天然產(chǎn)物在骨肉瘤體外研究中的現(xiàn)狀

魏 興，王春江，曹 波

(1.包頭醫(yī)學院，內(nèi)蒙古包頭 014040；2.包頭市第四醫(yī)院；3.武警后勤學院救援醫(yī)學系生藥學教研室)

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天然產(chǎn)物在骨肉瘤體外研究中的現(xiàn)狀

魏 興1，王春江2，曹 波3

(1.包頭醫(yī)學院，內(nèi)蒙古包頭 014040；2.包頭市第四醫(yī)院；3.武警后勤學院救援醫(yī)學系生藥學教研室)

骨肉瘤化療的整體有效率仍大約在60 %，主要原因是化療藥毒副作用和腫瘤細胞耐藥問題。其他問題包括二線化療藥的缺少、化療風險評估、化療新方案等問題也仍待解答。天然產(chǎn)物作為自然界中由活生物產(chǎn)生的具有藥理學或生物學活性的化學物質(zhì)，可被用于藥學上的藥物研發(fā)與藥物設計，其優(yōu)勢在于細胞毒性小。本文著重描述近年來骨肉瘤治療中天然產(chǎn)物領域的發(fā)展，其中包括芹菜素、b欖香烯、褐藻素、人參皂苷RF、齊墩果酸OA、川續(xù)斷、堿提取物、九節(jié)茶提取物、非洲防己胺、甲基蓮心堿、白英萃取物、葉下珠萃取物、卷柏提取物丹參酮ⅡA等等的抗骨肉瘤作用及其機制。

骨肉瘤是青少年最常見的骨惡性腫瘤，約占青少年骨惡性腫瘤的60 %，通常發(fā)生在青春期的快速發(fā)育期。目前認為骨肉瘤的發(fā)病與染色體異常、抑癌基因異常、轉(zhuǎn)錄因子、生長因子、多蛋白配偶體等有關[1]。目前骨肉瘤最常見的治療方案是術前化療-手術切除所有病灶(包括轉(zhuǎn)移灶)-術后化療。

雖然化療在骨肉瘤的治療中具有舉足輕重的作用, 但骨肉瘤化療的總體有效率仍徘徊在60 %左右。制約其療效的主要因素有兩方面：一是高劑量強度所導致的嚴重的毒副作用,由于化療藥物個體差異較大,有效劑量與中毒劑量十分接近,因此相同劑量對于不同個體可能發(fā)生嚴重的粒細胞和(或)血小板下降。二是腫瘤細胞原發(fā)或繼發(fā)耐藥問題,也是化療失敗的主要原因。因此，抗耐藥、新的治療方法、二線化療藥等問題亟待解決，從天然藥物中尋找安全有效的抗腫瘤藥物可為骨肉瘤的治療開辟一條新的途徑[1]。

天然產(chǎn)物是指自然界中由活生物產(chǎn)生的那些通常具有藥理學或生物學活性的化學物質(zhì)，可被用于藥學上的藥物研發(fā)與藥物設計。包括蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、核酸、各種酶類、各種糖類、各種脂類、生物堿、揮發(fā)油、黃酮、糖苷類、萜類、苯丙素類等等天然存在的化學成分。其中黃酮類、生物堿類、揮發(fā)油類等多種類型天然產(chǎn)物已經(jīng)證明在抗乳腺癌、肺癌等方面有效，本文將介紹天然產(chǎn)物抗骨肉瘤方向的新進展。

1 黃酮類

芹菜素，別名4,5,7-三羥基黃酮，屬黃酮類，有研究[2]指出芹菜素對人骨肉瘤細胞U-2OS有抗癌特性，芹菜素可時間-劑量依賴性介導骨肉瘤細胞死亡，DAPI染色提示芹菜素有效介導了細胞凋亡，并改變了ROS和細胞內(nèi)Ca2+水平，增加BAX，caspase-3、8、9、12，AIF，PARP，p53，GRP78，ATF4的表達，并降低了caspase-3,caspase-9，GADD153基因的表達。并且芹菜素可抑制給予U2-OS異基因腫瘤的裸鼠的腫瘤生長。此外，有研究者認為染料木素，一種從大豆中提取出的異黃酮，可抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，TerukiKidani等[3]將染料木素處理過的鼠骨肉瘤細胞LM8(染料木素組)與未處理過的LM8(對照組)各接種8只裸鼠背上進行對照研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，染料木素組的腫瘤僅是對照組腫瘤大小的23 %，HE染色發(fā)現(xiàn)對照組100 %存在肺轉(zhuǎn)移，87.5 %存在肝轉(zhuǎn)移，染料木素組僅1例出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移。繼而對照組和染料木素組進行免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)，對照組中MMP-2顯著高于染料木素組。對照組中53 %的細胞呈β-catenin陰性，剩余47 %細胞的β-catenin亮度也不如染料木素組，染料木素組中82 %的腫瘤細胞β-catenin亮度呈陽性并且亮度明顯強于對照組；在轉(zhuǎn)移灶中β-catenin也呈陽性，但是亮度很弱。由此認為，染料木素可使LM8細胞中β-catenin過度表達和MMP-2減低，進而抑制骨肉瘤細胞增長和轉(zhuǎn)移。黃芩素是半枝蓮的主要成分之一，是天然黃酮類化合物，Tang等[4]發(fā)現(xiàn)，黃芩素可劑量依懶性抑制MG-63人骨肉瘤細胞的增殖，并且隨著給藥劑量的增加，ezrin蛋白的mRNA和蛋白表達水平均下降，凋亡指數(shù)卻上升?？紤]黃芩素抑制人骨肉瘤細胞的增殖與抑制ezrin蛋白表達和活性，促進細胞凋亡有關。黃酮類多通過凋亡通路抑制骨肉瘤細胞增殖，目前針對黃酮類的研究仍處于體外實驗和動物實驗階段。

2 揮發(fā)油類

有文獻指出β欖香烯、褐藻素可抑制骨肉瘤細胞傳代的細胞活性，褐藻素可抑制細胞轉(zhuǎn)移和骨肉瘤細胞的侵入性。Dan等[5]研究β欖香烯的骨肉瘤的抗癌作用和分子機制時發(fā)現(xiàn)，β欖香烯是通過細胞凋亡抗骨肉瘤的，并且具有時間-劑量依賴性。但同時發(fā)現(xiàn)β欖香烯治療通過活性氧簇和磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路，上調(diào)低氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)蛋白，HIF-1α蛋白抑制了凋亡。在通過微核糖核酸或聯(lián)合HIF-1α抑制劑利非西呱下調(diào)HIF-1α后可明顯增強抗腫瘤效果。因此認為β欖香烯可以增加HIF-1α表達，β欖香烯抗腫瘤效果被弱化，進而認為可選擇β欖香烯合并HIF-1α抑制劑治療骨肉瘤。在類胡蘿卜素中[6]，褐藻素通過介導周期調(diào)節(jié)蛋白依賴性激酶4、周期調(diào)節(jié)蛋白依賴性激酶6和周期調(diào)節(jié)蛋白E的表達減少來阻斷G1細胞周期，通過減低存活素、X連鎖凋亡抑制蛋白、Bcl-xL、Bcl-2的表達、激活caspases-3、8、9實現(xiàn)骨肉瘤細胞凋亡。此外，褐藻素還抑制磷酸肌醇依賴性激酶1和AKt和下游糖原合酶激酶3β的磷酸化，導致β-鏈蛋白的下調(diào)。同時減少基質(zhì)金屬蛋白酶1(matrix metalloproteinase-1，MMP-1)和活性蛋白1信號通路的表達，進而抑制細胞轉(zhuǎn)移和骨肉瘤細胞的侵入性。

3 多糖類

Chen等[7]從川續(xù)斷的堿提取物中提純得到一種堿性水溶性多糖提取物，可介導骨肉瘤HOS細胞的凋亡、降低線粒體膜電位并且顯著增加細胞內(nèi)活性氧簇含量。Western blot分析顯示堿性水溶性多糖提取物下調(diào)了HOS細胞磷脂酰肌醇3-激酶的蛋白表達和蛋白激酶B的磷酸化。在另一種天然產(chǎn)物提取物-九節(jié)茶提取物酸性多糖SGP-2抗骨肉瘤細胞MG-63的研究發(fā)現(xiàn)[8]，SGP-2通過caspase途徑激活caspase-3一定程度上介導骨肉瘤細胞凋亡，并且SGP-2抗骨肉瘤效果可被泛caspase抑制劑Z-VAD-FMK阻斷。此外SGP-2還可通過抑制RAGE和NF-kB信號通路抑制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移能力。

4 生物堿類

Bao等[9]對非洲防己胺研究發(fā)現(xiàn)在給予21.31±0.38 μM(IC50)COL時可有效地抑制了U20S細胞增殖并且細胞毒性較低，還可抑制轉(zhuǎn)移性骨肉瘤細胞的增殖和血管生成。COL介導阻斷G2/M細胞周期卻并沒有促進U20S細胞凋亡的作用，COL可抑制CDK6基因表達并刺激GM-CSF抑制STAT3磷酸化，但并不改變STAT3的蛋白水平。此外COL下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)表達并且通過抑制骨肉瘤細胞轉(zhuǎn)移、黏附和侵入抑制U20S細胞介導的血管生成。與非洲防己胺相同，甲基蓮心堿[10]雖然對骨肉瘤細胞的生長抑制作用明顯，但同樣不是通過介導細胞凋亡實現(xiàn)的，抑制作用通過的是阻斷細胞周期G1。G1期的阻斷是P21WAF1/CIP1依賴性的，與P53和RB無關。甲基蓮心堿激活P38、MAPK和JNK上調(diào)了P21，增加了P21蛋白的半衰期。并且，只有SB203580(一種P38抑制劑)，可以作用于甲基蓮心堿來減弱P21的上調(diào)。西法安生，是一種頭花千金藤的生物堿提取物，已應用于抗炎藥物中，Chen等[11]研究發(fā)現(xiàn)，西法安生可通過阻斷G1期和促進凋亡途徑抑制骨肉瘤細胞(時間-依賴型)，并且G1期的阻斷發(fā)生更早，所需劑量更小，因此可能G1期的阻斷占主導地位。研究者進行westernblot法和熒光素法均發(fā)現(xiàn)西法安生可抑制細胞內(nèi)STAT3水平，并抑制其靶基因c-Myc、cyclin D1、和Bcl-xL的表達，進而促進細胞凋亡。針對生物堿類天然產(chǎn)物的研究十分廣泛，這說明生物堿類抗腫瘤藥物的研究前景光明，可能會成為骨肉瘤治療的十分重要的發(fā)展方向。

5 萜類

Zhou等[12]對齊墩果酸OA研究發(fā)現(xiàn)，OA可抑制細胞增殖和集落形成，劑量和時間相關性介導阻斷骨肉瘤MG63和Saos-2細胞的G1期。在G1到S期轉(zhuǎn)位中扮演了重要角色的細胞周期蛋白D1，同時作為mTOR復合體1的下游靶點，其蛋白水平在OA的作用下降低。OA還可抑制磷酸化P70染色體S6激酶1和S6(S235/236),其受到mTORC1信號介導控制蛋白翻譯和細胞生長。此外，OA抑制Akt的磷酸化(一種mTORC2的促存活因子和色素)，Akt通過增加膜聯(lián)蛋白V-FITC捆綁，多聚腺苷二磷酸核糖、聚合酶的裂解和caspase-3的激活，證明蛋白激酶B的失活與骨肉瘤細胞的促凋亡相關。

6 其他天然產(chǎn)物及其提取物

Lin等[13]發(fā)現(xiàn)白英萃取物具備對人骨肉瘤細胞U-2OS細胞毒作用，這些作用包括細胞形態(tài)學改變，細胞存活率減低和介導凋亡。DAPI染色結(jié)果和流式細胞術發(fā)現(xiàn)sub-G1相增高說明SLE介導的細胞的死亡與細胞凋亡關系密切，研究表明SLE促進活性氧和NO的產(chǎn)生并降低了caspase-8和9的活性，還可抑制了Bcl2的水平和升高Bax水平，進而從線粒體釋放細胞色素c到胞質(zhì)并且激活caspase-9和3，導致從線粒體途徑介導細胞凋亡。該學者認為SLE促進ROS產(chǎn)生并通過線粒體、caspase途徑殺死U-2OS細胞。

腫瘤的轉(zhuǎn)移通常起源于細胞外基質(zhì)和基底膜的破壞導致的腫瘤侵襲和遷移，這種破壞是由多種溶蛋白酶的增效作用引起的，其中包括基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)。Yang等[14]對卷柏提取物研究發(fā)現(xiàn)，卷柏提取物濃度在0～50l g/mL間可抑制骨肉瘤細胞的轉(zhuǎn)移和侵犯并且無細胞毒性?；趯τ贛MP的認識及研究，該學者發(fā)現(xiàn)卷柏提取物抑制了MMP-2和MMP-9的分泌和TIMP-1和TIMP-2的表達，進一步抑制p38和Akt磷酸化，但對JNK1/2和ERK1/2沒有效果。在分別給予了p38和PI3K抑制劑后，骨肉瘤細胞的轉(zhuǎn)移和侵犯同樣被抑制，這也驗證了上述觀點。丹參酮提取物已經(jīng)被證實沒有嚴重的副作用，并具備一定的抗腫瘤作用，Zhang等[15]研究發(fā)現(xiàn)丹參酮IIA可時間-濃度依賴性抑制骨肉瘤細胞的增殖、轉(zhuǎn)移和浸潤，并可介導凋亡，濃度僅為5 μmol/L即可顯著抑制MG-63細胞增殖，丹參酮IIA可激活Bax并抑制Bcl-2表達，還可顯著增加caspase-3、8、9的表達，促進骨肉瘤細胞凋亡。丹參酮IIA還可抑制MMP-2、MMP-9的信使核糖核酸和蛋白表達，這意味著丹參酮IIA也許可以用于抑制骨肉瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。

天然產(chǎn)物作為嶄新的治療手段，為骨肉瘤患者帶來希望，但要運用于臨床，還有很多問題需要解決,如很多天然產(chǎn)物治療缺乏特異性靶向，如何開發(fā)更多的對骨肉瘤治療有效的靶向通路，如何更好地降低細胞毒性，如何提高天然產(chǎn)物的治療效率，更重要的是，目前天然產(chǎn)物在骨肉瘤方面的研究尚處于細胞試驗和動物實驗階段，研究仍處于起步階段，有些天然產(chǎn)物在體外試驗中的表達效率是否在體內(nèi)同樣適用仍然存疑。對于藥物療效、細胞毒性等方面都面臨著許多問題，還有待進一步深入研究。只有選擇合適的治療方式，建立起個體化的治療方案，天然產(chǎn)物對骨肉瘤的治療才能取得突破性的進展，骨肉瘤的天然產(chǎn)物治療才能真正用于臨床。

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王春江,曹 波

2015-09-29)