高通量、自動(dòng)化蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選技術(shù)以及相關(guān)儀器的研究進(jìn)展

梁翼然, 祝 瑩, 方 群

(浙江大學(xué)化學(xué)系微分析系統(tǒng)研究所, 浙江 杭州 310058)

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高通量、自動(dòng)化蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選技術(shù)以及相關(guān)儀器的研究進(jìn)展

梁翼然, 祝 瑩*, 方 群*

(浙江大學(xué)化學(xué)系微分析系統(tǒng)研究所, 浙江 杭州 310058)

基于X射線晶體學(xué)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析主要依賴于大規(guī)模結(jié)晶條件篩選獲得的高衍射分辨率的蛋白質(zhì)晶體。近年來,自動(dòng)化、高通量的液體操控技術(shù)和相關(guān)儀器的快速發(fā)展為蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選提供了高效、可靠的研究手段,顯著推動(dòng)了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)生物學(xué)的研究。文章綜述了蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選的自動(dòng)化液體處理技術(shù)的發(fā)展,包括移液器、注射泵、同步納升定量吸取注射、噴墨打印、超聲噴射以及微流控等技術(shù)。文章詳細(xì)介紹了各技術(shù)所對應(yīng)的典型商品化儀器及其在蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選中的應(yīng)用。此外,文章還介紹了集成多孔板的儲(chǔ)存和操控、編碼掃描、環(huán)境控制和軟件管理等諸多功能的一體化液體操縱平臺。

自動(dòng)化液體處理;蛋白質(zhì)結(jié)晶;高通量篩選;儀器;綜述

隨著人類基因組框架圖的成功繪制[1],生命科學(xué)的研究重點(diǎn)也逐漸過渡至基因的表達(dá)產(chǎn)物——蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)是一切生命活動(dòng)的承擔(dān)者,對蛋白質(zhì)及其復(fù)合物的結(jié)構(gòu)和功能的深入研究,不僅有助于在分子層次上理解生命活動(dòng),而且對新型藥物的設(shè)計(jì)、疾病診治等領(lǐng)域具有重要的意義[2]。自20世紀(jì)中期成功解析出第一個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)[3]以來,X射線晶體學(xué)(X-ray crystallography)已經(jīng)成為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析的主要方法。然而,如何獲得高質(zhì)量、可用于衍射分析的蛋白質(zhì)晶體仍是利用X射線晶體學(xué)解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的瓶頸問題。蛋白質(zhì)的結(jié)晶發(fā)生于特定的物理和化學(xué)環(huán)境下,涉及的參數(shù)空間包括蛋白質(zhì)的純度和濃度、沉淀劑的種類和濃度、pH、緩沖液種類、離子強(qiáng)度、添加劑、溫度等[4]。由于目前尚無可靠的理論預(yù)測手段,研究人員通常需要通過大規(guī)模的實(shí)驗(yàn)來篩選可使蛋白質(zhì)結(jié)晶的條件。

得益于機(jī)械自動(dòng)化、控制技術(shù)、信息技術(shù)、微流控技術(shù)等技術(shù)的快速發(fā)展,研究人員和相關(guān)研究機(jī)構(gòu)發(fā)展了一系列可以全自動(dòng)完成蛋白質(zhì)結(jié)晶實(shí)驗(yàn)所需的流體操控技術(shù)和裝置[5]。這些技術(shù)在提高篩選速度的同時(shí),顯著降低了蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選過程中的樣品消耗量,且增加了實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性。采用自動(dòng)化的液體操控技術(shù)和儀器,單次篩選的蛋白質(zhì)消耗量可降至50～200 nL,是常規(guī)人工篩選的1/100～1/20[6]。在相同蛋白質(zhì)消耗量下,可以上百倍地提高篩選成功率[7]。這些自動(dòng)化篩選儀器的成功研發(fā),使得結(jié)構(gòu)生物學(xué)獲得了快速的發(fā)展,成功得到結(jié)構(gòu)解析的蛋白質(zhì)數(shù)量迅速增長。截至2015年底,收錄于蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(Protein data bank, PDB)中的生物大分子結(jié)構(gòu)已經(jīng)超過100 000種。

1 基于移液器/注射泵的自動(dòng)化液體處理技術(shù)和蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選儀器

基于移液器/注射泵的自動(dòng)化結(jié)晶篩選技術(shù)和儀器的原理較為簡單,主要包括可吸取/注射液體的移液器或者注射泵模塊,以及可在三維空間移動(dòng)的位置控制系統(tǒng)。盡管這一類裝置在結(jié)構(gòu)上具有很大的相似性,但是不同的裝置在結(jié)晶方法、軟件設(shè)置時(shí)間、操作難度和靈活性上都有所區(qū)別。所以在進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選時(shí),研究人員需要根據(jù)樣品種類及實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行結(jié)晶儀器的選擇,或根據(jù)實(shí)際需要對現(xiàn)有儀器或平臺進(jìn)行合理改裝。

這些裝置通?？梢詫?shí)現(xiàn)多個(gè)模塊的訂制和組裝,由單通道或多通道的移液器或者注射泵實(shí)現(xiàn)沉淀劑/蛋白質(zhì)的快速移取、標(biāo)準(zhǔn)化的96/384/1 536孔板作為液體存儲(chǔ)裝置、標(biāo)準(zhǔn)化的96/384/1 536結(jié)晶板作為結(jié)晶反應(yīng)孵育裝置。同時(shí)還可根據(jù)需要配備不同的蛋白質(zhì)溶液點(diǎn)樣器、濕度保持模塊以及密封儲(chǔ)存模塊等。

1.1 單通道移液器/注射泵的液體處理技術(shù)

作為傳統(tǒng)移液方法的自動(dòng)化技術(shù),基于單通道移液器/注射泵方法的蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選儀器發(fā)展較早。

為了提高移液器的液體處理精度和可靠性,Hamilton公司發(fā)展了一系列自動(dòng)化移液技術(shù)(http://www.hamiltoncompany.com),包括:(1)空氣置換吸液技術(shù)(air displacement pipetting)。即以空氣對移液器和所吸溶液進(jìn)行間隔,減少了樣品被污染及稀釋的風(fēng)險(xiǎn),在亞μL到mL數(shù)量級具有較高的精度。(2)吸頭和移液器的連接技術(shù)。即通過一個(gè)O型環(huán)固定一次性槍頭,減少因應(yīng)力引起的噴射,從而提升系統(tǒng)的穩(wěn)定性。(3)空氣置換監(jiān)測(monitored air displacement)。該技術(shù)可以感應(yīng)到槍頭觸碰到的是空氣還是液體,并給予反饋,這使它特別適用于處理強(qiáng)揮發(fā)性的液體。(4)液體吸取和分配的全程監(jiān)控(total aspiration and dispense monitoring)。在重要樣品的移取過程中,吸入和注射的全過程和參數(shù)可全程反饋、實(shí)時(shí)監(jiān)控,從而避免樣品量不足、吸頭堵塞以及吸入氣泡等異常狀況。(5)液面檢測技術(shù)(liquid level detection)。通過電容或壓感技術(shù)檢測儀器中樣品儲(chǔ)存管或孔板中的液面高度并隨之改變吸液高度。(6)抗液滴技術(shù)(anti-droplet control),可連續(xù)監(jiān)控注射通道內(nèi)因液壓而引起的壓力變化,防止揮發(fā)性液體因壓力不平衡而在轉(zhuǎn)移過程中部分滴落。

基于注射泵進(jìn)行液體處理的典型代表是英國Douglas Instruments公司發(fā)展的Oryx系列自動(dòng)化蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選儀器(http://www.douglas.co.uk)。Oryx可用于基于坐滴的蒸氣擴(kuò)散法、微批量法、二維條件優(yōu)化等蛋白質(zhì)結(jié)晶的條件篩選[8]。該儀器的每個(gè)注射泵連接的管路頭部包含多個(gè)空心管,可準(zhǔn)確移取100 nL到2 μL的液體,使它特別適用于微晶種矩陣篩選(matrix microseed screening, MMS)[9]。通過增配脂質(zhì)立方相(lipidic cubic phase, LCP)注射泵模塊,可以實(shí)現(xiàn)10 nL至1 μL的黏稠LCP液體的點(diǎn)樣。同時(shí)可配備移動(dòng)防蒸發(fā)板,有效減小單通道LCP操作過程中因液滴蒸發(fā)而引起的實(shí)驗(yàn)偏差[10,11]。該儀器的部分結(jié)構(gòu)圖見圖1。

圖 1 Oryx系列的(a)3孔注射管結(jié)構(gòu)和(b)防蒸發(fā)板[11]Fig. 1 (a) Three-bore tip and (b) the sliding evaporation shield of Oryx[11]

最近,作者所在的研究組[12]基于順序操作液滴陣列(sequential operation droplet array, SODA)技術(shù),發(fā)展了一種可在亞nL至nL級體積進(jìn)行超微量蛋白質(zhì)結(jié)晶和篩選的技術(shù)和配套裝置[13]。該技術(shù)集成了自動(dòng)化nL液體處理技術(shù)、高密度微孔陣列芯片技術(shù)以及半開放式油下液滴技術(shù)?？稍谛庞每ù笮〉男酒线M(jìn)行數(shù)百種甚至上千種蛋白質(zhì)結(jié)晶條件的篩選,總蛋白質(zhì)消耗量僅為μL級。目前,該裝置已經(jīng)成功應(yīng)用于溶菌酶等5種模型蛋白質(zhì)的結(jié)晶篩選中。

1.2 多通道移液器/注射泵的液體處理技術(shù)

提高移液器/注射泵的通道數(shù)量是提高篩選通量的最直接方法?？紤]到標(biāo)準(zhǔn)化96/384/1 536孔板的孔距,4/8/16通道的液體處理模塊應(yīng)用較為廣泛。同時(shí),相對于更高通量的96或384通道的液體處理模塊,4/8/16通道的模塊能夠更靈活地通過液體移取操作實(shí)現(xiàn)懸滴式蒸氣擴(kuò)散蛋白質(zhì)結(jié)晶。

Mosquito系列儀器是TTPlabtech公司發(fā)展的高通量液體處理機(jī)器人系統(tǒng)(http://ttplabtech. com)。該儀器利用轉(zhuǎn)盤式的機(jī)械傳送裝置,使用一次性的8或16通道的塑料取樣針進(jìn)行自動(dòng)化樣品處理。這種取樣針由一根空心塑料管和與其內(nèi)徑匹配的金屬針組成[14]。利用金屬針作為活塞進(jìn)行液體的量取和注射,有效避免了氣泡的干擾,具有較高的液體處理精度[15](見圖2)。該取樣針的取樣體積可低至25 nL,死體積小于0.3 nL[16]。其液體量取體積受到系統(tǒng)精度和一次性取樣針結(jié)構(gòu)的限制[17]。此外,Mosquito系列儀器可通過裝載加濕附件在幾分鐘之內(nèi)達(dá)到80%～90%的相對濕度,該濕度可有效減少90%的液體蒸發(fā)量[18]。同系列的Mosquito LCP可裝載一個(gè)LCP蛋白溶液移取通道,結(jié)合LCP預(yù)混附件,可用于基于脂質(zhì)立方相方法的膜蛋白結(jié)晶條件篩選。其最低注樣體積為25 nL,體積標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%[19]。

圖 2 基于活塞驅(qū)動(dòng)和一次性取樣針的Mosquito系統(tǒng)[15]Fig. 2 Mosquito system based on piston driving and disposable pipette tips[15]

Cherezov等[20,21]基于Sias公司Xantus液體操控平臺改裝建立了一個(gè)用于蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選的自動(dòng)化機(jī)器人(見圖3),主要用于基于LCP的膜蛋白結(jié)晶,也可以用于微批量法以及坐滴式蒸氣擴(kuò)散法的蛋白質(zhì)結(jié)晶。機(jī)器人含有2個(gè)機(jī)械臂,其中一號臂安裝有4個(gè)或8個(gè)微量注射泵作為4或8通道液體處理模塊;二號臂安裝用于處理LCP的微量注射泵,對LCP的點(diǎn)樣體積可低至50 nL。該系統(tǒng)通過將針頭插入濕海綿中來減少LCP的蒸發(fā),同時(shí)可清潔注射泵尖端的殘余立方相。LCP的典型操作程序?yàn)?首先利用二號臂在4個(gè)微孔中順序注入立方相,回到起始位置的同時(shí)激活一號臂;然后一號臂的4個(gè)注射泵同時(shí)吸取4種沉淀劑,并注入上述微孔;最后,將4個(gè)注射泵針頭移到裝滿超純水的深孔板中清洗,回到停留位置準(zhǔn)備下一次沉淀劑的移取[21]。通過計(jì)算機(jī)軟件設(shè)置,該機(jī)器人可以持續(xù)完成12塊96孔結(jié)晶板的點(diǎn)樣。

圖 3 基于Xantus的脂質(zhì)中間相蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選機(jī)器人[21]Fig. 3 In meso crystallization robot based on Xantus[21]

為了提高沉淀劑溶液的處理速度,可以采取更高通量的96或384通道的液體處理模塊配合相應(yīng)的多孔板和結(jié)晶板來完成沉淀劑液體的吸取和點(diǎn)樣。目前,96或384通道的液體處理模塊主要應(yīng)用于基于坐滴的蒸氣擴(kuò)散結(jié)晶。

Art Robbins Instruments公司的Crystal Phoenix使用96通道的注射泵模塊來完成沉淀劑液體移取過程(http://www.artrobbins.com),其處理液體的范圍在100 nL～100 μL。相對于使用一次性取樣針的Mosquito系列,Phoenix的96通道注射泵針頭重復(fù)使用,因此在更換沉淀劑溶液時(shí)需要進(jìn)行徹底的清洗。同時(shí),Phoenix采用噴墨打印的液體處理方式(inkjet-printing)來完成水溶性蛋白質(zhì)樣品的超快速分配,在50 s內(nèi)可完成一塊96孔板上蛋白質(zhì)的分配。Phoenix可用于基于懸滴或坐滴的蒸氣擴(kuò)散法、微晶種法和微批量法等方法,蛋白質(zhì)的樣品消耗在100 nL至400 nL。由于配備了96通道的沉淀劑液體處理系統(tǒng)和蛋白質(zhì)高速分配系統(tǒng),Phoenix可以在2 min左右完成一塊96孔板的液體操作,因此并未配備防蒸發(fā)的附件。此外,該公司的Crystal Gryphon LCP型號儀器可將噴墨打印注射頭更換為LCP注射泵。配合LCP預(yù)混附件的使用,可以實(shí)現(xiàn)基于脂質(zhì)立方相和雙膠束法(bicelles)的膜蛋白結(jié)晶篩選。

Li等[22]使用超聲加工技術(shù),在熔融石英片上加工出直徑1.2 mm、深2.5 mm、間距5 mm的81孔微型蛋白質(zhì)結(jié)晶板,并利用兩套81根的毛細(xì)管束和81個(gè)裝有沉淀劑的密封瓶實(shí)現(xiàn)了81種條件的自動(dòng)化蛋白質(zhì)結(jié)晶快速篩選。每個(gè)沉淀劑密封瓶含有一根輸入毛細(xì)管和一根輸出毛細(xì)管。所有的輸入毛細(xì)管連接至一個(gè)5 mL的注射器上。所有的輸出毛細(xì)管連接至微型蛋白質(zhì)結(jié)晶板的81個(gè)微孔中。利用注射器向輸入毛細(xì)管中注入一定量的水,將沉淀劑瓶中的沉淀劑置換出來,利用輸出毛細(xì)管傳輸至微孔中。該篩選裝置被用于完成模型蛋白的81種結(jié)晶條件篩選,并進(jìn)行了相圖的研究。

圖 4 同步納升定量吸取注射技術(shù)[24]Fig. 4 Synchronized nanoliter quantitative aspirate-dispense technology (SynQUAD)[24]

2 同步納升定量吸取注射技術(shù)及結(jié)晶篩選儀器

同步納升定量吸取注射技術(shù)(synchronized nanoliter quantitative aspirate-dispense, SynQUAD)是Cartesian Technologies公司(http://www.seaviewsci.com/cartesian/)發(fā)展的一種基于注射泵和電磁閥的高速液體處理技術(shù)。該技術(shù)在注射泵的出口端安裝了一個(gè)高速響應(yīng)的電磁閥來控制流體[23,24]。利用計(jì)算機(jī)控制實(shí)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)和電磁閥開關(guān)的同步,可實(shí)現(xiàn)高速運(yùn)動(dòng)過程中在指定位置進(jìn)行液體的分配,液體的分配方式為非接觸式(見圖4)。相對于常規(guī)基于移液器和注射泵技術(shù)的順序液體處理過程,SynQUAD的處理速度顯著提高,因此被稱為“on-the-fly”模式[24]。在此模式下單通道的注射泵可以在30 s之內(nèi)完成一個(gè)1 536孔板的注射[25]。通過調(diào)節(jié)注射泵的流速和電磁閥的打開時(shí)間,可實(shí)現(xiàn)較大動(dòng)態(tài)范圍的液體處理體積,其體積范圍為20 nL～8 μL[26]。

Cartesian Technologies公司早期的PixSys SQ和ProSys SQ系列液體處理儀器,配備有1、4或8個(gè)SynQUAD模塊,可以在1 min內(nèi)在1 536孔板中注滿2～10 μL的液體[23]。Stock等[27]利用具有濕度保持裝置的PixSys 4200進(jìn)行了大規(guī)模蛋白質(zhì)結(jié)晶條件篩選,在3 h內(nèi)可完成15個(gè)96孔板共1 440種條件篩選實(shí)驗(yàn)。

Digilab公司基于SynQUAD技術(shù),針對蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選需求,研制了一系列HoneyBee蛋白質(zhì)結(jié)晶機(jī)器人,可用于基于懸滴或坐滴的蒸氣擴(kuò)散法,以及微批量法等結(jié)晶方法[24],同時(shí)可以根據(jù)具體篩選需求對各模塊進(jìn)行靈活設(shè)計(jì)和組裝(http://www.digilabglobal.com)。HoneyBee系列目前有6種型號,分別為961、963、X8、81、161和Automated,其蛋白質(zhì)溶液處理模塊均采用SynQUADTM技術(shù),沉淀劑處理技術(shù)具有多種選擇。其中HoneyBee 961或963另可配96通道注射泵的沉淀劑處理模塊。

基于同樣的原理,Mueller等[28]利用電磁閥控制技術(shù),通過控制電磁脈沖,對事先形成的蛋白質(zhì)-沉淀劑近飽和溶液進(jìn)行精確移取。其中每次電磁閥開啟10 ms,可精確釋放50 nL的溶液。他們以250 nL的體積依次在玻片上形成結(jié)晶液滴,配合96通道的沉淀劑注射系統(tǒng),實(shí)現(xiàn)了半自動(dòng)小體積懸滴法的蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選。

3 基于噴墨打印的液體處理技術(shù)和結(jié)晶篩選儀器

基于噴墨打印的液體處理技術(shù)發(fā)展較為成熟,其主要的應(yīng)用領(lǐng)域是辦公印刷和功能材料打印等。這種能準(zhǔn)確產(chǎn)生超微量液滴的技術(shù)在藥物篩選領(lǐng)域很早就受到了廣泛的關(guān)注[29]。噴墨打印技術(shù)主要有兩種,即壓電式噴墨打印(piezoelectric inkjet)和熱感應(yīng)噴墨打印(thermal inkjet,又名氣泡噴墨打印)。壓電式噴墨打印技術(shù)在噴嘴口集成壓電單元,內(nèi)部在負(fù)壓狀態(tài)下自動(dòng)充滿液體。當(dāng)輸入脈沖信號,壓電單元發(fā)生形變,從而將一定體積的液體從噴口噴出[30]。熱感應(yīng)噴墨打印技術(shù)則是在噴口內(nèi)部集成一個(gè)加熱單元,噴頭內(nèi)部充滿液體。當(dāng)接收到脈沖信號,加熱單元迅速啟動(dòng)產(chǎn)生高溫,使其周圍液體氣化生成氣泡,從而將一定體積的液體噴出,同時(shí)氣泡破裂消散[31]。目前,熱感應(yīng)打印技術(shù)可以處理的最小液體體積在pL數(shù)量級。上文(1.2節(jié))提到的Phoenix和Gryphon系列即采用了熱感應(yīng)噴墨打印噴頭。

基于熱感應(yīng)式噴墨打印技術(shù),惠普公司(Hewlett-Packard, HP)與Tecan公司合作研制的HP D300 Digital Dispenser,是目前較先進(jìn)的噴墨打印液體處理系統(tǒng)(http://www8.hp.com/, http://lifesciences.tecan.com),可以用于蛋白質(zhì)結(jié)晶的篩選[15]。HP D300 Digital Dispenser具有8通道和4通道兩種噴頭,同時(shí)配備有溶液過濾裝置,可以避免溶液中的顆粒物堵塞噴頭。對一般溶液,使用HP T8+Dispensing Cassette噴頭,其可處理的液體體積為11 pL～10 μL, RSD<8%。對含有表面活性劑的水溶液或含有生物分子的二甲基亞砜(DMSO)溶液,使用HP D4+Dispensing Cassette噴頭,其可處理的液體體積為1 nL～10 μL。

圖 5 超聲液滴噴射技術(shù)Fig. 5 Acoustic droplet ejection technology

4 基于超聲液滴噴射的自動(dòng)化結(jié)晶篩選儀器

超聲液滴噴射技術(shù)(acoustic droplet ejection, ADE)是20世紀(jì)發(fā)展的一種微量液體處理技術(shù)[32]。其主要原理是,通過控制容器底部的超聲發(fā)生器將超聲能量聚焦于液-氣界面上。當(dāng)發(fā)出超聲脈沖時(shí),液體表面會(huì)形成一個(gè)液峰,從而噴射出微量的液滴,并轉(zhuǎn)移至目標(biāo)孔板或者表面載體上(見圖5)。液滴體積、速度和噴射方向等參數(shù)均具有良好的重現(xiàn)性[33]。其產(chǎn)生的液滴的直徑主要由超聲能量的脈沖寬度[34]、超聲能量焦點(diǎn)的大小以及超聲脈沖的頻率等因素決定[33]。通過控制超聲的頻率和功率,可精確調(diào)整液滴的體積和生成頻率,這種技術(shù)生成的最小液滴直徑可小至5 μm[35]。與其他液體處理技術(shù)相比,超聲液滴噴射技術(shù)是一種完全非接觸式液體處理技術(shù),不需要移液頭、流體管路、微腔室等,因此有效避免了交叉污染和吸附導(dǎo)致的樣品損失。Barlaam等[36]基于注射泵方法和超聲液滴噴射方法,分別測定并得到了EphB4和EphA2兩種蛋白受體的抑制劑的IC50值。Ekins等[37]基于這些數(shù)據(jù),結(jié)合計(jì)算機(jī)模擬和數(shù)據(jù)匹配的結(jié)果,認(rèn)為非接觸的超聲噴射方法在高通量篩選領(lǐng)域所獲得數(shù)據(jù)更為可靠。傳統(tǒng)的注射泵方法可能因?yàn)楸砻嫖健⒎磻?yīng)、機(jī)械應(yīng)力等原因而產(chǎn)生不準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。最近的研究也表明,對于蛋白質(zhì)結(jié)晶和篩選的研究,超聲液滴噴射技術(shù)可以提高蛋白質(zhì)晶體的質(zhì)量[38]、方便晶體裝載[39]和提高篩選通量[40]。

Labcyte公司的Echo 550及同系列其他自動(dòng)化液體操縱儀器(http://www.labcyte.com/)采用了超聲液滴噴射技術(shù),可用于處理蛋白質(zhì)溶液和結(jié)晶篩選沉淀劑。該儀器最小噴射液滴(即液滴分辨率)為2.5 nL,可準(zhǔn)確將所需溶液轉(zhuǎn)移到96、384、1 536和3 456孔板中。Teplitsky等[41]采用蒸汽擴(kuò)散法,利用Echo 550分別實(shí)現(xiàn)了嗜熱菌蛋白酶和胰蛋白酶的共結(jié)晶,結(jié)晶蛋白溶液體積僅為2.5 nL。此外,他們還利用不同配體,分別研究了溶菌酶和索馬甜蛋白的共結(jié)晶情況,以及小分子或配體與蛋白質(zhì)的共結(jié)晶情況。

EDC Biosystems公司的ATS系列超聲液體處理儀(ATS Acoustic Liquid Dispenser)也是一種采用超聲液滴噴射技術(shù)的商品化儀器(http://www.edcbiosystems.com/)。它可以噴射的液滴體積為1～10 nL,能轉(zhuǎn)移的液體體積為1 nL～2 μL(對于ATS Gen-5,液滴體積范圍為1～20 nL,可轉(zhuǎn)移液體體積最多為100 μL),因此特別適用于小體積反應(yīng)。Villasenor等[42]利用ATS 100實(shí)現(xiàn)了6種蛋白質(zhì)的結(jié)晶篩選,篩選體積為40 nL,包含20 nL蛋白質(zhì)和20 nL沉淀劑。其處理單個(gè)96孔結(jié)晶板中的液滴生成和混合過程,總耗時(shí)僅為45 s。他們測試了ATS 100對5個(gè)常用的蛋白質(zhì)結(jié)晶試劑盒的液體處理的準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性,結(jié)果顯示,在20～60 nL范圍內(nèi),該儀器對不同理化性質(zhì)的溶液所分配的體積具有不同的RSD，約73%的溶液的RSD<10%, 87%的溶液的RSD<15%。因此,超聲液滴噴射技術(shù)對于不同黏度、不同表面張力的蛋白質(zhì)和沉淀劑溶液,需要進(jìn)行系統(tǒng)性的校準(zhǔn),來提高篩選的準(zhǔn)確性。此外,基于超聲液滴噴射技術(shù)的蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選儀器的價(jià)格比較高[15]。

5 基于微流控技術(shù)的自動(dòng)化結(jié)晶篩選儀器

微流控學(xué)是在微米級尺度的微結(jié)構(gòu)中操控流體的技術(shù)與科學(xué),其常規(guī)液體處理體積在fL至nL級別[43,44],因此微流控技術(shù)對于降低蛋白質(zhì)結(jié)晶中的樣品消耗方面具有較大的潛力。近年來,應(yīng)用于高通量蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選的微流控技術(shù)發(fā)展迅速[4],而相應(yīng)的商品化微流控結(jié)晶儀器仍較少。

Formulator和Mantis是Formulatrix公司根據(jù)聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane, PDMS)芯片微泵和微閥技術(shù)[45]原理而設(shè)計(jì)的、可用于蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選的自動(dòng)化儀器(http://formulatrix.com)。Formulator是一個(gè)自動(dòng)化溶液制備系統(tǒng),包括5個(gè)部分:溶液輸入端、微流控芯片、清洗臺、微孔板放置臺和掃碼器[46]。Formulator主體是集成有96個(gè)操控單元的微流控芯片,輸入端連接至多個(gè)試劑儲(chǔ)備液,輸出端連接至接收多孔板(見圖6a)。其典型操作過程為:首先關(guān)閉輸出閥,打開輸入閥,啟動(dòng)微膜泵吸入一定量的儲(chǔ)備液后;關(guān)閉輸入閥、打開輸出閥,再次啟動(dòng)微膜泵將儲(chǔ)備液注入至接收孔板內(nèi)。兩個(gè)微膜泵的體積分別為200 nL和2.5 μL,因此它可以處理的液體體積為200 nL或2.5 μL的倍數(shù)。當(dāng)更換溶液時(shí),控制清洗臺并將泵和管路清洗干凈。整個(gè)過程可以通過程序控制,并通過掃碼器與每一塊微孔板關(guān)聯(lián)。Formulator可快速形成大量具有類似組分的濃度或pH梯度溶液,特別適用于對初篩獲得的蛋白質(zhì)結(jié)晶條件進(jìn)行細(xì)篩(沉淀劑、添加劑的濃度或pH篩選等)。

Mantis是一種非接觸式液滴生成設(shè)備,其死體積僅為6 μL,因此特別適用于珍稀蛋白質(zhì)樣品的篩選[47]。它可以對移液頭或儲(chǔ)存管的樣品進(jìn)行快速的分液。與Formulator芯片類似,Mantis的核心是兩個(gè)芯片微膜泵,其體積分別為100 nL/500 nL或1 μL/5 μL(見圖6b)。微膜泵最多可在1 s內(nèi)驅(qū)動(dòng)10次,因此具有較高的液滴分配速度。通過程序設(shè)計(jì)、機(jī)械臂、芯片等模塊的組合,Mantis可以實(shí)現(xiàn)最多24種溶液的分液和混合。

圖 6 (a)Formulator[46]和(b)Mantis[47]的芯片單元結(jié)構(gòu)Fig. 6 Schematics of microfluidic chips for (a) Formulator[46]and (b) Mantis[47]

Protein bio solutions公司的Plug Maker系統(tǒng)(即Microcapillary Protein Crystallization System, MPCS)[48-50],采用了基于液滴微流控技術(shù)的微量蛋白質(zhì)結(jié)晶方法(http://www.pbiosolutions.com/)。Plug Maker系統(tǒng)的核心是具有T型液滴生成微通道的塑料芯片,包括一個(gè)油相通道和一個(gè)水相通道。水相通道具有3個(gè)分支,分別用于注入蛋白質(zhì)溶液、緩沖液和沉淀劑溶液,利用其相對流速的變化來生成含有不同蛋白質(zhì)和沉淀劑濃度梯度和配比的液滴反應(yīng)器(見圖7)。該芯片可以實(shí)現(xiàn)原位X射線衍射,也可以通過揭去蓋片的方式收獲晶體。此外,可將PDMS芯片與液滴裝載毛細(xì)管相連,實(shí)現(xiàn)大規(guī)模沉淀劑的稀疏矩陣篩選法[48]。對于800種結(jié)晶條件的篩選,其消耗蛋白質(zhì)溶液不到4 μL。

圖 7 Plug Maker系統(tǒng)進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)晶實(shí)驗(yàn)的顯微圖片[48]Fig. 7 A microphotograph of crystallization trials in Plug Maker[48]

6 一體化的全自動(dòng)液體處理工作站

隨著篩選規(guī)模的日益增加,為了進(jìn)一步提高通量和自動(dòng)化程序,自動(dòng)化液體處理儀器進(jìn)一步集成了編碼/解碼、孔板取樣、樣品處理、混合、儲(chǔ)存等一系列功能,發(fā)展成一體化、全自動(dòng)的多用途液體處理工作站。同時(shí),模塊化、可定制的液體處理系統(tǒng)逐漸成為生命科學(xué)研究領(lǐng)域自動(dòng)化的主流發(fā)展趨勢。一些生命科學(xué)研究實(shí)驗(yàn)室利用商業(yè)化機(jī)器人改裝成具備多種功能的液體處理平臺,并提供對外服務(wù)。Hamilton、Tecan、Formulatrix等儀器商也提供了一體化的全自動(dòng)液體處理工作站,不僅可以應(yīng)用于蛋白質(zhì)結(jié)晶領(lǐng)域,也可以應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)和分析化學(xué)等眾多領(lǐng)域。

早期的一體化工作站一般由蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選儀器改裝而成。2006年,歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室(European Molecular Biology Laboratory, EMBL)利用當(dāng)時(shí)Matrix Technologies公司的Hydra II-Plus-One結(jié)晶機(jī)器人、Zinsser Analytic公司的Lissy 2002移液機(jī)器人(www.zinsseranalytic.com)以及BoboSeal的HJ Bioanalytik自動(dòng)密封儀(http://www.hj-bioanalytik.de)組裝成集成液體處理、儲(chǔ)存、結(jié)晶、密封、孵化等功能的一體化液體處理平臺,并對外開放服務(wù)[51]。其中,Hydra II-Plus-One結(jié)晶機(jī)器人可以在單次操作中完成100 nL～2 μL液體移取。2 m長的Lissy 2002移液機(jī)器人包括8通道的移液懸臂,可用于結(jié)晶板和移液管的儲(chǔ)存和移動(dòng)等。工作站中132個(gè)儲(chǔ)存位可包括96個(gè)50 mL離心管、20個(gè)15 mL離心管和16個(gè)2 mL離心管。

2012年以來,涉及液體處理和高通量篩選的儀器商陸續(xù)研發(fā)出滿足實(shí)驗(yàn)室多種需求的一體化液體處理平臺,蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選是這類儀器的主要應(yīng)用之一。目前在這一類別中市場占有率較高的平臺有:Formulatrix公司的NT8; Hamilton公司的VANTAGE Liquid Handling System、Microlab STAR Line; Tecan公司的Freedom EVO?、FluentTMLaboratory Automation Solution等。

NT8是Formulatrix公司主要為滿足蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選的需求而設(shè)計(jì)的一體化液體處理平臺(http://formulatrix.com/)。NT8的8通道移液頭可以準(zhǔn)確地移取50 nL～1.8 μL的液體(相對標(biāo)準(zhǔn)偏差<5%),其配有的LCP注射器可兼容脂質(zhì)立方相蛋白質(zhì)結(jié)晶。此外,NT8的8通道注射頭裝載信號燈和壓感傳感器,可準(zhǔn)確判斷注射管頭是否接觸到結(jié)晶板,并可自動(dòng)尋找到合適的注樣距離,從而增加液體處理精確度并減少氣泡的生成。NT8集成了濕度控制模塊來恒定濕度,從而避免微量樣品蒸發(fā)帶來的篩選結(jié)果不準(zhǔn)確的問題。

VANTAGE Liquid Handling System是Hamilton公司的液體處理平臺,具有多通道移液、樣品儲(chǔ)存、多孔板編碼和解碼等多種功能,可處理液體體積范圍為0.5 μL～1 000 μL,處理液體體積精度小于6%,可選配單通道、96通道、384通道移液器。該系統(tǒng)具有超高容量的液體處理能力,單臺儀器最多可容納400塊多孔板。

Freedom EVO是Tecan公司2012年推出的液體處理平臺系列(http://lifesciences.tecan.com),可以應(yīng)用于高通量藥物篩選、細(xì)胞培養(yǎng)、核酸樣品制備、活性樣品的篩選、反應(yīng)庫管理、樣品質(zhì)量分析等領(lǐng)域。對于蛋白質(zhì)結(jié)晶的篩選,Freedom EVO可實(shí)現(xiàn)懸滴、坐滴和微批量法的自動(dòng)或半自動(dòng)操作。此外,還可以根據(jù)需要,選擇2通道、16通道、96通道、384通道的液體處理臂,處理的液體體積范圍為100 nL～5 mL。該系列液體處理平臺可通過電容或壓感的方法感應(yīng)移液槍頭是否與液面接觸,且每個(gè)通道均可獨(dú)立調(diào)整,因此可有效避免因液面高度不均而產(chǎn)生的移液不準(zhǔn)確問題,從而實(shí)現(xiàn)復(fù)雜的液體處理。

FluentTM實(shí)驗(yàn)室自動(dòng)化系統(tǒng)是Tecan公司2014年的產(chǎn)品,該平臺裝載了3個(gè)獨(dú)立控制的液體移取模塊,集成了存儲(chǔ)、多孔板自動(dòng)運(yùn)輸、編碼和識別、多通道液體移取等功能,能夠完成超高通量的全自動(dòng)液體處理操作。其中,Fluent 480、780、1 080分別具有30、48、72個(gè)板位,并設(shè)有多層儲(chǔ)存板架。當(dāng)設(shè)定好程序,它可以通過掃碼和機(jī)械臂移取微孔板等方式完成一系列準(zhǔn)備工作和液體處理。因此該系列產(chǎn)品在生物信息學(xué)建庫等需要超大規(guī)模樣品處理方面具有優(yōu)勢,可用于高通量基因篩選、免疫分析樣品準(zhǔn)備和蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選等領(lǐng)域。

7 總結(jié)與展望

近十年來,自動(dòng)化蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選儀器的篩選通量不斷提高、篩選所需的試劑樣品量也逐漸減少,儀器的可靠性和智能化程度獲得顯著的提升。傳統(tǒng)基于移液器和注射泵的篩選儀器,在原有的基礎(chǔ)上向模塊化、全自動(dòng)化以及多功能一體化的方向發(fā)展。通過集成樣品板與結(jié)晶板的編碼和儲(chǔ)存、溫度濕度控制、程序化樣品配置等多種功能,為蛋白質(zhì)結(jié)晶和篩選提供完整的自動(dòng)化解決方案。同時(shí),隨著實(shí)驗(yàn)需求的變化和新技術(shù)的發(fā)展,噴墨打印、超聲噴射、微流控等技術(shù)為高通量篩選儀器的研發(fā)提供了新的思路。這些新技術(shù)可以在快速、可靠進(jìn)行液體處理的同時(shí),將蛋白質(zhì)樣品和試劑的消耗量降低至nL甚至pL水平,這對降低實(shí)驗(yàn)成本、提高研究效率，尤其是對難以表達(dá)和純化的重要蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)解析具有重要意義。隨著這些微量液體處理技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展和應(yīng)用,其有可能逐步代替常規(guī)移液器和注射泵技術(shù),成為自動(dòng)化結(jié)晶篩選的主流技術(shù)。

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Advances in high-throughput, automated techniques and instrumentation for protein crystallization screening

LIANG Yiran, ZHU Ying*, FANG Qun*

(InstituteofMicroanalyticalSystems,DepartmentofChemistry,ZhejiangUniversity,Hangzhou310058,China)

In current structural biological researches, obtaining high quality protein crystals suitable for X-ray crystallography largely relies on high-throughput screening of hundreds to thousands of protein crystallization conditions. Recently, the rapid developments of automated liquid handling techniques and instrumentation provide effective and reliable solutions for protein crystallization and screening with high-throughput and low consumption. This article reviews the development of automated liquid handling techniques in protein crystallization area, including pipetting, syringe pump metering, synchronized nanoliter quantitative aspirate-dispense, inkjet-printing, acoustic dispensing and microfluidics. Their advantages and disadvantages for protein crystallization are discussed. In addition, we also introduce several fully-integrated crystallization workstations, which mostly based on pipetting and syringe pump techniques. These workstations integrate multiple functions including bar coding, plate handling, plate storage, environmental control and software management.

automated liquid handling; protein crystallization; high-throughput screening; instrumentation; review

10.3724/SP.J.1123.2016.08009

2016-08-09

國家自然科學(xué)基金(21435004,21475117);浙江省自然科學(xué)基金(LY14B050001).

Foundation item: National Natural Science Foundation of China (Nos. 21435004, 21475117); Natural Science Foundation of Zhejiang Province (No. LY14B050001).

O658

A

1000-8713(2016)12-1137-08

鄒漢法研究員紀(jì)念專輯(上)·專論與綜述

* 通訊聯(lián)系人.E-mail:yingzhu@zju.edu.cn(?，?;E-mail:fangqun@zju.edu.cn(方群).