廣西煙草立枯病菌和靶斑病菌菌絲融合群初步分析

陳媛媛，譚海文，盧燕回，黎起秦，林 緯，袁高慶

（1.廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣西 南寧 530005；2.田陽縣農(nóng)業(yè)局，廣西 田陽 533600；3.中國煙草總公司廣西壯族自治區(qū)公司，廣西 南寧 530022）

廣西煙草立枯病菌和靶斑病菌菌絲融合群初步分析

陳媛媛1，譚海文2，盧燕回3，黎起秦1，林 緯1，袁高慶1

（1.廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣西 南寧 530005；2.田陽縣農(nóng)業(yè)局，廣西 田陽 533600；3.中國煙草總公司廣西壯族自治區(qū)公司，廣西 南寧 530022）

為了明確廣西煙草立枯病菌和靶斑病菌的菌絲融合群，從廣西發(fā)病煙草植株上分離了2株煙草立枯病菌菌株和3株靶斑病菌菌株。經(jīng)形態(tài)特征和細胞核染色觀察發(fā)現(xiàn)，這5株菌株均屬于多核立枯絲核菌。依據(jù)供試菌株與標(biāo)準(zhǔn)菌株的菌絲融合反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)廣西煙草立枯病菌和靶斑病菌均包含AG-2和AG-4兩個菌絲融合群。進一步分析5個菌株的rDNA-ITS序列，初步明確這2種病原菌包括AG-4 HG-I和AG-2-2 IIIB 兩個菌絲融合群，與菌絲融合反應(yīng)分析結(jié)果相吻合。首次在國內(nèi)從煙草靶斑病組織上分離到AG-2 和AG-4 融合群。

煙草立枯??；煙草靶斑病；立枯絲核菌；菌絲融合群

1 材料與方法

1.1 病原菌的分離和純化

采用水瓊脂法［9］分離立枯絲核菌。即將疑似煙草立枯病的病莖或靶斑病的病葉沖洗干凈，保濕1 d，挑取病斑處的菌絲移入水瓊脂（WA）平板上，28℃培養(yǎng)2 d后進行單菌絲切割，移植于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）平板上培養(yǎng)，最后將獲得的純培養(yǎng)物保存于PDA斜面試管中。

1.2 病原菌的培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征觀察

根據(jù) Parmeter等［10］的鑒定標(biāo)準(zhǔn)，鏡檢初步確認是立枯絲核菌后，觀察病原菌的培養(yǎng)性狀。病原菌細胞核的測定參照黃江華等［11］的方法，將供試菌株移入PDA 平板上，在培養(yǎng)基上斜插入滅菌蓋玻片，28℃下培養(yǎng)，待菌絲長至蓋玻片的1/2 處左右時，取出蓋玻片，滴上番紅O-KOH染色液染色3 min，光學(xué)顯微鏡下鏡檢細胞核數(shù)目。

1.3 立枯絲核菌的菌絲融合試驗

菌絲融合群標(biāo)準(zhǔn)菌株AG-1-IA、AG-2-2 IIIB、AG-2-2 IV、AG-2-I、AG-4、AG-9、AGBI，由廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物研究所惠贈。采用玻片對峙培養(yǎng)法，將獲得的立枯絲核菌株分別與菌絲融合群標(biāo)準(zhǔn)菌株進行配對培養(yǎng)12～24 h，鏡檢菌絲的融合情況，初步判別各待測菌株的菌絲融合群［12］。

1.4 病原菌的rDNA-ITS序列測定

將煙草立枯病菌菌株以及靶斑病菌菌株置于馬鈴薯葡萄糖（PD）培養(yǎng)液中28℃、黑暗條件下靜置培養(yǎng)2 d，收集菌絲真空干燥，采用SDS法提取菌體DNA［13］。采用真菌核糖體基因內(nèi)源轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)的通用引物 ITS4和 ITS5對5個供試菌株的 rDNA-ITS 序列進行PCR擴增。50 μL反應(yīng)體系中含有：10×PCR緩沖液（含Mg2+） 5.0 μL，DNA模板（50 ng/μL）1.0 μL，dNTP（2 mmol/L） 5.0 μL，引物ITS4和ITS5各 4.0 μL（5 μmol/L），Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.5 μL，ddH2O 30.5 μL。反應(yīng)在Biometra TProfessional PCR儀上進行，擴增反應(yīng)程序為：94℃ 預(yù)變性 3 min; 94℃ 變性 40 s，55℃復(fù)性1 min，72℃ 延伸 1 min，進行35 個循環(huán)；72℃ 延伸 10 min。反應(yīng)完成后，取5μL擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，通過UVI FireReader 1D凝膠成相系統(tǒng)觀察結(jié)果，并對PCR產(chǎn)物送檢測序。將所得測序結(jié)果在GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫中進行比對分析，查找同源性最高的序列，并下載已有文獻報道過的相關(guān)菌株的rDNA-ITS序列，采用軟件Clustal X和MEGA 4進行系統(tǒng)發(fā)育分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征

從廣西羅城和德保獲得2個煙草立枯病菌菌株，從羅城和鐘山獲得3個靶斑病菌菌株。在28℃下培養(yǎng)，各供試菌株在PDA 的菌絲特征均表現(xiàn)為：菌絲分枝呈銳角至直角，分枝處縊縮明顯，分枝附近有一個隔膜，后期部分菌絲細胞

膨大呈橢圓體至筒狀，每個細胞有3～14個細胞核，符合立枯絲核菌的形態(tài)特征。培養(yǎng)3～4 d后，各菌株均可形成初期白色粉狀后期變褐的菌核。28℃培養(yǎng)14 d后，各供試菌株特征見表1和圖1（封二）。根據(jù)5個供試菌株的培養(yǎng)性狀，初步將菌株LC11-6和 LC11-10歸為一類，菌株DB11-1、 LC11-11和 ZS11-7歸為一類，不同類群菌株之間的培養(yǎng)性狀有明顯差別。煙草立枯病菌和煙草靶斑病菌均分別包含有這2類菌株。同一來源地的菌株，如LC11-6 、LC11-10和 LC11-11均來自羅城，包含有2個類群；而不同來源地的菌株從培養(yǎng)性狀上亦可歸為一類，如LC11-11和ZS11-7分別采自羅城和鐘山，屬于同一個類群。

表1 廣西煙草立枯病菌菌株和靶斑病菌菌株的培養(yǎng)性狀比較

2.2 立枯絲核菌的菌絲融合反應(yīng)

通過將供試菌株與各融合群標(biāo)準(zhǔn)菌株進行配對培養(yǎng)觀察，初步將菌株LC11-6、LC11-10劃分至AG-4融合群，菌株DB11-1、LC11-11、ZS11-7歸為AG-2融合群，與通過培養(yǎng)性狀劃分的類群結(jié)果相符合（圖2，封二）。

2.3 病原菌的rDNA-ITS序列測定

菌株LC11-6、DB11-1、LC11-10、LC11-11和ZS11-7的rDNA -ITS序列的PCR產(chǎn)物大小分別為483、513、508、497、683 bp，在GenBank中的登錄號分別為JN983494、JN983497、JN983495、JN983496和JN983498。通過序列同源性比對，這5個供試菌株獲得的rDNA -ITS序列與立枯絲核菌或其有性世代瓜亡革菌（T. cucumeris）的同源性達97%～100%。

使用軟件Clustal X對各供試菌株序列與從GenBank下載的17個相關(guān)序列進行比對，以R. cerealis作外群，采用軟件MEGA 4構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。菌株LC11-6和LC11-10的同源性達99%，以57%的支持率處于一個小分枝，并以98%的支持率與歸為R. solani AG-4 HG-I的2個菌株（AY270004、FM867595）處在一起；菌株ZS11-7、LC11-11和 DB11-1以82%的支持率與歸屬為R. solani AG-2-2 IIIB 的2個菌株（AB054857、AN054854）聚在一起，其中同源性高達100%的2個菌株LC11-11和ZS11-7以94%的支持率聚在一個小分枝上，兩者與同源性均為99%的菌株DB11-1以92%的支持率聚在一起。

rDNA-ITS序列分析結(jié)果顯示，5個供試菌株均為R. solani，其中菌株LC11-6和LC11-10為R. solani AG-4 HG-I，菌株DB11-1、LC11-11和 ZS11-7為R. solani AG-2-2 IIIB。通過rDNAITS序列鑒定的R. solani菌絲融合群結(jié)果和依據(jù)玻片對峙培養(yǎng)法分析的結(jié)果一致。

圖3 R. solani及其近緣種基于rDNA-ITS序列的分子系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)合病原菌的培養(yǎng)性狀、形態(tài)特征、ITS序列同源性比較以及系統(tǒng)發(fā)育樹分析的結(jié)果，將引起廣西煙草立枯病、靶斑病的病原菌鑒定為有絲分裂孢子真菌（mitosporic fungi）絲核菌屬（Rhizoctonia）立枯絲核菌（R. solani）。其中引起煙草立枯病的菌株LC11-6 和DB11-1分別屬于R. solani AG-4 HG-I和AG-2-2 IIIB；引起煙草靶斑病的菌株ZS11-7和LC11-11均屬于R. solani AG-2-2 IIIB，而另一個菌株LC11-10為R. solani AG-4 HG-I。

立枯絲核菌為土壤習(xí)居菌，不產(chǎn)生任何無性孢子，分布廣泛，可引起多種作物病害。R. solani作為一個復(fù)合種，不同菌株間在形態(tài)學(xué)、生理生化、病理學(xué)等方面存在較大差異。1937年，Schultz首次提出以菌絲融合為基礎(chǔ)來確定菌絲融合群，至今已報道立枯絲核菌有14個菌絲融合群（從AG- 1 到 AG-13、AG- BI）［14］。菌絲融合群能在一定程度上反映立枯絲核菌菌株間的親緣關(guān)系及其遺傳多態(tài)性，與該病菌的致病性及與寄主之間的互作緊密相關(guān)。目前菌絲融合分類法已成為研究R. solani遺傳多態(tài)性的通用分類方法。研究絲核菌菌絲融合群的傳統(tǒng)方法是玻片對峙培養(yǎng)法，隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)學(xué)科的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)R. solani不同融合群菌株間的rDNA-ITS區(qū)域序列存在很大變異性，采用該方法分析可以更簡單、快速、準(zhǔn) 確地獲知菌絲融合群信息［15］。本研究同時采用玻片對峙培養(yǎng)法和rDNA-ITS序列分析法，獲得的立枯絲核菌菌絲融合群結(jié)果相一致。

國外已有較多關(guān)于煙草上立枯絲核菌融合群的研究報道。Nicoletti等［16］在1999年將意大利及法國受害煙株上分離的立枯絲核菌分別歸屬為AG-1、AG-3、AG-4及AG-5融合群，另有部分菌株與AG-2-1的親緣關(guān)系最

近；Gurkanli等［17］報道該菌屬于AG-1-IB、AG-2-1、AG-4 HG-I、AG-4 HG-II 4個融合群；希臘主產(chǎn)煙區(qū)的立枯絲核菌的菌絲融合群也很豐富，包括AG-2-1、AG-4 HG-I、AG-4 HG-III及AG-5等4個融合群［18］；LaMondia 等［4］報道引起美國馬薩諸塞州煙草靶斑病的R. solani融合群為AG-3；Seema 等［14］在2006—2008年從印度卡納塔克邦煙苗莖基部分離獲得27個立枯病菌菌株，經(jīng)鑒定全部屬于AG-4 HG-I；Gonazlez等［19］認為AG-2-2和AG-4主要引起煙草莖部病害，而AG-3主要引起煙草靶斑??；但據(jù)Guadalupe等［20］對阿根廷西北地區(qū)煙草上的立枯絲核菌研究結(jié)果，AG 4 HG-I 和 AG 4 HG-III 主要引起煙草立枯病，AG 2-1既可導(dǎo)致立枯病也可引起靶斑病。與國外相比，國內(nèi)有關(guān)為害煙草的立枯絲核菌的研究較少。吳元華［21-22］、Zhao等［23］報道我國遼寧地區(qū)的煙草靶斑病菌屬于AG-3融合群；蘇燕妮等［7］分析認為我國吉林省和黑龍江省的煙草靶斑病菌也屬于AG-3融合群。除了多核絲核菌引起煙草病害外，在希臘、土耳其和阿根廷還發(fā)現(xiàn)雙核絲核菌（binucleate Rhizoctonia ，BNR）可以引起煙草根腐?。?8，20，24］。以上研究結(jié)果反映出為害煙草的絲核菌種群的多樣性。

本研究中廣西的3個煙草靶斑病菌菌株均不屬于AG-3融合群，卻包括AG-2-2 IIIB和AG-4 HG-I兩個融合群，這與已知的國內(nèi)報道結(jié)果不相同；目前有關(guān)AG-4可引起煙草葉片田間自然發(fā)病的現(xiàn)象僅出現(xiàn)在美國卡羅萊納州北部，據(jù)報道當(dāng)?shù)?984—1989年發(fā)生的煙草靶斑病由少量AG-4 菌株引起［25］。本研究中另外兩個廣西煙草立枯病菌菌株分屬于AG-2-2 IIIB和AG-4 HG-I這兩個融合群，與Gonazlez等［19］對煙草立枯病菌的研究結(jié)果一致。引起不同煙區(qū)煙草病害的R. solani隸屬于不同菌絲融合群或亞群的原因可能與地點、環(huán)境、煙草品種、侵染部位等多種因素有關(guān)，但具體原因有待探討。本研究結(jié)果也在一定程度上顯示出廣西煙草上立枯絲核菌菌絲融合群的多樣性和獨特性，值得進一步深入研究。

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（責(zé)任編輯 楊賢智）

Anastomosis groups of Rhizoctonia solani causing tobacco sore shin and target spot in Guangxi

CHEN Yuan-yuan1，TAN Hai-wen2，LU Yan-hui3，LI Qi-qin1，LIN Wei1，YUAN Gao-qing1
（1. College of Agriculture，Guangxi University，Nanning 530005，China；2. Tianyang Agriculture Bureau，Tianyang 533600，China；3. Guangxi Zhuang Autonomous Region Tobacco Company of CNTC，Nanning 530022，China）

In order to investigate the anastomosis groups of the pathogens causing tobacco sore shin and target spot in Guangxi，two strains were isolated from diseased basal stems and three strains were isolated from diseased leaves. Based on morphological characteristics and nuclear staining，five strains were identified as Rhizoctonia solani and they all belonged to multinucleate. Through hyphal anastomosis reactions between tested strains and standard strains，the pathogens of tobacco sore shin and target spot in Guangxi were all divided into two anastomotic groups: AG-2 and AG-4. Moreover，ITS sequences analysis of the five strains indicated that the two anastomosis groups were AG-4 HG-I and AG-2-2 IIIB，and it was in accord with the result of hyphal anastomosis reaction. AG-2 and AG-4 were firstly found in tobacco leaf in China．

tobacco sore shin；tobacco target spot；Rhizoctonia solani；anastomosis groups

S435.72

A

1004-874X（2016）10-0106-06

2016-07-20

中國煙草總公司廣西壯族自治區(qū)公司科技創(chuàng)新項目（2014-07）

陳媛媛（1990-），女，在讀碩士生，E-mail：724919508 @qq.com

袁高慶（1971-），女，博士，副教授，E-mail：ygqtdc@sina.com

陳媛媛，譚海文，盧燕回，等. 廣西煙草立枯病菌和靶斑病菌菌絲融合群初步分析［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，43（10）：106-111.

煙草立枯病由立枯絲核菌（Rhizoctonia solani K ü hn）引起，于1904年由美國首次報道，目前在所有產(chǎn)煙國家均有分布，同時也是我國煙區(qū)的常見病害之一。在我國以往的報道中，

煙草立枯病主要屬于苗床期病害［1］，但近年來該病逐漸演變?yōu)榇筇锲诓『?，在我國福建、廣西等地都有發(fā)生且有為害加重的趨勢［2-3］。立枯絲核菌除為害煙株莖基部外，還可以為害煙葉，稱之為靶斑病。煙草靶斑病首次于1948年在巴西布雷爾烤煙上發(fā)現(xiàn)，1989年曾在美國北卡羅來納州流行，目前主要分布于美國、巴西、意大利、津巴布韋、南非等煙區(qū)［4］。吳元華等于2006年在我國遼寧丹東首次發(fā)現(xiàn)并報道煙草靶斑病［5］，之后該病在遼寧多個煙區(qū)普遍發(fā)生，局部田塊為害嚴(yán)重；2013年，在吉林省和黑龍江省的煙草種植區(qū)也發(fā)現(xiàn)該病，且發(fā)病面積廣造成損失重［6-7］；廣西最先是在2011年發(fā)現(xiàn)煙草靶斑病的為害，雖然發(fā)病僅局限于若干個煙區(qū)，但個別田塊發(fā)病率達到27%［8］。然而廣西煙草靶斑病的田間癥狀與吳元華等［5］報道的有所不同，表現(xiàn)在病斑無輪紋，雖然病斑壞死組織會破碎，但形狀并不似靶斑，病斑處也未發(fā)現(xiàn)立枯絲核菌的有性世代等［8］。煙草立枯病和靶斑病是廣西煙草大田期新出現(xiàn)的病害，很有必要對這兩種病害的病原菌進行鑒定，并探討其菌絲融合群分化狀況，以期為深入研究病原菌種群遺傳變異規(guī)律及抗病育種奠定基礎(chǔ)。