三種酵母菌藥敏試驗檢測氟康唑和伏立康唑結(jié)果的一致性

黃純英，陸麗燕，肖建寧，林還轉(zhuǎn)，麥艷媚

(1.鶴山市人民醫(yī)院檢驗科，廣東鶴山 529700；2.鶴山市人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科)

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三種酵母菌藥敏試驗檢測氟康唑和伏立康唑結(jié)果的一致性

黃純英1，陸麗燕2，肖建寧1，林還轉(zhuǎn)1，麥艷媚1

(1.鶴山市人民醫(yī)院檢驗科，廣東鶴山 529700；2.鶴山市人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科)

目的：探討三種酵母菌藥敏試驗在檢測酵母菌對氟康唑和伏立康唑藥物敏感的一致性與實用性。方法：選取2014年3月至2016年3月300例住院患者提供的酵母菌標(biāo)本220株，以美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(clinical and laboratory standards institute，CLSI)酵母菌紙片擴散法藥敏結(jié)果為參考標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)用梅里埃ATBFungus3法、丹麥ROSCO紙片擴散法檢測分離的220株酵母菌對氟康唑和伏立康唑的藥物敏感度。結(jié)果：ROSCO紙片擴散法檢測酵母菌對氟康唑和伏立康唑的藥敏結(jié)果與CLSI酵母菌紙片擴散法的參考結(jié)果之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，一致性比率分別為83.64 %、80.91 %；ATBFungus3法檢測酵母菌對氟康唑和伏立康唑的藥敏結(jié)果與CLSI酵母菌紙片擴散法的參考結(jié)果之間差異比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，一致性比率分別為73.64 %、71.82 %。結(jié)論：ROSCO紙片擴散法檢測酵母菌對氟康唑和伏立康唑體外藥物敏感度與CLSI酵母菌紙片擴散法的參考結(jié)果的一致性要優(yōu)于ATBFungus3法。

酵母菌；藥敏試驗；氟康唑；伏立康唑

美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(clinical and laboratory standards institute，CLSI)先后發(fā)布了酵母菌常量和微量肉湯稀釋法M27系列文件和酵母菌紙片擴散法M44系列文件，但由于前者操作及判讀均較為復(fù)雜，雖準(zhǔn)確卻不適用于大范圍常規(guī)開展；而后者操作簡單，準(zhǔn)確性好，已成為實驗室檢測氟康唑和伏立康唑耐藥性的參考方法之一。此外，梅里埃ATBFungus3法與丹麥ROSCO的紙片擴散法也是臨床應(yīng)用廣泛的兩種替代方法。本研究以CLSI酵母菌紙片擴散法(M44-S2和M44-S3文件)藥敏結(jié)果為參考標(biāo)準(zhǔn)，就酵母菌對于氟康唑和伏立康唑的藥物敏感，比較分析了梅里埃ATBFungus3法和丹麥ROSCO紙片擴散法結(jié)果與參考標(biāo)準(zhǔn)的一致性，現(xiàn)報告如下。

1 對象與方法

1.1 對象 選取2014年3月至2016年3月我院300例住院患者提供的酵母菌標(biāo)本220株，應(yīng)用ChromG A顯色培養(yǎng)基和API 20C AUX系統(tǒng)鑒定到種。其中白假絲酵母菌106株，光滑假絲酵母菌57株，熱帶假絲酵母菌 30株，克柔假絲酵母菌 27株。其中110株應(yīng)用于對氟康唑的藥敏試驗，另110株應(yīng)用于對伏立康唑的藥敏試驗。

1.2 藥敏試驗

1.2.1 CLSI標(biāo)準(zhǔn)紙片擴散法 使用0.85 %無菌鹽水制備出酵母菌懸液0.5麥?zhǔn)蠁挝唬缓笫褂脽o菌棉拭子將其均勻涂于葡萄糖美蘭M-H平板上，貼氟康唑與伏立康唑的藥敏紙片(由美國BD公司生產(chǎn))，在35 ℃的條件下持續(xù)18～24 h的孵育后獲得抑菌環(huán)直徑：耐藥≤14 mm，依賴劑量敏感>14且<19 mm，敏感≥19 mm[1]。

1.2.2 ROSCO紙片擴散法 使用0.85 %無菌鹽水制備出酵母菌懸液0.5麥?zhǔn)蠁挝?，生理鹽水稀釋后將酵母菌懸液均勻涂于RPMI-1640瓊脂平板(由丹麥ROSCO公司生產(chǎn))，貼氟康唑與伏立康唑的藥敏紙片，在35 ℃的條件下持續(xù)18～24 h的孵育后獲得抑菌環(huán)直徑：耐藥≤14 mm，依賴劑量敏感>15且<22 mm，敏感≥22 mm。

1.2.3 ATBFungus3法 根據(jù)說明操作，ATBFungus 3試條的最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)為0.25～128 μg/mL，使用0.85 %無菌鹽水制備酵母菌液懸液2.0麥?zhǔn)蠁挝?，然后?0 μL于ATB F Medium管中混合均勻后，每孔加入酵母菌混懸液135 μL，在35 ℃的條件下持續(xù)24 h的孵育后對結(jié)果進行觀察：耐藥為 MIC≥64 μg/mL，中敏為MIC介于16～32 μg/mL，敏感為MIC≤8 μg/mL。

1.3 藥敏質(zhì)控 (1)CLSI標(biāo)準(zhǔn)紙片擴散法檢測白假絲酵母菌ATCC 90028：可接受的抑菌環(huán)直徑伏立康唑為31～42 mm，氟康唑為28～39 mm；(2)ROSCO紙片擴散法檢測白假絲酵母菌ATCC 90028：可接受的抑菌環(huán)直徑伏立康唑為39～45 mm，氟康唑為36～42 mm；(3)ATBFungus3法檢測近平滑假絲酵母菌ATCC 22019：MIC伏立康唑為4～7 μg/mL，氟康唑為1～4 μg/mL。每次的質(zhì)控結(jié)果要在以上范圍內(nèi)。

1.4 觀察指標(biāo) 本研究以CLSI酵母菌紙片擴散法(M44-S2和M44-S3文件)藥敏結(jié)果為參考標(biāo)準(zhǔn)，研究ROSCO紙片擴散法、ATBFungus3法與其一致性。觀察指標(biāo)主要包括一致性率、極重大誤差率、重大誤差率及次要誤差率，計算方法參考文獻[2]。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 使用 SPSS 13.0與 WHONET-5.4軟件，采用χ2檢驗及 Kappa檢驗。

2 結(jié)果

以CLSI酵母菌紙片擴散法(M44-S2和M44-S3文件)藥敏結(jié)果為參考標(biāo)準(zhǔn)，(1)氟康唑：ROSCO紙片擴散法的一致性比率為83.64 %(92/110)，次要誤差率為14.55 %(16/110)，重大誤差率為1.56 %(1/64)，極重大誤差率為3.13 %(2/64)；ATBFungus3法的一致性比率為73.64 %(81/110)，次要誤差率為17.27 %(19/110)，重大誤差率為4.69 %(3/64)，極重大誤差率為14.06 %(9/64)。(2)伏立康唑：ROSCO紙片擴散法的一致性比率為80.91%(89/110)，次要誤差率為15.45 %(17/110)，重大誤差率為6.78 %(4/59)，無極重大誤差率；ATBFungus3法的一致性比率為71.82 %(79/110)，次要誤差率為14.55 %(16/110)，重大誤差率為3.39 %(2/59)，極重大誤差率為22.03 %(13/59)。通過檢驗可知，ROSCO紙片擴散法檢測酵母菌對氟康唑和伏立康唑的藥敏結(jié)果與CLSI酵母菌紙片擴散法的參考結(jié)果之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，ATBFungus3法檢測酵母菌對氟康唑和伏立康唑的藥敏結(jié)果與CLSI酵母菌紙片擴散法的參考結(jié)果之間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

近年來，隨著腫瘤化療、移植手術(shù)以及免疫缺陷病例的增加，免疫抑制劑、廣譜抗菌藥物以及侵入性診治手段的大量使用，侵襲性真菌感染(invasive fungal infections, IFI)的發(fā)生率不斷上升，就目前醫(yī)院深部真菌感染而言酵母樣真菌的感染現(xiàn)象值得高度關(guān)注，同時，也引起了相應(yīng)嚴(yán)重程度的真菌耐藥率不斷上升。據(jù)報道，臨床最常見的白假絲酵母菌對氟康唑的耐藥率從十幾年前的不到1 %上升到現(xiàn)在的5 %以上，因此這就要求臨床微生物室應(yīng)加強對酵母菌藥敏試驗工作的開展，這對耐藥株監(jiān)測、治療效果及預(yù)后均具有重要意義。

氟康唑為三氮唑類抗真菌藥，廣譜高效性，半減期長，水溶性佳，且不良反應(yīng)少，蛋白結(jié)合率低，可分布于人體的全身組織及體液之中，抗酵母樣真菌的效果亦佳；過去的數(shù)十年間在治療白念珠菌感染方面得到廣泛的應(yīng)用，但一方面白念珠菌感染率得到了控制，而另一方面非白念珠菌感染率卻呈不斷攀升之勢，這大大限制了其在臨床上的應(yīng)用。而近幾年，伏立康唑等新興廣譜唑類藥物在IFI患者中的應(yīng)用逐漸深入，并逐漸從抗免疫缺陷疾病患者的真菌感染轉(zhuǎn)變?yōu)镮FI的預(yù)防用藥。

丹麥ROSCO紙片擴散法操作簡便，可檢測出多達16種抗真菌藥物的菌株敏感度，如比咯或咪唑類、多烯類及氟胞嘧啶等，目前已在歐洲多個國家廣泛應(yīng)用開來，且因為ROSCO紙片擴散法性價比高，因此也出現(xiàn)在了我國臨床實驗室中。ATBFungus3法為一種試驗卡，可用于檢測酵母菌體外抗真菌藥物的敏感度，與微量肉湯稀釋法的不同之處在于它預(yù)先在微孔底部將一定量的藥物凍干，然后再與已接種受試菌溶解稀釋。該法亦操作簡便，目前在我國也逐漸應(yīng)用開來[3]。

從本研究結(jié)果來看，ROSCO紙片擴散法檢測酵母菌對氟康唑和伏立康唑體外藥物敏感度與CLSI酵母菌紙片擴散法的參考結(jié)果的一致性要優(yōu)于ATBFungus3法。丹麥ROSCO紙片擴散法是一種較為理想的CLSI酵母菌紙片擴散法的替代法[4]，方便肉眼直接判讀結(jié)果，但有報道指出該法在檢測是否為耐藥菌株時，尤其對于白假絲酵母菌，若抑菌環(huán)直徑未超過14 mm，則需要測定MIC值以進一步做出是否為耐藥菌株的確定[5]。

總之，ROSCO紙片擴散法檢測酵母菌對氟康唑和伏立康唑體外藥物敏感度與CLSI酵母菌紙片擴散法的參考結(jié)果的一致性要優(yōu)于ATBFungus3法。

[1] 張秀珍,張愛蓮.臨床分離念珠菌對5種常見抗真菌藥物的體外敏感試驗結(jié)果分析[J].中國社區(qū)醫(yī)師(醫(yī)學(xué)專業(yè)),2012,14(24):224.

[2] 秦利人.103株酵母樣真菌對伏立康唑、氟康唑的敏感性觀察[J].山東醫(yī)藥,2011,51(34):106-107.

[3] 曾燕波,林紅霞,葉智穎，等.口腔真菌感染患者口內(nèi)假絲酵母菌屬分布及藥敏性分析[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志,2015,(4):818-820.

[4] 謝麗冰,唐柳平.3種抗真菌藥治療兒童真菌性肺炎的療效對比研究[J].西南國防醫(yī)藥,2015,25(8):853-856.

[5] 孟帥,孫麗瑩,朱立勤，等.伏立康唑與氟康唑治療肝移植患者術(shù)后真菌感染的安全性比較[J].山東醫(yī)藥,2015,(13):61-62.

Study of the result consistency of three kinds of saccharomycetes susceptibility to fluconazole and voriconazole

HUANG Chunying1, LU Liyan2, XIAO Jianning1, LIN Huanzhuan1, MAI Yanmei1

(1.Department of Clinical laboratory of Heshan People's Hospital, Heshan 529700 , China,2.DepartmentofRespiratoryMedicine,HeshanPeople'sHospital)

Objective:To explore the consistency and practicality of 3 kinds of saccharomycetes susceptibility to fluconazole and voriconazole. Methods：220 saccharomycetes samples from 300 patients hospitalized from March 2014 to March 2016 were selected and ATB Fungus 3 method and ROSCO disk diffusion method were used to test the susceptibility of the 220 isolated saccharomycetes to fluconazole and voriconazole, the susceptibility result of Clinical and Laboratory Standards Institute(CLSI) disk diffusion method as the

tandard. Results：There was no difference in terms of susceptibility results between ROSCO disk diffusion method and CLSI disk diffusion method (P>0.05), the consistency rates being 83.64 % and 80.91% respectively; there was difference in terms of susceptibility results between ATB Fungus3 method and CLSI disk diffusion method (P<0.05), the consistency rates being 73.64 % and 71.82% respectively. Conclusion：The consistency of ROSCO disk diffusion method and CLSI disk diffusion method in the detection of saccharomycetes susceptibility to fluconazole and voriconazole is superior to that of ATB Fungus3 method.

Saccharomycetes; Susceptibility test; Fluconazole; Voriconazole

2016-03-15)