基于凝集素的唾液糖蛋白分離、分析及應(yīng)用

孫凱博, 尚 志, 孫 妍, 喬 智, 劉 莎, 樊柳蔭, 曹成喜, 肖 華

(微生物代謝國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院生物分離與分析實(shí)驗(yàn)室, 上海 200240)

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基于凝集素的唾液糖蛋白分離、分析及應(yīng)用

孫凱博, 尚 志, 孫 妍, 喬 智, 劉 莎, 樊柳蔭, 曹成喜, 肖 華*

(微生物代謝國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院生物分離與分析實(shí)驗(yàn)室, 上海 200240)

唾液中的糖蛋白豐度偏低,給分離、分析帶來挑戰(zhàn)。該文采用麥胚素(WGA)和橙黃網(wǎng)胞盤菌凝集素(AAL)分別富集糖蛋白,考察了高豐度蛋白質(zhì)去除和不同酶解方式對(duì)糖蛋白分離、分析的影響。結(jié)果顯示,WGA和AAL提取的唾液糖蛋白經(jīng)膠內(nèi)酶解可鑒定到的糖蛋白數(shù)量顯著多于溶液內(nèi)酶解的結(jié)果,也優(yōu)于去除高豐度蛋白質(zhì)后的鑒定結(jié)果。選擇WGA結(jié)合膠內(nèi)酶解進(jìn)一步對(duì)比分析肺癌患者與健康人唾液糖蛋白的差異,通過免標(biāo)記定量分析共鑒定到139個(gè)蛋白質(zhì),其中102個(gè)蛋白質(zhì)存在糖基化位點(diǎn),包括14個(gè)在癌癥組和正常組之間存在顯著差異(p<0.05)的糖蛋白,表明該策略可用于唾液糖蛋白的有效分離、分析和癌癥標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)。

凝集素;糖蛋白;唾液;標(biāo)志物

唾液是一種重要的體液,可以反映人體的健康狀況,同時(shí)因其易收集、低成本、無創(chuàng)性,近年來已被廣泛應(yīng)用于疾病生物標(biāo)志物的研究,如口腔癌[1,2]、肺癌[3]和胃癌[4]。唾液的成分較為復(fù)雜,包含蛋白質(zhì)[3]、核酸[5]、微生物、代謝物和外泌體[6]等。唾液中蘊(yùn)含豐富的蛋白質(zhì),如黏蛋白、蛋白酶和細(xì)胞因子等,目前鑒定到的唾液蛋白質(zhì)已經(jīng)超過3 400種[7]。

糖基化是一種非常重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾,蛋白質(zhì)的糖基化和癌癥的發(fā)生、發(fā)展息息相關(guān)[8],如糖蛋白前列腺特異性抗原可作為前列腺癌的標(biāo)志物[9]。唾液中存在糖蛋白,但因其豐度偏低,給分離、分析帶來挑戰(zhàn)。文獻(xiàn)[10]報(bào)道,利用酰肼富集唾液糖蛋白后結(jié)合等電聚焦電泳和色譜、質(zhì)譜可以鑒定到45個(gè)糖蛋白。目前,采用凝集素提取唾液糖蛋白并用于癌癥檢測(cè)的報(bào)道很少。

本課題組前期在唾液總蛋白質(zhì)水平上發(fā)現(xiàn)了與肺癌相關(guān)的蛋白質(zhì),可以用于肺癌的檢測(cè)[3]。本文通過建立麥胚素(WGA)和橙黃網(wǎng)胞盤菌凝集素(AAL)提取唾液糖蛋白的方法,考察高豐度蛋白質(zhì)去除和不同酶解方式對(duì)唾液糖蛋白提取和鑒定的影響,發(fā)展唾液糖蛋白分離、分析的新方法,并將該策略用于肺癌患者與健康人唾液糖蛋白的對(duì)比分析,以期為唾液糖蛋白標(biāo)志物研究奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

maXis impact UHR-TOF MS四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜接UltiMate3000 RSLC納升液相色譜,配納升電噴霧離子源(德國(guó)Bruker公司); 5810R冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司);多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)GE公司); 2 mL凝集素親和柱(美國(guó)Thermo公司);10 μL C18 ZipTip(德國(guó)Merk Millipore公司)。

土豆淀粉、硅藻土、N-乙酰-D-葡萄糖胺、L-巖藻糖、二硫蘇糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAA)均為色譜純,購(gòu)于美國(guó)Sigma-Aldrich公司;WGA、AAL購(gòu)于美國(guó)Vector Laboratories公司;蛋白酶抑制劑購(gòu)于德國(guó)Roche公司;MOPS緩沖液(morpholineopropanesulfonic acid buffer)購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司;胰蛋白酶(測(cè)序級(jí))購(gòu)于美國(guó)Promega公司;其他生化試劑均為國(guó)產(chǎn)色譜純。

1.2 緩沖液的配制

富集唾液糖蛋白使用的結(jié)合緩沖液:20 mmol/L Tris-HCl緩沖液,150 mmol/L氯化鈉,1 mmol/L二水合氯化鈣,1 mmol/L四水合氯化錳,1 mmol/L六水合氯化鎂,加入蛋白酶抑制劑,用超純水定容至1 000 mL,調(diào)至pH=7.4。凝集素WGA的洗脫緩沖液:在結(jié)合緩沖液中加入0.5 mol/LN-乙酰-D-葡萄糖胺,用乙酸調(diào)至pH=3。凝集素AAL的洗脫緩沖液:在結(jié)合緩沖液中加入0.1 mol/L L-巖藻糖。上樣緩沖液按照水∶乙腈∶甲酸=97.9∶2∶0.1(v/v/v)進(jìn)行配制。

1.3 唾液樣本的收集和處理

唾液樣本按照上海交通大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行收集,所有樣本提供者均簽署了知情同意書。肺癌患者組和健康人對(duì)照組在性別和年齡等方面不存在顯著性差異。

唾液樣本在4 ℃下以4 497 r/min的轉(zhuǎn)速離心25 min,棄掉沉淀,上清中加入蛋白酶抑制劑,分裝后于-80 ℃冷凍保存。

1.4 唾液淀粉酶的去除

唾液淀粉酶的去除步驟在文獻(xiàn)[6,11]基礎(chǔ)上進(jìn)行了優(yōu)化。稱取等重的淀粉和硅藻土,重懸在pH為7.4的磷酸緩沖液(PBS)中,將勻漿填裝到含濾紙的注射器中制成淀粉柱。唾液與PBS按體積比1∶1混合稀釋后加到淀粉柱上,用PBS沖洗淀粉柱,收集洗脫液并轉(zhuǎn)移至3 kD超濾管中,在4 ℃下以7 638 r/min的轉(zhuǎn)速離心濃縮至體積約為500 μL,用BCA (bicinchoninic acid)法檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度。

1.5 凝集素富集糖蛋白

1.5.1 樣品緩沖液的置換

取去除唾液淀粉酶的唾液蛋白質(zhì)和唾液總蛋白質(zhì)各900 μg,分別轉(zhuǎn)移至3 kD超濾管中。加入3 mL結(jié)合緩沖液,在4 ℃下以7 638 r/min的轉(zhuǎn)速離心60 min,重復(fù)上述操作一次。加入2 mL結(jié)合緩沖液,相同條件下超濾離心30 min,將樣品轉(zhuǎn)移至離心管中,用結(jié)合緩沖液稀釋至1.6 mL。

1.5.2 糖蛋白的提取

按照凝集素制造商提供的步驟富集唾液中的糖蛋白。將1 mL結(jié)合在瓊脂糖上的凝集素均勻裝入2 mL凝集素親和柱中,用結(jié)合緩沖液充分洗滌柱子。將唾液蛋白質(zhì)樣品加到親和柱頂端,讓其在重力作用下流出,重復(fù)5次,棄去流出樣品。用結(jié)合緩沖液沖洗親和柱,去除非特異性吸附的蛋白質(zhì)。加入2 mL洗脫緩沖液洗脫特異性結(jié)合的糖蛋白,重復(fù)2次,合并洗脫液。將洗脫液轉(zhuǎn)移至3 kD超濾管中,在4 ℃下以7 638 r/min的轉(zhuǎn)速離心90 min;加入2 mL結(jié)合緩沖液,超濾離心至體積約為200 μL,測(cè)蛋白質(zhì)濃度后分裝,于-80 ℃凍存。

1.5.3 糖蛋白的聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)分析

取WGA、AAL富集的糖蛋白、去除唾液淀粉酶的唾液蛋白質(zhì)和唾液總蛋白質(zhì)各1 μg,加2.5 μL溴酚藍(lán)上樣緩沖液,于70 ℃孵育,采用MOPS緩沖液在10%雙(2-羥乙基)氨基(三羥甲基)甲烷(Bis-Tris)膠上進(jìn)行垂直電泳,快速銀染后采用光學(xué)掃描儀掃描圖像。

1.6 胰蛋白酶酶解

1.6.1 溶液內(nèi)酶解

取10 μg富集的糖蛋白凍干,重溶于90 μL 50 mmol/L碳酸氫銨中。加入10 μL 100 mmol/LDTT,于60 ℃反應(yīng)45 min。加入11 μL 150 mmol/LIAA,室溫避光反應(yīng)45 min。加入0.5 μg胰蛋白酶,于37 ℃酶解過夜,經(jīng)C18 ZipTip除鹽后用上樣緩沖液溶解,待測(cè)。

1.6.2 膠內(nèi)酶解

取60 μg蛋白質(zhì)做10% SDS-PAGE電泳,分3條泳道分析,每條泳道加20 μg蛋白質(zhì)。考馬斯亮藍(lán)染色,用干凈刀片將膠條切成小條,分成若干份。向每份中加入DTT至終濃度為20 mmol/L, 60 ℃水浴還原1 h,再加入IAA至終濃度為25 mmol/L,避光反應(yīng)30 min后依次用50 mmol/L碳酸氫銨、乙腈洗滌,最后加入10 μg/L胰酶酶解過夜,次日用乙腈萃取。肽段樣品干燥后,經(jīng)C18 ZipTip除鹽后用上樣緩沖液溶解,待測(cè)。

1.7 液相色譜-質(zhì)譜分析

肽段樣品先是在C18反相色譜柱(100 μm×2 cm, 5 μm)上進(jìn)行富集,然后洗脫到C18反相分析柱(75 μm×15 cm, 3 μm)上進(jìn)行分離。流動(dòng)相A是體積分?jǐn)?shù)為0.1%的甲酸水溶液,流動(dòng)相B是體積分?jǐn)?shù)為0.1%的甲酸乙腈溶液;流速為400 nL/min。ESI正極模式;質(zhì)譜電噴霧毛細(xì)管電壓:1 900 V;氣體流速:2.0 L/min;離子源溫度:120 ℃;選擇母離子m/z350～1 500進(jìn)行CID(collision-induced dissociation)二級(jí)碎裂掃描;碰撞能量:20～70 eV;動(dòng)態(tài)排除:0.25 min。

1.8 數(shù)據(jù)分析

使用Data Analysis 4.1軟件提取離子峰,生成.mgf文件。在方法發(fā)展階段,使用在線搜索引擎X!Tandem鑒定唾液糖蛋白數(shù)量,糖蛋白鑒定標(biāo)準(zhǔn)為:每個(gè)糖蛋白至少檢出2個(gè)特征肽段,且至少有一處糖基化修飾位點(diǎn)。在采用免標(biāo)記方法定量比較肺癌患者和健康人唾液糖蛋白差異時(shí),使用Mascot 4.0搜索引擎搜索蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)Human SwissProt(548 208條序列)。母離子質(zhì)量容差為20 ppm(20×10-6),二級(jí)譜圖質(zhì)量容差為0.05 Da,設(shè)半胱氨酸的烷基化修飾為固定修飾,設(shè)天冬酰胺脫酰胺修飾和甲硫氨酸氧化為可變修飾,胰蛋白酶最大漏切位點(diǎn)數(shù)為2,蛋白質(zhì)鑒定設(shè)置FDR(false discovery rate)小于1%,且每個(gè)蛋白質(zhì)至少檢出2個(gè)特征肽段。針對(duì)以上搜庫(kù)結(jié)果,利用在線糖蛋白分析網(wǎng)站(http://www.cbs.tu.dk/services/NetNGlyc/)對(duì)每個(gè)蛋白質(zhì)進(jìn)行糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)分析。

1.9 肺癌患者唾液糖蛋白分析

取6個(gè)健康人和6個(gè)肺癌患者的唾液各300 μg,分別混合制成正常唾液樣本和癌癥唾液樣本。取混合后的唾液蛋白各900 μg,分別使用1 mL WGA提取糖蛋白,經(jīng)膠內(nèi)酶解后采用液相色譜-質(zhì)譜結(jié)合免標(biāo)記定量進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)流程

實(shí)驗(yàn)流程如圖1所示。取6個(gè)健康人的等量唾液蛋白質(zhì)混合后均分為兩組,一組去除唾液淀粉酶,另一組不去除唾液淀粉酶。用凝集素WGA、AAL分別提取兩組唾液樣品中的糖蛋白,再分別進(jìn)行膠內(nèi)酶解和溶液內(nèi)酶解,通過液相色譜-質(zhì)譜分析鑒定唾液樣本中的糖蛋白種類,以確定唾液糖蛋白分離、分析的最優(yōu)化方法,并將方法應(yīng)用于肺癌患者和健康人唾液糖蛋白的差異對(duì)比,以期找到肺癌相關(guān)的糖蛋白。

圖 1 實(shí)驗(yàn)流程圖Fig. 1 Workflow of the study WGA: wheat germ agglutinin; AAL: aleuria aurantia lectin.

2.2 WGA、AAL富集糖蛋白的對(duì)比

2.2.1 去除唾液淀粉酶

唾液淀粉酶是唾液中的高豐度蛋白質(zhì)[12],本文采用親和層析去除唾液淀粉酶,考察其對(duì)唾液糖蛋白鑒定的影響。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[11],淀粉作為固定相可以特異性地富集唾液淀粉酶,而其他蛋白質(zhì)在淀粉柱上沒有保留,本文加入有助濾作用的硅藻土,使唾液蛋白質(zhì)樣本較快流下,縮短處理時(shí)間。BCA法測(cè)定結(jié)果顯示層析后唾液蛋白質(zhì)的質(zhì)量為起始唾液蛋白質(zhì)質(zhì)量的50%～60%。對(duì)除去唾液淀粉酶前后的唾液蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE分析,如圖2所示,可以看出相對(duì)分子質(zhì)量在51～64 kDa之間有一條明亮條帶消失,證明唾液淀粉酶已被去除。

圖 2 唾液總蛋白質(zhì)與去除唾液淀粉酶的唾液蛋白質(zhì)凝膠電泳圖Fig. 2 Gel electrophoreogram for the whole salivary proteins and amylase-depleted salivary proteins Lanes: 1. marker; 2. amylase depleted salivary (ADS) proteins; 3. whole salivary (WS) proteins.

2.2.2 糖蛋白的鑒定

本文使用凝集素WGA、AAL富集N-連接糖蛋白,其中WGA選擇性結(jié)合N-乙酰葡糖胺和唾液酸化的糖蛋白,AAL選擇性結(jié)合巖藻糖基化的糖蛋白[13]。在去除高豐度蛋白質(zhì)的唾液中,由WGA和AAL提取的糖蛋白分別占總蛋白質(zhì)的12.91%和9.49%;在唾液總蛋白質(zhì)中,由WGA和AAL提取的糖蛋白分別占總蛋白質(zhì)的29.8%和19.5%。這主要是由于唾液淀粉酶具有糖基化位點(diǎn),存在部分糖基化現(xiàn)象。對(duì)提取的糖蛋白進(jìn)行凝膠電泳分析(見圖3a),發(fā)現(xiàn)主要的唾液蛋白質(zhì)都存在糖基化現(xiàn)象。

通過膠內(nèi)酶解和溶液內(nèi)酶解的方法分別對(duì)唾液糖蛋白進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)分析,所有試驗(yàn)均進(jìn)行了2次生物學(xué)重復(fù),將2次結(jié)果取并集。如圖3b所示,膠內(nèi)酶解時(shí),將黑框內(nèi)染色較深的條帶合并在一起,將剩余染色淺的條帶合并在一起,分別進(jìn)行液相色譜-質(zhì)譜分析,溶液內(nèi)酶解和膠內(nèi)酶解所得蛋白質(zhì)數(shù)量見圖4。

圖 3 唾液糖蛋白、唾液總蛋白質(zhì)及去除高豐度蛋白質(zhì)的 唾液蛋白質(zhì)凝膠電泳圖Fig. 3 Gel electrophoreogram for salivary glycoproteins,salivary total proteins and amylase-depleted salivary proteins a. salivary glycoproteins extracted by different lectins. b. protein bands cutting for in-gel digestion. The deep staining bands with black frame were combined into one group, and the light staining bands were combined into another group. Lanes: 1. WGA ADS glycoproteins; 2. WGA WS glycoproteins; 3. AAL ADS glycoproteins; 4. AAL WS glycoproteins; 5. marker; 6. ADS proteins; 7. WS proteins; 8. marker.

圖 4 糖蛋白鑒定數(shù)量對(duì)比Fig. 4 Comparison of identified glycoprotein numbers

當(dāng)采用溶液內(nèi)酶解的方法時(shí),去除高豐度蛋白質(zhì)有助于增加糖蛋白的鑒定數(shù)量(平均增加18.8%)。當(dāng)采用膠內(nèi)酶解的方法時(shí),去除高豐度蛋白質(zhì)則不利于糖蛋白的發(fā)現(xiàn),使用唾液總蛋白質(zhì)可以富集到更多的糖蛋白。

對(duì)比糖蛋白的溶液內(nèi)酶解和膠內(nèi)酶解可以發(fā)現(xiàn),膠內(nèi)酶解所鑒定的蛋白質(zhì)數(shù)量多于溶液內(nèi)酶解,這可能是因?yàn)槟z內(nèi)酶解過程中SDS-PAGE對(duì)蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行了預(yù)分離,高豐度蛋白質(zhì)條帶和低豐度蛋白質(zhì)條帶的分別合并分析減少了高低豐度蛋白質(zhì)間的互相干擾[14]。對(duì)比凝集素WGA和AAL富集唾液糖蛋白發(fā)現(xiàn),由WGA提取唾液總蛋白質(zhì)的情況下,膠內(nèi)酶解鑒定的糖蛋白數(shù)量遠(yuǎn)多于AAL提取唾液總蛋白質(zhì)并進(jìn)行膠內(nèi)酶解鑒定的糖蛋白數(shù)量。

綜上所述,采用WGA提取唾液總蛋白質(zhì)后再進(jìn)行膠內(nèi)酶解,有助于鑒定更多的糖蛋白,因此選擇該實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行后續(xù)研究。

2.3 肺癌患者和健康人唾液糖蛋白的對(duì)比分析

將6個(gè)肺癌患者和6個(gè)健康人的唾液分別混合,用WGA提取糖蛋白,經(jīng)凝膠電泳分離后進(jìn)行膠內(nèi)酶解,然后基于液相色譜-質(zhì)譜進(jìn)行免標(biāo)記定量分析和鑒定,進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)。

采用凝集素WGA分別富集肺癌患者和健康人唾液中的糖蛋白,糖蛋白的提取率分別為15.8%(n=3)和12.9%(n=3),表明肺癌患者的唾液蛋白質(zhì)糖基化程度更高。對(duì)富集的糖蛋白進(jìn)行電泳分析,結(jié)果見圖5,說明肺癌患者和健康人之間存在明顯差異。

切膠酶解后進(jìn)行免標(biāo)記定量分析,經(jīng)MaxQuant軟件分析后做歸一化處理計(jì)算顯著性差異p值,當(dāng)p值小于0.05時(shí)視為組間存在顯著差異。從肺癌患者組鑒定出116個(gè)蛋白質(zhì)(3次實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別是82、97和85,三者交集為43),從健康人組鑒定出80個(gè)蛋白質(zhì)(3次實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別是48、57和63,三者交集為29)。通過蛋白糖基化位點(diǎn)分析,共鑒定出102個(gè)糖蛋白,高于文獻(xiàn)利用酰肼富集鑒定的45個(gè)唾液糖蛋白(其中26個(gè)在本實(shí)驗(yàn)中得到鑒定)[10]。其中14個(gè)糖蛋白在肺癌組和健康人組之間存在顯著豐度差異(p<0.05),結(jié)果見表1。

據(jù)文獻(xiàn)[15]報(bào)道,α-抗胰凝乳蛋白酶是絲氨酸蛋白酶抑制劑,可以作為非小細(xì)胞肺癌早期檢測(cè)標(biāo)志物。此外,黏蛋白5B(mucin 5B)有多個(gè)N-連接糖基化位點(diǎn)[10],質(zhì)譜數(shù)據(jù)表明其在第1 774位可能存在糖基化修飾,該蛋白質(zhì)可通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的活性防御細(xì)菌的侵入;簇集素蛋白(clusterin)作為細(xì)胞外分泌蛋白,參與細(xì)胞生長(zhǎng)因子的活化,已有研究表明黏蛋白5B[16]和簇集素蛋白[17]均可作為肺癌的預(yù)后蛋白質(zhì)標(biāo)志物。這些結(jié)果表明唾液中的糖蛋白與肺癌息息相關(guān),有望用于肺癌的特異性檢測(cè)。

圖 5 肺癌患者和健康人唾液蛋白質(zhì)和糖蛋白的SDS-PAGE對(duì)比Fig. 5 SDS-PAGE comparison of salivary proteins and glycoproteins between lung cancer patients and normal subjects Black arrows indicate the different bands of whole salivary proteins and glycoproteins between lung cancer patients and normal subjects. Lanes: 1. marker; 2. lung cancer WS proteins; 3. normal WS proteins; 4. lung cancer WGA WS glycoproteins; 5. normal WGA WS glycoproteins.

表 1 肺癌患者和健康人存在顯著差異的糖蛋白

3 結(jié)論

本文基于凝集素建立了唾液糖蛋白的富集、分離和鑒定的新策略,并將其初步應(yīng)用于癌癥標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)。結(jié)果表明,采用WGA富集唾液總蛋白質(zhì)中的糖蛋白,通過膠內(nèi)酶解后可以鑒定到102個(gè)唾液糖蛋白,優(yōu)于酰肼富集方法[10],顯著提高了唾液糖蛋白的鑒定水平。通過肺癌患者與健康人的對(duì)比,發(fā)現(xiàn)14個(gè)差異顯著的糖蛋白,這些糖蛋白多與癌癥相關(guān),作為潛在的糖蛋白標(biāo)志物,有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究為唾液糖蛋白的分離、分析建立了新策略,有助于唾液糖蛋白的研究,為癌癥生物標(biāo)志物的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。

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Lectin based salivary glycoprotein separation,analysis and its application

SUN Kaibo, SHANG Zhi, SUN Yan, QIAO Zhi, LIU Sha,Fan Liuyin, CAO Chengxi, XIAO Hua*

(StateKeyLaboratoryofMicrobialMetabolism,LaboratoryofAnalyticalBiochemistryandBioseparation,SchoolofLifeSciencesandBiotechnology,ShanghaiJiaoTongUniversity,Shanghai200240,China)

The abundance of glycoproteins in saliva is relatively low, which brings great challenge to their separation and analysis. In the study, wheat germ agglutinin (WGA) and aleuria aurantia lectin (AAL) were utilized to extract salivary glycoproteins. The effects of high abundant protein removal and two digestion methods on glycoprotein analysis were investigated. Our data demonstrated that the number of identified glycoproteins using WGA and AAL with in-gel digestion was significantly higher than that of in-solution digestion, as well as high abundant protein removal method. The developed strategy was further applied to compare the salivary glycoproteins from lung cancer patients and normal subjects. According to label free quantification results, 139 proteins were found and 102 proteins with the glycosylation sites were predicted. Among them, 14 glycoproteins showed significant difference between the cancer and control ones (p<0.05). Our study demonstrated that the developed strategy could be applied to the efficient separation and analysis of salivary glycoproteins and would contribute to the cancer biomarker discovery.

lectin; glycoprotein; saliva; biomarker

10.3724/SP.J.1123.2016.08038

2016-08-30

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(21275099,21305087,21475086); “863”項(xiàng)目(2014AA020545);國(guó)家青年千人計(jì)劃項(xiàng)目(2013).

Foundation item: National Natural Science Foundation of China (Nos. 21275099, 21305087, 21475086); “863” Program (No. 2014AA020545); Recruitment Program of Global Youth Experts of China (2013).

O658

A

1000-8713(2016)12-1234-06

鄒漢法研究員紀(jì)念專輯(上)·研究論文

* 通訊聯(lián)系人.Tel:(021)34205682,E-mail:huaxiao@sjtu.edu.cn.