基于Fe3O4/乙二胺四乙酸磁性粒子的集成化蛋白質(zhì)組學(xué)方法

唐 君, 郭凱珠, 陳文東, 宋培培,封 順, 胡巢鳳, 許瑞蓮, 田瑞軍,4*

(1. 深圳市人民醫(yī)院腫瘤研究所, 廣東 深圳 518020; 2. 南方科技大學(xué)化學(xué)系, 廣東 深圳 518055;3. 西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院, 四川 成都 610031; 4. 深圳市細(xì)胞微環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 深圳 518055; 5. 暨南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系, 廣東 廣州 510632)

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基于Fe3O4/乙二胺四乙酸磁性粒子的集成化蛋白質(zhì)組學(xué)方法

唐 君1,2,5#, 郭凱珠2#, 陳文東2, 宋培培3,封 順3, 胡巢鳳5, 許瑞蓮1*, 田瑞軍2,4*

(1. 深圳市人民醫(yī)院腫瘤研究所, 廣東 深圳 518020; 2. 南方科技大學(xué)化學(xué)系, 廣東 深圳 518055;3. 西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院, 四川 成都 610031; 4. 深圳市細(xì)胞微環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 深圳 518055; 5. 暨南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系, 廣東 廣州 510632)

建立了基于Fe3O4/乙二胺四乙酸(EDTA)磁性粒子的集成化蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法。首先用共沉淀法合成EDTA負(fù)載的Fe3O4/EDTA磁性粒子。在優(yōu)化的溶液條件下(95%乙腈-1%三氟乙酸,體積分?jǐn)?shù)), 100 μg Fe3O4/EDTA磁性粒子可吸附12.4 μg牛血清白蛋白(BSA),吸附容量是商品化磁珠的10倍左右。以BSA作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì),對(duì)所合成的Fe3O4/EDTA磁性粒子作為蛋白質(zhì)組學(xué)反應(yīng)器的酶解時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)Fe3O4/EDTA磁性粒子處理BSA酶解1、8和16 h的肽段序列覆蓋率和特征肽段結(jié)果相當(dāng)。因此,可以將復(fù)雜的蛋白質(zhì)樣品前處理時(shí)間縮短至2 h內(nèi)。最后,將所合成的Fe3O4/EDTA磁性粒子應(yīng)用于血清的蛋白質(zhì)組學(xué)研究,成功地鑒定出218種蛋白質(zhì),其中包含了41種美國(guó)食品藥品管理局(FDA)認(rèn)證的生物標(biāo)志物。所發(fā)展的基于Fe3O4/EDTA磁性粒子的蛋白質(zhì)組學(xué)樣品前處理方法將蛋白質(zhì)樣品預(yù)富集、還原、烷基化、酶解、多肽除鹽和洗脫等步驟集成到一起,減少了樣品轉(zhuǎn)移和處理所造成的損失。這種技術(shù)具有快速、靈敏和易于操作的特點(diǎn),可用于臨床蛋白質(zhì)組學(xué)研究。

Fe3O4/乙二胺四乙酸(Fe3O4/EDTA);磁性粒子;蛋白質(zhì)組學(xué);樣品前處理

近幾年來(lái),基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)已經(jīng)成為系統(tǒng)水平上高通量蛋白質(zhì)鑒定和定量研究的主要分析方法[1,2],并已成功地應(yīng)用于基礎(chǔ)生物學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域[3-5]。樣品前處理是整個(gè)蛋白質(zhì)組學(xué)分析流程中至關(guān)重要的一步,決定著整個(gè)樣品分析的靈敏度、精確度和穩(wěn)定性[6]。由于樣品前處理步驟復(fù)雜,包括樣品預(yù)富集、緩沖液置換、蛋白質(zhì)還原、烷基化、酶解和多肽除鹽,在樣品量有限的情況下樣品損失不可避免[7-12]。因此,越來(lái)越多的研究人員專注于發(fā)展新的樣品前處理方法以提高蛋白質(zhì)組學(xué)研究的整體性能和靈敏度。其中一個(gè)很重要的切入點(diǎn)是將樣品前處理步驟集成到一起,以減少樣品的損失,進(jìn)而提高處理效率[13-16]。例如,Ethier等[17]發(fā)展了基于強(qiáng)陽(yáng)離子交換(strong cation exchange,SCX)填料填充的毛細(xì)管柱的蛋白質(zhì)組反應(yīng)器,該方法通過(guò)將樣品前處理步驟集成到一起顯著地提高了樣品處理效率。Wisniewski等[18]發(fā)展了超濾管輔助的樣品處理方法FASP(filter-aided sample preparation)。該方法將去除表面活性劑過(guò)程和蛋白質(zhì)酶解過(guò)程集成到一個(gè)超濾管中進(jìn)行,大大降低了樣品損失并提高了系統(tǒng)的整體效率。田瑞軍等[14]發(fā)展了微流控蛋白質(zhì)組反應(yīng)器法,把樣品前處理操作步驟集成到一個(gè)微流控芯片上,實(shí)現(xiàn)了多個(gè)蛋白質(zhì)樣品的同時(shí)處理。陳文東等[16]發(fā)展了簡(jiǎn)單集成的、基于填充了SCX填料和C18膜的移液槍槍頭的樣品前處理技術(shù)(simple and integrated spintip-based proteomics technology,SISPROT),以離心力作為驅(qū)動(dòng)力實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)預(yù)富集、還原、烷基化、酶解、多肽除鹽和高pH值反相分級(jí)過(guò)程在一個(gè)槍頭中的無(wú)縫銜接,大大減少了樣品的損失并顯著提高了樣品的處理效率。

基于磁性納米復(fù)合材料的蛋白質(zhì)組學(xué)樣品前處理方法已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用[19,20]。磁性納米復(fù)合材料是由氧化鐵(Fe3O4/γ-Fe2O3)的超順磁核和核外包覆的活性半體組成[21-23]。這種材料具有超順磁性、高穩(wěn)定性、較好的生物相容性和較大的比表面積[19]。Ng等[24]發(fā)展了基于磁性粒子在微流控設(shè)備上的免疫分析方法,這種新奇的芯片上的磁性粒子分離方法可以對(duì)90%以上未結(jié)合的試劑實(shí)現(xiàn)一步分離。2014年Hughes等[12]發(fā)展了基于磁珠技術(shù)的集成化樣品處理技術(shù)SP3(single-pot solid-phase-enhanced sample preparation)。該方法的原理是有機(jī)溶劑的加入促使蛋白質(zhì)和多肽通過(guò)親水作用富集在羧基包覆的磁性粒子上,該方法可將大部分樣品前處理步驟集成到一個(gè)小管中,確保了蛋白質(zhì)樣品的高靈敏度分析。

本文在SP3方法的基礎(chǔ)上發(fā)展了基于Fe3O4/乙二胺四乙酸(EDTA)磁性微球的簡(jiǎn)單、快速、集成化的蛋白質(zhì)組分析方法。EDTA修飾的磁性微球同樣是通過(guò)親水相互作用富集溶液中的蛋白質(zhì)和多肽,由于EDTA包覆的磁性粒子比羧基包覆的磁性粒子多3個(gè)功能化的羧基官能團(tuán),預(yù)期EDTA包覆的磁性粒子具有更好的蛋白質(zhì)富集效果。本文基于Fe3O4/EDTA磁性微球的方法原理,將溶液中的蛋白質(zhì)通過(guò)親水作用富集在磁珠上,除去其他雜質(zhì)成分后進(jìn)行蛋白質(zhì)的還原、烷基化以及在小體積溶液中的快速酶解,然后將溶液中酶解后的多肽通過(guò)親水相互作用再次富集在磁珠上,進(jìn)行除鹽,最后用洗脫劑將多肽從磁珠上洗脫下來(lái)。本文系統(tǒng)地研究了Fe3O4/EDTA磁性粒子的蛋白質(zhì)富集效率和酶解效率。并將所發(fā)展的基于Fe3O4/EDTA磁性粒子的蛋白質(zhì)組分析方法應(yīng)用于血清的蛋白質(zhì)組分析中。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

EASY-nLC 1000液相色譜分離系統(tǒng)配1.9 μm/12 nm ReproSil-Pur C18樹(shù)脂(德國(guó)Dr. Maisch公司)填充的帶有噴霧頭的毛細(xì)管分析柱(20 cm×100 μm),Q-Exactive質(zhì)譜儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司); Discovery TGA(熱解重量分析)器(美國(guó)TA儀器公司); Smart Lab 9 KW X-射線衍射(XRD)儀(美國(guó)Rigaku公司)。

氯化鐵(FeCl356H2O,分析純)、硫酸亞鐵(FeSO457H2O,分析純)、氨水(體積分?jǐn)?shù)為25%)均購(gòu)于永華化學(xué)科技有限公司;EDTA(分析純)購(gòu)于上海Sangon Biotech公司;胰蛋白酶(trypsin,純度≥99%)、甲酸(FA,HPLC級(jí))、三氟乙酸(TFA,HPLC級(jí))、乙腈(ACN,HPLC級(jí))、碘乙酰胺(IAA,純度≥99%)和三(2-羰基乙基)磷酸(tris(2-carboxyethyl)phosphine,TCEP,純度≥99%)均購(gòu)于美國(guó)Sigma公司;牛血清白蛋白(BSA,純度>98%)購(gòu)于加拿大BBI lifesiences公司;商品化的磁性粒子SiMAG-Carboxyl(M-COO-beads)(1 μm, 50 g/L)購(gòu)于美國(guó)Chemicell公司。血液樣品來(lái)自深圳市人民醫(yī)院。超純水(18.2 MΩ5cm)由Milli Q設(shè)備(美國(guó)Millipore公司)制得。

1.2 Fe3O4/EDTA磁性粒子的合成和表征

Fe3O4/EDTA磁性粒子的合成路線如圖1所示。將1.53 g FeCl356H2O和1.05 g FeSO457H2O分別溶于25 mL蒸餾水中制備成FeCl3溶液和FeSO4溶液。將0.31 g EDTA溶于12.5 mL 1.5%(體積分?jǐn)?shù))氨水中制備成EDTA溶液。在三口瓶中依次加入FeCl3溶液和FeSO4溶液,加熱至90 ℃,在不斷攪拌下向混合液中加入5 mL氨水(體積分?jǐn)?shù)為25%)和EDTA溶液,攪拌反應(yīng)30 min后將反應(yīng)體系冷卻至室溫。用磁鐵收集黑色沉淀物,將得到的磁性粒子用水(除氧)洗3遍,用乙醇(除氧)洗3遍,即可得到Fe3O4/EDTA磁性粒子。將合成的磁性粒子存儲(chǔ)于25 mL的除氧乙醇中,置于4 ℃冰箱保存。Fe3O4磁性粒子的合成過(guò)程與Fe3O4/EDTA磁性粒子的合成過(guò)程相比,未向混合液中加入EDTA溶液。

圖 1 Fe3O4/EDTA磁性粒子的合成路線圖Fig. 1 Synthesis of Fe3O4/ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) magnetic beads

熱重分析于N2保護(hù)下在Discovery TGA分析器上進(jìn)行。Fe3O4和Fe3O4/EDTA磁性粒子熱重分析起始溫度為50 ℃,以10 ℃/min的速度升到700 ℃。XRD測(cè)定在Smart Lab 9 KW X-射線衍射儀上進(jìn)行,射線為CuKα(λ=0.154 06 nm)。

1.3 Fe3O4/EDTA磁性粒子作為蛋白質(zhì)反應(yīng)器的溶液條件優(yōu)化

以BSA為標(biāo)準(zhǔn)蛋白對(duì)Fe3O4/EDTA磁性粒子在不同有機(jī)相含量下的吸附容量進(jìn)行測(cè)定。將BSA溶于超純水中配制成為4 g/L的儲(chǔ)備液,分別用50%(體積分?jǐn)?shù),下同)ACN-1%TFA、60%ACN-1%TFA、70%ACN-1%TFA、80%ACN-1%TFA、90%ACN-1%TFA和95%ACN-1%TFA溶液稀釋成0.2 g/L的BSA溶液。取6份5 μL Fe3O4/EDTA(20 g/L)磁性粒子,分別用50 μL 50%ACN-1%TFA、60%ACN-1%TFA、70%ACN-1%TFA、80%ACN-1%TFA、90%ACN-1%TFA和95%ACN-1%TFA溶液清洗兩遍,再分別加入6種不同乙腈含量的BSA溶液,上樣量均為21 μg,等待15 min后收集上清液。將上清液凍干后用25 μL水復(fù)溶,用BCA(bicinchoninic acid)法對(duì)上清液中的BSA濃度進(jìn)行測(cè)定。上樣量減去上清液中BSA的量即可得到吸附的BSA的量。商品化的M-COO-磁性粒子結(jié)合容量的測(cè)定方法同上。

1.4 Fe3O4/EDTA磁性粒子作為蛋白質(zhì)反應(yīng)器的酶解時(shí)間優(yōu)化

取100 μg Fe3O4/EDTA磁性粒子,用100 μL 95%ACN-1%TFA溶液洗兩遍,然后向磁珠中加入95%ACN-1%TFA稀釋的10 μg BSA標(biāo)準(zhǔn)品(0.2 g/L),等待15 min后置于強(qiáng)磁鐵上2 min,棄去上清液,加入50 μL 95%ACN-1%TFA溶液清洗樣品,棄去上清液。加入5 μL 100 mmol/L TCEP,反應(yīng)15 min,打開(kāi)蛋白質(zhì)的二硫鍵,然后加入95 μL ACN,使蛋白質(zhì)重新結(jié)合到磁珠上,置于強(qiáng)磁鐵上2 min,棄去上清液。加入10 μL酶解溶液(10 mmol/L碘乙酰胺-100 mmol/L pH 8 tris-HCl-2 g/L胰蛋白酶),在避光條件下酶解1、8和16 h。然后加入190 μL ACN和5 μL 20%TFA,15 min后棄去上清液。加入50 μL 95%ACN-1%TFA溶液清洗多肽,除鹽,棄去上清。最后用50 μL水將磁珠上吸附的多肽洗脫下來(lái)。洗脫液加甲酸酸化后進(jìn)行LC-MS/MS分析。

1.5 Fe3O4/EDTA磁性粒子用于血清樣品中的蛋白質(zhì)組學(xué)研究

取200 μg Fe3O4/EDTA磁性粒子,用100 μL 95%ACN-1%TFA溶液洗兩遍。將血液樣品以4 000 r/min的速度離心10 min,取上清血清,用酶標(biāo)儀對(duì)血清進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度測(cè)定后,將血清用水稀釋為4 g/L,再用95%ACN-1%TFA溶液稀釋為0.2 g/L的溶液。取10 μg 0.2 g/L的血清溶液加入200 μg磁珠中,15 min后置于強(qiáng)磁鐵上2 min,棄去上清液。二硫鍵還原、酶解、除鹽、洗脫步驟同1.4節(jié)。洗脫液加甲酸酸化后進(jìn)行LC-MS/MS分析。

1.6 LC-MS/MS分析

所有樣品均在由EASY-nLC 1000系統(tǒng)和Q-Exactive質(zhì)譜儀組成的LC-MS/MS系統(tǒng)上分析。液相色譜分離系統(tǒng)使用1.9 μm/12 nm ReproSil-Pur C18樹(shù)脂填充的帶有噴霧頭的毛細(xì)管分析柱(20 cm×100 μm)。分離采用了雙流動(dòng)相系統(tǒng):A相為體積分?jǐn)?shù)為0.1%的FA水溶液,B相為體積分?jǐn)?shù)為0.1%的FA乙腈溶液。將樣品的一半體積上樣到分析柱中,然后以250 nL/min的流速在分析柱上分離。分析血清樣品的梯度設(shè)置如下:0～2 min, 3%B～7%B; 2～52 min, 7%B～22%B; 52～62 min, 22%B～35%B; 62～64 min, 35%B～90%B; 64～70 min, 90%B; 70～72 min, 90%B～3%B; 72～80 min, 3%B。分析BSA時(shí)的有效梯度縮短至30 min,梯度設(shè)置為:0～2 min, 3%B～7%B; 2～27 min, 7%B～22%B; 27～32 min, 22%B～35%B; 32～34 min, 35%B～90%B; 34～40 min, 90%B。全質(zhì)譜掃描在Q-Exactive質(zhì)量分析器上完成,掃描范圍是m/z350～1 550,質(zhì)譜分辨率為1.2×105。MS/MS數(shù)據(jù)通過(guò)高能碰撞裂解的數(shù)據(jù)依賴性采集獲取。參數(shù)設(shè)置如下:最大離子注入時(shí)間:50 ms;分離窗口:m/z2.0;歸一化的碰撞能:27%;選取豐度最高且離子峰強(qiáng)度高于2.0×104的前10個(gè)離子進(jìn)行MS/MS分析;動(dòng)態(tài)排除時(shí)間:60 s。

1.7 數(shù)據(jù)分析

質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)由Sequest HT(Proteome Discoverer,Version 1.4)直接對(duì)human Uniprot fasta數(shù)據(jù)庫(kù)(包含68 485個(gè)蛋白質(zhì),下載于2015年4月14日)進(jìn)行搜索。參數(shù)設(shè)置如下:母離子的質(zhì)量容忍度設(shè)置為10 ppm(10×10-6),碎片離子設(shè)置為0.02 Da,胰蛋白酶酶切,最大漏切位點(diǎn)設(shè)為2個(gè),半胱氨酸脲基甲基化設(shè)置為固定修飾,甲硫氨酸氧化、天冬酰胺和谷氨酰胺脫氨基設(shè)置為可變修飾,肽段鑒定的錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)控制在1%以內(nèi)。

2 結(jié)果與討論

2.1 Fe3O4/EDTA磁性粒子的合成和表征

本文合成了EDTA修飾的Fe3O4磁性粒子,合成路線見(jiàn)圖1。將該磁性粒子的儲(chǔ)備液置于磁場(chǎng)下,15 s即可實(shí)現(xiàn)材料與溶液完全分離,結(jié)果見(jiàn)圖2。Fe3O4/EDTA和Fe3O4磁性粒子的XRD表征見(jiàn)圖3,表明Fe3O4與EDTA結(jié)合過(guò)程沒(méi)有改變Fe3O4的晶型。Fe3O4/EDTA磁性粒子的熱重表征如圖4所示,Fe3O4/EDTA磁性粒子的TGA曲線中有兩個(gè)階段的質(zhì)量丟失。第一階段是50～150 ℃,合成材料中殘留水分丟失;第二階段是200～500 ℃,主要是合成材料中EDTA分解。由Fe3O4和Fe3O4/EDTA磁性粒子的熱重曲線對(duì)比可得合成材料上的EDTA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.4%。

圖 2 Fe3O4/EDTA磁性粒子在磁鐵作用15 s后的磁場(chǎng)響應(yīng)Fig. 2 Fe3O4/EDTA magnetic beads responded in 15 s with a magnet

圖 3 Fe3O4和Fe3O4/EDTA磁性粒子的XRD圖Fig. 3 X-ray diffraction (XRD) patterns of Fe3O4and Fe3O4/EDTA magnetic beads

圖 4 Fe3O4和Fe3O4/EDTA磁性粒子的熱重曲線圖Fig. 4 Thermogravimetric analysis (TGA) curves of Fe3O4 and Fe3O4/EDTA magnetic beads

2.2 溶液條件的優(yōu)化

Fe3O4/EDTA磁性粒子中EDTA的羧基通過(guò)親水相互作用吸附溶液中的蛋白質(zhì),溶液中高比例的有機(jī)溶劑有利于Fe3O4/EDTA磁性粒子吸附蛋白質(zhì)[25]。但是蛋白質(zhì)在高比例的有機(jī)相中容易沉淀聚集,會(huì)影響蛋白質(zhì)的富集過(guò)程。以BSA為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì),研究了不同比例有機(jī)相中Fe3O4/EDTA磁性粒子對(duì)蛋白質(zhì)的吸附量。結(jié)果如圖5所示,在50%～80%(體積分?jǐn)?shù),下同)乙腈含量范圍內(nèi),隨著乙腈含量的增加,Fe3O4/EDTA磁性粒子的BSA結(jié)合量緩慢增加;而在80%～95%范圍內(nèi),隨著乙腈含量的增加,Fe3O4/EDTA磁性粒子的結(jié)合量迅速升高,在95%ACN-1%TFA下,100 μg Fe3O4/EDTA磁性粒子可結(jié)合12.4 μg BSA,所以在以后的試驗(yàn)中均采用95%ACN-1%TFA。

圖 5 100 μg Fe3O4/EDTA磁性粒子在50%～95%(體積分?jǐn)?shù)) 乙腈的1% (體積分?jǐn)?shù))TFA溶液中對(duì)BSA的吸附量Fig. 5 Bovine serum albumin (BSA) binding capacities of Fe3O4/EDTA magnetic beads in solutions of 1% (v/v) TFA with ACN contents from 50% to 95% (v/v)

在優(yōu)化的乙腈濃度條件下,分別對(duì)合成的Fe3O4/EDTA磁性粒子和商品化的M-COO-磁性粒子的吸附容量進(jìn)行了對(duì)比研究,發(fā)現(xiàn)100 μg M-COO-磁性粒子的吸附容量為(1.2±0.4) μg,而100 μg Fe3O4/EDTA磁性粒子的吸附容量為(12.4±0.9) μg,是M-COO-磁性粒子的10倍,并且商品化M-COO-磁性粒子的BSA上樣容量隨乙腈含量的升高無(wú)明顯變化(數(shù)據(jù)未給出)。商品化M-COO-磁性粒子吸附蛋白質(zhì)的機(jī)理和合成的Fe3O4/EDTA一樣,均為親水相互作用,兩者的不同之處在于商品化的羧基磁性粒子只帶有一個(gè)羧基,而合成的Fe3O4/EDTA帶有4個(gè)羧基。這可能是導(dǎo)致兩者之間吸附容量差異顯著的主要原因。

2.3 酶解時(shí)間的優(yōu)化

以BSA為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)對(duì)所合成的Fe3O4/EDTA磁性粒子做蛋白質(zhì)反應(yīng)器的酶解時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化,試驗(yàn)流程圖如圖6所示。將3份10 μg BSA分別加入3份100 μg Fe3O4/EDTA磁性粒子中,BSA通過(guò)親水相互作用吸附在Fe3O4/EDTA磁性粒子上,經(jīng)過(guò)還原、烷基化、酶解(1、8和16 h)、脫鹽和洗脫步驟后,質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果如表1所示。酶解1 h可檢測(cè)出BSA的89條特征多肽,覆蓋率為86.66%, PSMs(peptide spectrum matches)為297;而酶解8 h可檢測(cè)出105條特征多肽,覆蓋率為85.83%, PSMs為244;酶解16 h可檢測(cè)出97條特征多肽,覆蓋率為86.16%, PSMs為239。在誤差范圍內(nèi),酶解1、8和16 h的效果相當(dāng)。因此,優(yōu)化的酶解時(shí)間選擇為1 h。本試驗(yàn)中胰蛋白酶與蛋白質(zhì)的質(zhì)量比為2∶1,將胰蛋白酶與BSA的質(zhì)量比降低對(duì)特征肽段、PSMs和覆蓋度的檢測(cè)結(jié)果沒(méi)有顯著影響(數(shù)據(jù)未給出)?；贔e3O4/EDTA磁性粒子的蛋白質(zhì)反應(yīng)器將酶解時(shí)間縮短至1 h,將整個(gè)蛋白質(zhì)樣品前處理時(shí)間縮短至2 h,大大提高了樣品前處理效率。

圖 6 Fe3O4/EDTA作為蛋白質(zhì)反應(yīng)器的實(shí)驗(yàn)流程圖Fig. 6 Workflow of Fe3O4/EDTA as the proteomic reactor

Digestiontime/hUniquepeptideCoverage/%PSMs18986.66297810585.83244169786.16239

PSMs: peptide spectrum matches.

2.4 基于Fe3O4/EDTA磁性粒子的蛋白質(zhì)反應(yīng)器處理血液樣品

最后將合成的Fe3O4/EDTA磁性粒子應(yīng)用于血清的蛋白質(zhì)組學(xué)研究。將10 μg血清蛋白質(zhì)溶液加入200 μg Fe3O4/EDTA磁性粒子中,血清中的蛋白質(zhì)通過(guò)親水作用與Fe3O4表面的EDTA相互作用而被富集在Fe3O4/EDTA磁性粒子的表面。在優(yōu)化的樣品前處理?xiàng)l件下將得到的多肽樣品引入質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè),共鑒定到218個(gè)蛋白質(zhì),其中包含41個(gè)美國(guó)食品藥品管理局(FDA)認(rèn)證的生物標(biāo)志物,如表2所示。Geyer等[26]運(yùn)用單針進(jìn)樣鳥(niǎo)槍法蛋白質(zhì)組學(xué)工作流程可鑒定出約280個(gè)蛋白質(zhì),其中包含40多個(gè)FDA通過(guò)的生物標(biāo)志物。本文得到的血清中蛋白質(zhì)鑒定量與Geyer等[26]用單針進(jìn)樣鳥(niǎo)槍法得到的血清中蛋白質(zhì)鑒定量結(jié)果相當(dāng),說(shuō)明Fe3O4/EDTA磁性粒子作為蛋白質(zhì)反應(yīng)器是一種可靠的蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法。

表 2 從血清中鑒定到的41個(gè)FDA認(rèn)證的生物標(biāo)志物

3 結(jié)論

本文合成了表面修飾有EDTA的Fe3O4磁性粒子。在95%ACN-1%TFA條件下,磁性粒子的蛋白質(zhì)結(jié)合容量最高,每100 μg Fe3O4/EDTA可以吸附12.4 μg BSA,是商品化M-COO-磁性粒子的10倍。優(yōu)化了Fe3O4/EDTA用作蛋白質(zhì)反應(yīng)器的酶解時(shí)間,實(shí)現(xiàn)了1 h的高效溶液酶解。將此合成材料應(yīng)用于血清的蛋白質(zhì)組學(xué)研究可檢測(cè)到218個(gè)蛋白質(zhì),其中包含41個(gè)FDA認(rèn)證的蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物。本文所發(fā)展的基于Fe3O4/EDTA磁性粒子的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)將蛋白質(zhì)組學(xué)樣品前處理步驟集成到一起,方法易于操作,有效節(jié)省了樣品處理時(shí)間,減少了樣品損失,為蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供了方法學(xué)參考。

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Fe3O4/ethylenediaminetetraacetic acid magnetic beads-based integrated method for proteomic analysis

TANG Jun1,2,5#, GUO Kaizhu2#, CHENG Wendong2, SONG Peipei3,FENG Shun3, HU Chaofeng5, XU Ruilian1*, TIAN Ruijun2,4*

(1.InstituteofOncology,ShenzhenPeople’sHospital,Shenzhen518020,China;2.DepartmentofChemistry,SouthUniversityofScienceandTechnologyofChina,Shenzhen518055,China;3.SchoolofLifeScienceandEngineering,SouthwestJiaotongUniversity,Chengdu610031,China;4.ShenzhenKeyLaboratoryofCellMicroenvironment,Shenzhen518055,China;5.DepartmentofPathophysiology,SchoolofBasicMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China)

A Fe3O4/EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) magnetic beads-based integrated method for proteomic analysis was developed. Fe3O4magnetic beads loaded with EDTA were prepared firstly via co-precipitation method. One hundred μg Fe3O4/EDTA magnetic beads could adsorb 12.4 μg BSA (bovine serum albumin) in the optimized solution (95% acetonitrile-1% trifluoracetic acid, v/v). The binding capacity was about 10 times higher than that of the commercialized magnetic beads. The digestion time of Fe3O4/EDTA magnetic beads as the proteomic reactor was also optimized using BSA as the standard protein. The results indicated that the peptide coverage and unique peptides obtained from Fe3O4/EDTA magnetic beads with digestion time of 1, 8 and 16 h were comparable. We then applied the Fe3O4/EDTA magnetic beads for the serum proteome analysis. A total of 218 proteins were identified successfully, including 41 biomarkers approved by Food and Drug Administration (FDA). Protein preconcentration, reduction, alkylation, digestion, peptide desalting, and elution can be achieved in an integrated manner by the Fe3O4/EDTA magnetic beads-based proteomics sample preparation, which reduced the sample loss during sample transfering and processing. The developed method is fast, sensitive and easy to operate, which has prospective application for the clinic proteomics research.

Fe3O4/EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid); magnetic beads; proteomics; sample preparation

10.3724/SP.J.1123.2016.09033

2016-09-15

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(21575057);深圳市科技計(jì)劃項(xiàng)目(JCYJ20150901153557178,JSGG20160301103415523).

Foundation item: National Natural Science Foundation of China (No. 21575057); Shenzhen Innovation of Science and Technology Commission (Nos. JCYJ20150901153557178, JSGG20160301103415523).

O658

A

1000-8713(2016)12-1263-07

鄒漢法研究員紀(jì)念專輯(上)·研究論文

# 共同第一作者.

* 通訊聯(lián)系人.Tel:(0755)88018905,E-mail:tianrj@sustc.edu.cn(田瑞軍);Tel:(0755)25617019,E-mail:xuruilian@126.com(許瑞蓮).