, the cell population of S stage was reduced and the cells of G0 stage were increased. Meanwhile, the apoptosis was obviously increased from 8.7% to 39.3%. Conclusion: ATRA can promote AM cells' morphological to be changed, and induce them differentiate to normal cell.

ATRA; ameloblastoma; induce

高等院校博士點(diǎn)新教師基金(20070335042)。

雷印濤(1969—)，男，副教授，主要從事口腔科教學(xué)和臨床工作。

孫鋼，E-mail：sungang531@163.com。

R782

A

1004-7115(2016)11-1205-05

10.3969/j.issn.1004-7115.2016.11.002

2016-06-20)