Gli抑制劑誘導胃癌細胞凋亡作用的研究

王 雷，杜媛鯤，米 源，廖海江，王 林

(1.河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院胸二科，石家莊 050011;2.河北醫(yī)科大學期刊社，石家莊 050017)

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論著·基礎研究

Gli抑制劑誘導胃癌細胞凋亡作用的研究

王 雷1，杜媛鯤2，米 源1，廖海江1，王 林1

(1.河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院胸二科，石家莊 050011;2.河北醫(yī)科大學期刊社，石家莊 050017)

目的 研究Gli抑制劑GANT61對人胃癌細胞AZ521和AGS凋亡的作用。方法 應用不同濃度(0、10、20μmol/L)的GANT61處理AZ521和AGS 細胞24h后，蛋白免疫印跡法(Western blot)觀察GANT61作用于AZ521和AGS細胞后對Gli-1、Gli-2、Bcl-2和Caspase-3蛋白表達的影響。流式細胞術(shù)觀察細胞凋亡及Bcl-2和Caspase-3蛋白的表達。結(jié)果 Western blot 結(jié)果顯示GANT61可以劑量依賴性顯著下調(diào)AZ521和AGS細胞Gli-1、Gli-2和Bcl-2蛋白表達和增加Caspase-3蛋白表達。流式細胞術(shù)檢測顯示10μmol/L GANT61作用AZ521，AGS細胞后凋亡率為(19.37±0.81)%和(16.1±0.26)%，顯著高于0μmol/L GANT61凋亡率(4.23±0.35)%和(6.00±0.87)%(P<0.05)； 10μmol/L和20μmol/L GAN761的AZ521細胞中Bcl-2蛋白表達水平分別為355.33±10.12、312.67±7.37，與0μmol/L GANT61423.33±11.37相比顯著降低(P<0.05) ；10μmol/L和20μmol/L GAN761的AGS細胞中Bcl-2蛋白表達水平分別為306.67±4.16、273.33±8.02，與0μmol/L GANT61388.33±11.06相比顯著降低(P<0.05) ； 10μmol/L和20μmol/L GANT61的AZ521細胞中Caspase-3蛋白表達水平分別為305±9.64、360.24±8.54，與0μmol/L GANT61261.12±11.53相比顯著增高(P<0.05)；10μmol/L和 20μmol/L GANT61的AGS細胞中Caspase-3蛋白表達水平分別為255.00±6.56、310.67±8.50，與0μmol/L GANT61198.33±2.50相比顯著增高(P<0.05)。結(jié)論 GANT61通過特異性抑制Gli-1，Gli-2蛋白表達從而調(diào)節(jié)AZ521和AGS細胞中Bcl-2和Caspase-3蛋白表達水平，誘導細胞凋亡。

胃腫瘤；細胞凋亡；GANT61；Gli-1；Gli-2

雖然近幾十年胃癌的發(fā)病率和致死率在逐年降低，但其仍然是全世界范圍內(nèi)排名第4的常見惡性腫瘤，也是與腫瘤相關(guān)的第2位致死原因[1]。即使人們已經(jīng)大量研究了胃癌的分子學機制，但是現(xiàn)有的治療措施并沒有明顯改善復發(fā)和轉(zhuǎn)移的胃癌患者的預后，如何深入探索胃癌的分子機制及找出更好治療的靶點是當前的研究熱點。研究表明，Hh信號傳導通路在多種人類腫瘤中發(fā)揮關(guān)鍵作用，在非小細胞肺癌、基底細胞癌、甲狀腺乳頭狀癌和肝細胞癌和乳腺癌等多種腫瘤中與腫瘤細胞的生長增殖、血管生成和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，針對Hh通路的靶向治療可以抑制腫瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移[2-8]。本研究通過應用Hh通路抑制劑GANT61特異性下調(diào)人胃癌細胞系AZ521和AGS中的Gli的表達，探討GANT61對胃癌細胞凋亡的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人胃腺癌細胞系AZ521和AGS購自英國Sigma-Aldrich公司，EMEM培養(yǎng)液(美國Gibco公司)，Ham培養(yǎng)液(美國Gibco公司)，胎牛血清(美國Gemini公司)，DMSO (美國MPBIO 公司)，GANT61(美國Selleckchem公司)，M-PER培養(yǎng)細胞總蛋白提取試劑(美國Thermo Scientific公司)，Pierce-BCA 蛋白分析試劑盒(美國Thermo Scientific公司) Gli-1兔抗人多克隆抗體(ab49314，美國Abcam公司)，Gli-2鼠抗人單克隆抗體(sc-271786，美國Santa Cruze公司)，Bcl-2鼠抗人單克隆抗體(sc-7480，美國Santa Cruze公司)，cleaved Caspase-3兔抗人單克隆抗體(#9664S，美國cell signaling公司),GAPDH鼠抗人單克隆抗體(美國 Santa Cruz公司)，超敏 ECL 化學發(fā)光試劑盒(美國Thermo Scientific公司)，Epics-XL 型流式細胞儀(美國 Beckman Coulter公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 胃癌細胞系AZ521于含10%胎牛血清和青-鏈霉素各100mg/mL的EMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)；AGS細胞于含10%胎牛血清和青-鏈霉素各100mg/mL的Ham培養(yǎng)基培養(yǎng)。分別取對數(shù)生長期的AZ521和AGS細胞接種至6孔板，采用蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測，接種至25cm2培養(yǎng)瓶中供流式細胞術(shù)實驗。

1.2.2 Western blot檢測蛋白表達 細胞于6孔板內(nèi)貼壁生長良好后更換為含2%胎牛血清的培養(yǎng)基，分別加入終濃度為10、20μmol/L的GANT61處理AZ521、AGS細胞24h，并設置DMSO對照(0μmol/L GANT61)。采用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞后加含有蛋白酶抑制劑的M-PER細胞總蛋白提取試劑， BCA 法測定各組細胞總蛋白濃度。常規(guī)Western blot 方法檢測Gli-1、Gli-2、Bcl-2和Caspase-3蛋白表達，一抗Gli-1的工作濃度為1∶1000；一抗Gli-2的工作濃度為1∶250；一抗Bcl-2的工作濃度為1∶ 250；一抗Caspase-3的工作濃度為1∶1000；一抗 GAPDH的工作濃度為1∶10000，二抗的工作濃度均為1∶20000。ECL 試劑發(fā)光，暗室顯影，每組實驗重復3次。

1.2.3 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 細胞于25cm2培養(yǎng)瓶內(nèi)貼壁生長良好后更換為含2%胎牛血清的培養(yǎng)基，加入終濃度為10μmol/L的GANT61作用AZ521、AGS細胞24h，設DMSO對照(0μmol/L GANT61)。PBS洗滌，胰酶消化，離心收集細胞，70%乙醇固定細胞制備成單細胞懸液，加入50μg/mL PI染液4℃染色，流式細胞儀檢測熒光強度和應用Expo32ADC進行免疫熒光數(shù)據(jù)分析，以亞二倍體峰代表細胞凋亡峰計算細胞凋亡率。

1.2.4 流式細胞術(shù)檢測腫瘤細胞中Bcl-2和Caspase-3蛋白表達量 細胞于25cm2培養(yǎng)瓶內(nèi)貼壁生長良好后更換為含2%胎牛血清的培養(yǎng)基，分別加入終濃度為10、20μmol/L的GANT61作用AZ521、AGS細胞24h，設DMSO對照(0μmol/L GANT61)。PBS洗滌，胰酶消化，離心收集細胞，70%乙醇固定細胞用于流式細胞術(shù)檢測。調(diào)整每份樣品的細胞數(shù)為1×106/0.1mL，分別加入鼠抗人Bcl-2及兔抗人Caspase-3抗體，常溫放置30min后用PBS洗滌2次，再分別加入1∶50稀釋的羊抗小鼠和羊抗兔FITC標記的IgG二抗，常溫放置30min后用PBS洗滌2次，流式細胞儀檢測蛋白含量，蛋白量以平均熒光強度表示，每組實驗重復3次。

2 結(jié) 果

2.1 Western blot檢測蛋白表達 與0μmol/L GANT61比較，GANT61可以下調(diào)AZ521和AGS細胞Gli-1、Gli-2和Bcl-2蛋白表達，增加Caspase-3蛋白表達，且具有劑量依賴性，見圖1、2。

1:0μmol/L GANT61；2:10μmol/L GANT61;3:20μmol/L GANT61

1:0μmol/L GANT61；2:10μmol/L GANT61;3:20μmol/L GANT61

表1 流式細胞術(shù)檢測不同濃度GANT61作用AZ521細胞24h細胞中Bcl-2和Caspase-3蛋白表達水平

表2 流式細胞術(shù)檢測不同濃度GANT61作用AGS細胞24h細胞中Bcl-2和Caspase-3蛋白表達水平

2.2 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率 10μmol/L GANT61作用AZ521細胞24h后細胞凋亡率為(19.37±0.81)%，與0μmol/L GANT61凋亡率(4.23±0.35)%相比顯著增高(P<0.05)；10μmol/L GANT61作用AGS細胞24h后細胞凋亡率為(16.1±0.26)%，與0μmol/L GANT61凋亡率(6.00±0.87)%相比顯著增高(P<0.05)。

2.3 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡結(jié)果 與0μmol/L GANT61比較， GANT61處理AZ521細胞24h后細胞中Bcl-2蛋白表達降低，且具有劑量依賴性(P<0.05)；Caspase-3蛋白表達升高且具有劑量依賴性(P<0.05)，見表1；與0μmol/L GANT61相比， GANT61處理AGS細胞24h后細胞中Bcl-2蛋白表達降低，且具有劑量依賴性(P<0.05)；Caspase-3蛋白表達升高且具有劑量依賴性(P<0.05)，見表2。

3 討 論

一些信號傳導通路的異常激活在腫瘤的發(fā)病機制起著重要的作用。目前，發(fā)現(xiàn)Hh信號傳導通路與人類絕大多數(shù)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程密切相關(guān)。經(jīng)典的Hh 通路活化途徑由Hh-Ptch-SMO-Gli 軸組成，當過表達的Hh與受體Ptch相結(jié)合時可以解除Ptch對SMO的抑制作用，導致SMO激活核轉(zhuǎn)錄因子Gli從而調(diào)控下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。Gli-1和Gli-2作為該通路的核心成員發(fā)揮著通路調(diào)節(jié)器的作用，在細胞的自我更新，細胞周期和凋亡起著重要作用[9-10]。同時，研究發(fā)現(xiàn)Gli在胃癌組織中高表達且和預后相關(guān)[11]，因此，本研究針對Gli靶點進行抗腫瘤研究。GANT61是近年來研發(fā)的針對Gli靶點的特異性抑制劑之一，具有抑制腫瘤生長和侵襲，抗增殖和誘導細胞凋亡等作用，表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤活性[12-13]，本實驗通過探索GANT61對胃癌細胞凋亡的影響及其可能的相關(guān)機制，為臨床上研究GANT61抗胃癌機制提供實驗基礎。

研究表明腫瘤細胞的凋亡是由多基因精確調(diào)控的過程，凋亡調(diào)控紊亂可以導致腫瘤的發(fā)生，因此，探尋誘導腫瘤細胞凋亡的藥物也為抗腫瘤研究開辟了新途徑。Srivastava等[14]研究發(fā)現(xiàn)GANT61可以下調(diào)橫紋肌肉瘤細胞的Gli-1和Gli-2蛋白表達，上調(diào)Caspase-3表達從而達到抗腫瘤細胞增殖和促進凋亡的效果。本研究顯示，應用GANT61處理胃癌細胞24h后凋亡率較DMSO組顯著增高，提示GANT61可以通過誘導細胞凋亡達到抗腫瘤作用。因為凋亡抑制基因Bcl-2與人類腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，它可以通過抑制多條凋亡信號進而影響細胞凋亡，并且有研究表明Bcl-2可能是Gli-1和Gli-2直接的轉(zhuǎn)錄靶基因[15]；而Caspase-3作為最具代表性的凋亡執(zhí)行因子，可以作用于特異性底物從而使細胞發(fā)生一系列生化及形態(tài)學改變，最終導致凋亡的發(fā)生，所以，筆者接下來通過蛋白印跡和流式細胞術(shù)等方法觀察了GANT61對胃癌細胞Gli，Bcl-2和Caspase-3等蛋白的影響，初步探討GANT61誘導胃癌細胞凋亡的機制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GANT61可呈劑量依賴性顯著抑制AZ521和AGS 細胞的Gli-1，Gli-2和Bcl-2蛋白表達，上調(diào)Caspase-3蛋白表達。分析其原因可能是Hh 信號通路Gli在胃癌中處于活化狀態(tài)并參與了腫瘤細胞的凋亡過程，GANT61可通過特異性抑制Gli來調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Caspase-3表達，實現(xiàn)對AZ521和AGS細胞的生長抑制作用。

綜上所述，GANT61可以通過誘導AZ521和AGS細胞凋亡從而達到抗胃癌的作用，針對Gli的靶向治療具有廣泛的應用前景，本研究為胃癌的臨床治療開辟了一個新途徑。

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Inhibition of gastric cancer cell by Gli inhibitor through induction of cell apoptosis

Wang Lei1,Du Yuankun2，Mi Yuan1，Liao Haijiang1,WangLin1

(1.Second Department of Thoracic Surgery，the Fourth Hospital of Hebei Medical University，Shijiangzhuang,Hebei 050011,China；2.Hebei Medical University Journal Association，Shijiangzhuang，Hebei 050017,China)

Objective To research the apoptosis-inducing function of Gli inhibitor on the human gastric carcinoma cells AZ521,AGS．Methods After adding different concentrations (0,10,20μmol/L)of GANT61for 24h,the protein expression of Gli-1，Gli-2，Bcl-2and Caspase-3were detected by Western blot in AZ521and AGS cell lines．Cell apoptosis，Bcl-2and Caspase-3expression level of AZ521and AGS after the different concentrations treatment of GANT61were detected by flow cytometry.Results Western blot assay showed that GANT61decreased Gli-1,Gli-2，Bcl-2protein expression and increased Caspase-3protein expression by dose-dependent manner.Cell apoptosis rate of AZ521and AGS cells were (19.37±0.81)%,(16.1±0.26)%,which were significantly higher than those of 0μmol/L GANT61(4.23±0.35)% and (6.00±0.87)% (P<0.05).The Bcl-2protein expression level of 10μmol/L and 20μmol/L GANT61groups in AZ521cells were 355.33±10.12,312.67±7.37，which were significantly lower than 0μmol/L GANT61423.33±11.37(P<0.05)． The Bcl-2protein expression level of 10μmol/L and 20μmol/L GANT61groups in AGS cell were 306.67±4.16，273.33±8.02，which were significantly lower than 0μmol/L GANT61(388.33±11.06) (P<0.05)．The Caspase-3protein expression level of 10μmol/L and 20μmol/L GANT61groups in AZ521cells were 305.00±9.64,360.24±8.54,which were significantly higher than that 0μmol/L GANT61261.12±11.53(P<0.05)．The caspase-3protein expression level of 10μmol/L and 20μmol/L GANT61groups in AGS cell were 255.00±6.56，310.67±8.50,which were significantly higher than 0μmol/L GANT61198.33±2.50(P<0.05).Conclusion GANT61can effectively induce cell apoptosis of AZ521and AGS cells by decreasing Gli-1,Gli-2to regulate Bcl-2and Caspase-3protein expression level in gastric cancer．

gastric neoplasms；apoptosis;GANT61；Gli-1;Gli-2

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.29.006

王雷(1976-)，副教授，博士后，主要從事胸部腫瘤的手術(shù)和靶向治療研究。

R734.2

A

1671-8348(2016)29-4050-03

2016-02-08

2016-04-18)