膽固醇基鍵合相-反相高效液相色譜法測(cè)定正辛醇/水分配系數(shù)

梁 超, 喬俊琴,2, 韓藝源, 練鴻振,2*

(1. 南京大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院, 江蘇 南京 210023; 2. 南京大學(xué)現(xiàn)代分析中心, 江蘇 南京 210093)

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膽固醇基鍵合相-反相高效液相色譜法測(cè)定正辛醇/水分配系數(shù)

梁 超1, 喬俊琴1,2, 韓藝源1, 練鴻振1,2*

(1. 南京大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院, 江蘇 南京 210023; 2. 南京大學(xué)現(xiàn)代分析中心, 江蘇 南京 210093)

通過(guò)反相高效液相色譜法系統(tǒng)地考察了中性和弱酸性化合物在新型膽固醇基鍵合相色譜柱(Cholester柱)上的保留行為。以甲醇和乙腈為有機(jī)調(diào)節(jié)劑,建立了保留因子(k)與有機(jī)調(diào)節(jié)劑比例(φ)間的關(guān)系,并外推獲取100%水相為流動(dòng)相時(shí)的logkw;同時(shí)進(jìn)一步建立并驗(yàn)證了不同流動(dòng)相下正辛醇/水分配系數(shù)的對(duì)數(shù)(logKow)和logkφ(logkw)間的模型,并預(yù)測(cè)了部分化合物的logKow。結(jié)果表明,使用Cholester柱測(cè)定logKow時(shí),甲醇比乙腈更適合作為有機(jī)調(diào)節(jié)劑;對(duì)中性化合物和中性狀態(tài)的酸性化合物,可以用任意甲醇比例下獲取的logkφ預(yù)測(cè)logKow;對(duì)存在離解的酸性化合物,依然用外推方式獲取的logkw預(yù)測(cè)logKow。將采用Cholester柱與文獻(xiàn)中采用C18柱、C8柱建立的logKow-logkφ模型進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果表明化合物與膽固醇基鍵合相存在特別的作用。

反相高效液相色譜;膽固醇基鍵合相色譜柱;正辛醇/水分配系數(shù)

正辛醇/水分配系數(shù)(Kow)是表征物質(zhì)疏水性的重要參數(shù),logKow常用于研究藥物在生物體內(nèi)的吸收、分布、代謝、排泄和毒性(ADMET),在藥物設(shè)計(jì)、環(huán)境污染物毒性和定量結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系(QSAR)的研究中具有重要作用[1,2]?，F(xiàn)有l(wèi)ogKow的獲取途徑主要有理論計(jì)算法[3]和實(shí)驗(yàn)測(cè)定法[4-6]。理論計(jì)算法更加方便,但準(zhǔn)確度較低,隨著化合物復(fù)雜性的增加,其可靠性逐漸降低,所以在條件允許的情況下應(yīng)盡量采用實(shí)驗(yàn)測(cè)定法。經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(OECD)推薦了3種經(jīng)典的logKow實(shí)驗(yàn)測(cè)定方法:搖瓶法(SFM)[4]、慢攪法(SSM)[5]和反相高效液相色譜(RP-HPLC)法[6]。SFM和SSM屬于直接測(cè)定法,這類方法耗時(shí)長(zhǎng),樣品用量大且對(duì)樣品純度要求高,只適于測(cè)定-2

一些課題組開(kāi)發(fā)了多種梯度洗脫測(cè)定logKow的方法[8-12],但這些方法的準(zhǔn)確度較低,且與等度洗脫法間缺乏系統(tǒng)的比較。等度洗脫法的研究目前主要圍繞實(shí)驗(yàn)中流動(dòng)相的選擇和新型固定相的應(yīng)用。流動(dòng)相方面:在測(cè)定離解化合物時(shí),高氯酸、乙酸、氨水等簡(jiǎn)單酸/堿化合物可代替緩沖鹽作為離子抑制劑,大部分基于簡(jiǎn)單酸/堿化合物的流動(dòng)相與質(zhì)譜檢測(cè)儀兼容,使無(wú)紫外吸收化合物的logKow的測(cè)定成為可能[13-16];由于硅膠基質(zhì)色譜柱上殘留的硅羥基會(huì)影響離解化合物，尤其是堿性離解化合物的保留行為,因此將三乙胺、正癸胺、正辛醇等物質(zhì)作為硅羥基“掩蔽劑”加入流動(dòng)相中,“掩蔽劑”的加入對(duì)離解化合物的logKow的測(cè)定有一定改善[17]。固定相方面:一些不含硅羥基的新型聚合物色譜柱用來(lái)測(cè)定離解化合物的logKow[7];一些烷基上嵌有氨基(-NH2)和苯基(-Ph)的非單純烷基鍵合相色譜柱也可用來(lái)預(yù)測(cè)logKow,這類色譜柱由于存在π-π、氫鍵等非疏水作用力,預(yù)測(cè)logKow時(shí)往往需要在保留模型中引入修正項(xiàng)以改善模型的相關(guān)性,而修正項(xiàng)的加入又會(huì)帶來(lái)新的誤差[18]。

圖 1 膽固醇鍵合相的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig. 1 Chemical structure of cholesteryl-bonded phase

將膽固醇基(cholesteryl)與硅膠進(jìn)行化學(xué)結(jié)合(見(jiàn)圖1)，制備具有高性能的反相Cholester色譜固定相，其主要作用力及使用的流動(dòng)相和C18柱相同,但因膽固醇基存在立體剛性結(jié)構(gòu)而與C18柱的保留行為不同。Cholester柱已成功用于番茄紅素[19]和類固醇激素[20]等具有立體結(jié)構(gòu)的化合物的分離。但目前關(guān)于Cholester柱保留行為的研究很少，有文獻(xiàn)[21]指出,用Cholester柱可以直接建立任意有機(jī)調(diào)節(jié)劑比例(φ)下logKow-logkφ的關(guān)系來(lái)預(yù)測(cè)logKow,從而節(jié)約實(shí)驗(yàn)時(shí)間,但未給出logKow-logkφ和logKow-logkw關(guān)系的比較。目前只有硅膠基質(zhì)的商品化Cholester柱,其pH適用范圍為2～8,不適于堿性化合物的分析。Janicka等[22]用Cholester柱測(cè)定logKow時(shí)選擇乙腈為有機(jī)調(diào)節(jié)劑,建立logk-φ線性模型來(lái)獲取logkw,但其僅測(cè)定了φ在0.40～0.60范圍內(nèi)的logk,并不能反映全乙腈比例范圍下logk-φ的真實(shí)趨勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)分別以甲醇和乙腈為有機(jī)調(diào)節(jié)劑,磷酸緩沖鹽為離子抑制劑,系統(tǒng)地研究了采用膽固醇基鍵合相-RP-HPLC法時(shí),29種中性化合物和28種弱酸性化合物的保留行為,并比較了logKow-logkφ和logKow-logkw的線性關(guān)系。

1 理論部分

RP-HPLC法利用色譜系統(tǒng)模擬正辛醇/水分配體系,求得化合物的logKow值[7]:

log \%K\%ow=\%a\%log \%k\%+\%b\%

(1)

其中,a和b為擬合系數(shù)。此方程稱為Collander方程,是RP-HPLC法測(cè)定化合物Kow的基礎(chǔ)。研究表明,通過(guò)線性溶劑強(qiáng)度模型[23]外推得到100%水相中k的對(duì)數(shù)值(logkw)與logKow有更好的相關(guān)性[7]:

log \%k\%=log \%k\%w-\%S\%φ (2)

logKowand pKavalues were literature values obtained from the database module of ACD/Labs software; logKow″ values were calculated with logKowand pKa; NA: no literature logKowvalue available; /: not applicable.

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器、試劑與材料

Alliance 2695高效液相色譜儀,配有真空脫氣機(jī)、數(shù)碼四元泵和120位自動(dòng)進(jìn)樣器、996紫外-可見(jiàn)二極管陣列(PDA)檢測(cè)器(美國(guó)Waters公司); SevenMulti型pH/電導(dǎo)率/離子綜合測(cè)試儀,配有Mettler Toledo Inlab?413 pH電極、參比溶液為pH 2.00和pH 7.01的緩沖溶液(瑞士Mettler-Toledo公司)。流動(dòng)相pH值為加入有機(jī)調(diào)節(jié)劑前水相緩沖液的pH值。

甲醇和乙腈(HPLC級(jí),美國(guó)Honeywell公司);磷酸(純度≥85.0%,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);磷酸二氫鉀(KH2PO4，純度≥99.5%,南京化學(xué)試劑有限公司)。實(shí)驗(yàn)用水均為娃哈哈純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán))。實(shí)驗(yàn)所用29種中性化合物(苯系物)和28種酸性化合物(苯甲酸、苯酚類)的具體信息見(jiàn)表1，其純度均大于98%,分別購(gòu)自美國(guó)AccuStandard公司、美國(guó)Acros公司、美國(guó)Sigma-Aldrich公司、日本TCI公司、國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司和北京百靈威公司,用甲醇分別配制質(zhì)量濃度為1 g/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,于4 ℃冰箱中儲(chǔ)存,待用。實(shí)驗(yàn)中,將目標(biāo)分析物分為3組:模型化合物組(training set)、驗(yàn)證化合物組(validation set)及待測(cè)化合物組(determination set)。

2.2 色譜條件

色譜柱:Cosmosil Cholester柱(150 mm×2.0 mm, 5 μm,日本Nacalai Tesque公司);柱溫:30 ℃;等度洗脫;流速:0.2 mL/min;進(jìn)樣體積:1 μL;進(jìn)樣濃度:50 mg/L。流動(dòng)相:①甲醇-水;②甲醇-20 mmol/LKH2PO4緩沖液(以下簡(jiǎn)稱緩沖液A, pH 2.5); ③甲醇-緩沖液A(pH 4.0); ④乙腈-水;⑤乙腈-緩沖液A(pH 2.5); ⑥乙腈-緩沖液A(pH 4.0)。水相為100%水時(shí)測(cè)定中性化合物;水相為緩沖液A時(shí)測(cè)定酸性化合物。檢測(cè)波長(zhǎng)為各物質(zhì)的最大吸收波長(zhǎng),所有樣品的tR均為至少3次獨(dú)立進(jìn)樣的平均值。

圖 2 化合物在(a)甲醇和(b)乙腈為有機(jī)調(diào)節(jié)劑時(shí)的log k-φ關(guān)系(pH 2.5)Fig. 2 Relationships between log k and φ of compounds with (a) methanol and (b) acetonitrile as organic modifiers (pH 2.5)

2.3 實(shí)驗(yàn)方法

在不同流動(dòng)相條件下,根據(jù)樣品的疏水性,每個(gè)樣品至少在4個(gè)不同φ(0.95～0.05,每隔0.05取一個(gè)比例)下測(cè)定tR。tR使用雙點(diǎn)校正法(DP-RTC)[25]進(jìn)行校正。保留因子按公式k=(tR-t0)/t0計(jì)算,其中t0為死時(shí)間,用尿嘧啶測(cè)定。建立各物質(zhì)的logk-φ關(guān)系,并外推至100%水相，得到logkw。

采用Origin 9.0 (美國(guó)Origin Lab公司)對(duì)擬合模型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 建立logk-φ模型外推logkw

建立logk-φ模型外推logkw是經(jīng)典RP-HPLC法測(cè)定logKow的基礎(chǔ)。目前鮮有文獻(xiàn)報(bào)道采用Cholester柱時(shí)化合物logk-φ的關(guān)系,因此需大量實(shí)驗(yàn)獲取數(shù)據(jù)點(diǎn)，以推斷l(xiāng)ogk-φ關(guān)系。甲醇和乙腈為有機(jī)調(diào)節(jié)劑時(shí),6種不同疏水性的中性和弱酸性化合物的logk-φ關(guān)系見(jiàn)圖2,其中弱酸性化合物為pH 2.5條件下的數(shù)據(jù)。甲醇為有機(jī)調(diào)節(jié)劑時(shí),logk-φ在較寬的φ范圍(0.05～0.95)內(nèi)線性關(guān)系良好;當(dāng)乙腈為有機(jī)調(diào)節(jié)劑時(shí),logk-φ在較寬φ范圍內(nèi)呈曲線關(guān)系。Shoenmakers提出一種描述logk-φ關(guān)系的非線性模型[26]：

(4)

由圖2可知,同一個(gè)化合物在甲醇和乙腈兩種有機(jī)調(diào)節(jié)劑下外推獲得的logkw存在較大差異。理論上,100%水相條件的logkw與有機(jī)調(diào)節(jié)劑無(wú)關(guān),兩種有機(jī)相體系外推logkw值的不同主要來(lái)自于擬合模型的不同。在100%水相條件下,樣品的tR較長(zhǎng)且不穩(wěn)定,因此logkw無(wú)法通過(guò)實(shí)驗(yàn)獲得。

圖 4 中性化合物和酸性化合物在甲醇或乙腈體系中的log Kow (log Kow″)-log kφ關(guān)系Fig. 4 Relationships of log Kow (log Kow″)-log kφ for neutral compounds and acidic compounds with methanol or acetonitrile as organic modifierMeOH: methanol; ACN: acetonitrile.

甲醇為有機(jī)調(diào)節(jié)劑時(shí),化合物的logk-φ存在良好的線性關(guān)系,根據(jù)方程(2)預(yù)測(cè)的logkw可能更接近實(shí)際值;乙腈為有機(jī)調(diào)節(jié)劑時(shí),logk-φ若用方程(2)進(jìn)行直線擬合,得到的logkw小于實(shí)際值,用方程(4)進(jìn)行非線性擬合時(shí),相關(guān)性得到較大提高,但獲得的logkw卻大于實(shí)際值。進(jìn)一步考察了乙腈條件下的logk-φ非線性模型,以苯甲醇(N2)為例,分別用3種乙腈范圍(0.05～0.95,0.40～0.95和0.05～0.40)的數(shù)據(jù)建立logk-φ非線性模型(見(jiàn)圖3),得到的結(jié)果并不相同。用高比例(0.40～0.95)/低比例(0.05～0.40)條件下得到的非線性模型預(yù)測(cè)低/高比例的logk均與實(shí)驗(yàn)值有差距。因此,在使用Cholester柱時(shí),不適合用非線性模型預(yù)測(cè)logkw。

圖 3 苯甲醇在不同乙腈范圍的log k-φ非線性模型Fig. 3 Nonlinear models of log k-φ from different acetonitrile ranges for benzyl alcohol a. 0.05-0.95; b. 0.40-0.95; c. 0.05-0.40; nonlinear models were fitted with black spots.

3.2 logKow(logKow″)-logkφ模型的建立

根據(jù)以下公式計(jì)算酸性化合物的logKow″:

logKow″=logKow-log(1+10pH-p\%K\%a)

(5)

部分logKow(logKow″)-logkφ的線性關(guān)系見(jiàn)圖4。不同流動(dòng)相下中性和酸性化合物的logKow(logKow″)-logkφ關(guān)系見(jiàn)表2。

表 2 不同流動(dòng)相條件下中性和酸性化合物log Kow (log Kow″)-log kφ的線性關(guān)系

* logkwobtained from equation (2); # logkwobtained from equation (4);N: the number of compounds investigated; S.E.: the standard error; adj.R2: the adjusted squared correlation coefficient; SD: standard deviation;F: the Fisher’s test value.

當(dāng)甲醇為有機(jī)調(diào)節(jié)劑時(shí),中性化合物和酸性化合物外推所得的logkw與logKow(logKow″)建立的logKow(logKow″)-logkw線性關(guān)系良好(R2約為0.98),而在任意甲醇比例下建立的logKow(logKow″)-logkφ線性關(guān)系均不如logKow(logKow″)-logkw。在pH4.0時(shí),部分酸性化合物建立的logKow(logKow″)-logkφ中的R2為0.91～0.93。對(duì)中性化合物及pH 2.5條件下離解已基本被抑制的弱酸性化合物,logKow(logKow″)-logkφ線性關(guān)系尚可(R2>0.94)。疏水性不同的物質(zhì)適用φ的范圍不

同,所以只有疏水性差異不大的化合物可以建立某一甲醇比例下的logKow(logKow″)-logkφ模型。本課題組曾證明結(jié)構(gòu)類似的中性和酸/堿化合物可以一起作為模型化合物建立logKow″-logkw模型[28,29]。甲醇條件下中性和酸性混合化合物組的logKow″-logkw線性關(guān)系中斜率接近1、截距為常數(shù),與使用C18柱時(shí)的結(jié)果一致[28,29]。

當(dāng)乙腈為有機(jī)調(diào)節(jié)劑時(shí),無(wú)論通過(guò)線性模型還是非線性模型獲取的logkw,其誤差均比甲醇體系大,因而logKow(logKow″)-logkw線性關(guān)系比甲醇體系差。而在任意乙腈比例下建立的logKow(logKow″)-logkφ線性關(guān)系總體上優(yōu)于logKow(logKow″)-logkw,因此如果選擇乙腈為有機(jī)調(diào)節(jié)劑,則不需外推獲取logkw。

表 3 log Kow (log Kow″)-log kφ模型的驗(yàn)證

* logKowvalues were literature values obtained from the database module of ACD/Labs software; Error=logKowcalculated in this work-logKow*.

3.3 logKow(logKow″)-logkφ模型的驗(yàn)證

為測(cè)試3.2節(jié)所建立模型的可靠性,分別選擇了2種中性化合物(甲苯(N26)、五氯苯(N27))和2種酸性化合物(苯酚(A22)、間溴苯甲酸(A23))進(jìn)行驗(yàn)證。采用甲醇-水、乙腈-水體系建立的中性化合物logKow-logkφ模型計(jì)算N26和N27的logKow;采用甲醇/乙腈-緩沖液A(pH 2.5和4.0)為流動(dòng)相下建立的弱酸性化合物logKow″-logkφ模型計(jì)算A22和A23的logKow″,根據(jù)方程(5)反推得到logKow。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷玫降膌ogKow與文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)行比較,結(jié)果見(jiàn)表3。對(duì)中性化合物,無(wú)論甲醇還是乙腈做有機(jī)調(diào)節(jié)劑,任意比例下建立的logKow-logkφ模型均可得到較為準(zhǔn)確的logKow,無(wú)需外推logkw;對(duì)酸性化合物,利用在甲醇體系中的logKow″-logkφ模型計(jì)算得到logKow比乙腈體系更準(zhǔn)確。3.4logKow的測(cè)定

用甲醇-水流動(dòng)相體系建立的logKow-logkφ模型測(cè)定1-萘乙腈和五溴甲苯的logKow,用甲醇-緩沖液A(pH 2.5和4.0)流動(dòng)相體系建立的logKow″-logkφ模型測(cè)定鄰甲基苯乙酸、鄰氯苯乙酸、1-萘乙酸、3,5-二甲基苯甲酸和2,4,6-三溴酚的logKow(見(jiàn)表4)。本實(shí)驗(yàn)得到的logKow與計(jì)算值接近,但化合物越復(fù)雜,計(jì)算值的誤差越大,如五溴甲苯和2,4,6-三溴酚。

表 4 樣品化合物log Kow的測(cè)定

* logKowwas calculated by Advanced Chemistry Development (ACD/Labs) Software V11.02 (1994-2012 ACD/Labs).

表 5 不同色譜柱上中性和酸性化合物log Kow (log Kow″)-log kφ線性關(guān)系比較

PCBs: polychlorinated biphenyls; PBDEs: polybrominated diphenyl ethers; PCDDs: polychlorinated dibenzodioxins;N, S.E., adj.R2, SD andFare the same as in Table 2.

3.5 Cholester柱、C18柱、C8柱logKow(logKow″)-logkφ模型的對(duì)比

OECD標(biāo)準(zhǔn)方法規(guī)定，將甲醇作為測(cè)定logKow的有機(jī)調(diào)節(jié)劑,因此比較本實(shí)驗(yàn)甲醇體系中使用Cholester柱和前期工作中使用C18柱和C8柱時(shí)獲取的logKow(logKow″)-logkφ模型[17,29,30](見(jiàn)表5)。由表5可知,在3種色譜柱上,無(wú)論是中性化合物還是酸性化合物外推至100%水相的logkw總是比任意φ下的logkφ與logKow(logKow″)的相關(guān)性好。使用logkw預(yù)測(cè)logKow時(shí),Cholester柱和C18柱、C8柱基本沒(méi)有區(qū)別(R2>0.97)。而使用logkφ預(yù)測(cè)logKow時(shí),Cholester柱與C18柱、C8柱的結(jié)果不同,對(duì)中性化合物,Cholester柱獲得的logkφ與logKow的相關(guān)性明顯優(yōu)于C18柱和C8柱;對(duì)酸性化合物,Cholester柱與C18柱獲得的logkφ與logKow″的相關(guān)性差距不大,但當(dāng)酸性化合物存在部分離解時(shí),C18柱的logKow″-logkφ相關(guān)性優(yōu)于Cholester柱。說(shuō)明化合物與膽固醇基和C18、C8的作用存在差異,值得后續(xù)進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本文系統(tǒng)地考察了新型Cholester柱用于RP-HPLC法測(cè)定logKow的可行性。用Cholester柱測(cè)定logKow時(shí),甲醇比乙腈更適合作為有機(jī)調(diào)節(jié)劑。對(duì)中性化合物和中性狀態(tài)的酸性化合物,可以直接用任意甲醇比例下獲取的logkφ預(yù)測(cè)logKow;而對(duì)存在離解的酸性化合物,為獲得更加可靠的logKow數(shù)據(jù),依然推薦用外推方式獲取的logkw預(yù)測(cè)logKow。作為一種新型鍵合相柱,化合物在Cholester柱上展現(xiàn)出與C18柱不同的保留行為,仍值得后續(xù)進(jìn)一步研究。

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梁超, 喬俊琴, 葛欣, 等. 色譜, 2014, 32(6): 426

Determination of n-octanol/water partition coefficient by reversed-phase high performance liquid chromatography with cholesteryl-bonded phase

LIANGChao1,QIAOJunqin1,2,HANYiyuan1,LIANHongzhen1,2*

(1. School of Chemistry & Chemical Engineering, Nanjing University, Nanjing 210023, China;2. Center of Modern Analysis, Nanjing University, Nanjing 210093, China)

Retention behaviors of neutral and weak acidic compounds were studied systematically on a novel cholesteryl-bonded phase column. The relationships between retention factor (k) with volume fraction of organic modifier (φ) were established for each compound with methanol and acetonitrile as organic modifiers. The values of logkwcorresponding to 100% water as mobile phase were obtained by extrapolating procedure. Models of the logarithm ofn-octanol/water partition coefficient (logKow) versus logkφ(logkw)withdifferentmobilephaseswereestablished.Thevaluesoflogkwofsomecompoundswerepredictedwithvalidatedmodels.TheresultsindicatedthatmethanolasorganicmodifierwasmoresuitablefordeterminationoflogKowwithcholestercolumnsthanacetonitrile.Forneutraloracidiccompoundsinneutralforms,thevaluesoflogkwcouldbepredictedwithlogkφf(shuō)rom mobile phases with any volume fraction of methanol; for acidic compounds ionized in the mobile phases, the values of logkwwere predicted with the extrapolated logkwvalues. Comparison of logKow-logkφmodelsestablishedoncholestercolumnsinthisworkwiththoseestablishedonC18andC8columnsfromthe

indicatedthatitexistsspecialinteractionsbetweencompoundsandthecholesteryl-bondedphase,whichdeservesfurtherstudy.

reversed-phasehighperformanceliquidchromatography(RP-HPLC);cholesteryl-bondedchromatographiccolumns; n-octanol/waterpartitioncoefficient(Kow)

10.3724/SP.J.1123.2016.09002

2016-08-31

國(guó)家自然科學(xué)基金(21275069,21577057).

Foundation item:National Natural Science Foundation of China (Nos. 21275069, 21577057).

O

A

鄒漢法研究員紀(jì)念專輯(上)·研究論文

* 通訊聯(lián)系人.Tel:(025)83685941,E-mail:hzlian@nju.edu.cn.