TBC1D1/4在有氧運動促進骨骼肌細胞葡萄糖轉(zhuǎn)運中的作用

王倩 傅力

天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)系(天津 300070)

TBC1D1/4在有氧運動促進骨骼肌細胞葡萄糖轉(zhuǎn)運中的作用

王倩 傅力

天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)系(天津 300070)

TBC1D1(Tre-2/BUB2/cdc1 domain family 1)和TBC1D4(又名Akt Substrate of 160 kDa，AS160)均為骨骼肌細胞內(nèi)的GTP酶激活蛋白(Rab-GTPase activating proteins,Rab-GAP)，參與骨骼肌細胞葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4(GLUT4)在細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)位過程，調(diào)節(jié)骨骼肌細胞葡萄糖轉(zhuǎn)運。最新研究表明，TBC1D1和TBC1D4在有氧運動促進骨骼肌細胞葡萄糖轉(zhuǎn)運過程中發(fā)揮重要作用，骨骼肌細胞胰島素信號通路活性下降引起GLUT4轉(zhuǎn)位異常、導(dǎo)致骨骼肌細胞葡萄糖轉(zhuǎn)運能力下降。有氧運動能夠顯著改善機體能量代謝水平，已被廣泛應(yīng)用于臨床肥胖、胰島素抵抗、2型糖尿病等代謝性疾病的治療。本文綜述TBC1D1和TBC1D4在有氧運動促進骨骼肌細胞葡萄糖轉(zhuǎn)運中的作用，以期為運動防治代謝性疾病的機制研究提供理論依據(jù)。

TBC1D1；TBC1D4；有氧運動；骨骼??；葡萄糖轉(zhuǎn)運

1 TBC1D1/4概述

TBC1D1和TBC1D4同屬TBC1D Rab-GTP酶激活蛋白家族，其氨基酸序列的基本結(jié)構(gòu)都包含一個Rab-GAP區(qū)、兩個磷酸酪氨酸結(jié)合區(qū)(phosphotyrosine-binding,PTB)和一個鈣調(diào)節(jié)素結(jié)合域(Calmodin binding domain,CBD)，TBC1D1和TBC1D4的Rab-GAP區(qū)氨基酸序列的同源性達79%[1，2]。到目前為止，通過PAS抗體(phospho Akt substrate antibody)能夠和TBC1D1和TBC1D4上的絲氨酸/蘇氨酸殘基發(fā)生反應(yīng)這一特性，發(fā)現(xiàn)TBC1D4共有8個磷酸化位點(絲氨酸318、絲氨酸341、絲氨酸570、絲氨酸588、蘇氨酸642、絲氨酸666、絲氨酸704、絲氨酸751)[3，4]，其中包括5個典型的AKT磷酸化位點；而TBC1D1有5個磷酸化位點(絲氨酸235、絲氨酸237、蘇氨酸596、絲氨酸660、絲氨酸700)，包括2個典型的AKT磷酸化位點，均毗鄰兩個PTB區(qū)的上游[5]。

TBC1D1和TBC1D4均是進化過程中高度保守的蛋白，小鼠和人類之間的同源性達90%。但是，TBC1D1和TBC1D4具有種屬特異性表達的特點，表現(xiàn)為TBC1D1表達于所有物種，而TBC1D4只在脊椎動物中表達。在同一物種的不同組織中其表達也不盡相同，小鼠酵解型肌纖維中多見TBC1D1，而脂肪組織幾乎不表達TBC1D1；TBC1D4主要表達于小鼠心臟、脂肪組織和氧化型肌纖維[6-8]。除此之外，不同類型骨骼肌纖維中TBC1D1和TBC1D4的表達量差異很大，小鼠脛骨前肌中TBC1D1的表達量分別是趾長伸肌和比目魚肌的3倍和10倍；小鼠趾長伸肌和脛骨前肌中TBC1D4的表達量均為比目魚肌的1/10[8]。然而，TBC1D1和TBC1D4在大鼠不同肌肉組織類型中的表達量并無差異，在人類腓腸肌、脛骨前肌和比目魚肌中的表達量也沒有顯著差異[8]。

眾所周知，有氧運動可顯著提高骨骼肌細胞葡萄糖代謝水平。有氧運動通過激活一磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)，引起TBC1D1和TBC1D4發(fā)生磷酸化，促進GLUT4囊泡轉(zhuǎn)位至細胞膜，加速骨骼肌細胞葡萄糖轉(zhuǎn)運[9]。除此之外，餐后血糖升高時，胰島β細胞分泌釋放胰島素入血，胰島素經(jīng)血液循環(huán)作用于骨骼肌細胞，與細胞膜表面受體結(jié)合引起胰島素受體底物(IRS)磷酸化，后者進一步磷酸化PI3K，并通過PI3K/AKT途徑磷酸化TBC1D1和TBC1D4，促進骨骼肌細胞葡萄糖轉(zhuǎn)運[10]。本文主要綜述TBC1D1和TBC1D4通過有氧運動激活A(yù)MPK促進骨骼肌細胞葡萄糖轉(zhuǎn)運。

2 TBC1D1在有氧運動促進骨骼肌細胞葡萄糖轉(zhuǎn)運過程中的作用

有氧運動以及AMPK激活劑AICAR(5-Aminoimidazole-4-carboxamide1-β-D-ribofuranoside)均能顯著提高骨骼肌細胞TBC1D1磷酸化水平，增加細胞葡萄糖轉(zhuǎn)運。機體進行有氧運動時，骨骼肌細胞AMPK活化后促進TBC1D1發(fā)生磷酸化，磷酸化的TBC1D1進而促進細胞葡萄糖轉(zhuǎn)運。AMPK在所有哺乳動物細胞中作為能量感受蛋白存在，在進化過程中高度保守。在運動情況下，機體組織細胞能量代謝水平升高，ATP消耗增加，造成細胞內(nèi)高AMP/ATP狀態(tài)，從而激活A(yù)MPK。AMPK的激活會促進能量產(chǎn)生過程，如葡萄糖轉(zhuǎn)運和脂肪酸氧化，抑制能量消耗過程，如蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的合成。有氧運動下，在小鼠及人類骨骼肌細胞中都已證實AMPK是TBC1D1的上游激酶，且發(fā)揮激酶作用的是AMPKα2/β2/γ3三聚體[11]。此外，體外實驗也表明，人類骨骼肌細胞中TBC1D1是AMPK的主要作用底物[12]。

GLUT4是參與骨骼肌細胞葡萄糖轉(zhuǎn)運的主要蛋白，安靜狀態(tài)下分布于骨骼肌細胞內(nèi)，受運動或胰島素等刺激時轉(zhuǎn)位至細胞膜上并與細胞膜融合。融合后的GLUT4成為葡萄糖轉(zhuǎn)運載體，運載葡萄糖進入細胞內(nèi)。GLUT4以多組分囊泡的形式發(fā)揮運載葡萄糖作用，GLUT4囊泡除了含GLUT4之外，主要蛋白還包括胰島素調(diào)節(jié)性氨肽酶(Insulin-regulated amino peptidase, IRAP)、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體、分泌載體膜蛋白、6-磷酸甘露糖受體糖蛋白、SNARE(Soluble N-ethylmaleimidesensitive fusion attachment protein receptors)和GTP結(jié)合蛋白。胞漿中的Rab蛋白通過與GTP結(jié)合的活化形式和與GDP結(jié)合的失活形式調(diào)控GLUT4囊泡的轉(zhuǎn)位。研究表明，人類基因組中存在60余種Rab蛋白，骨骼肌細胞中參與葡萄糖轉(zhuǎn)運的Rab蛋白包括Rab2, Rab8b,Rab10和Rab14[13，14]。基礎(chǔ)狀態(tài)下，骨骼肌細胞內(nèi)TBC1D1通過與IRAP這一GLUT4囊泡的主要蛋白質(zhì)相互作用定位于GLUT4囊泡上，成為GLUT4囊泡的一部分[15]，此時TBC1D1不發(fā)生磷酸化，具有Rab-GAP活性，細胞內(nèi)Rab蛋白裝載GDP，GLUT4囊泡不能轉(zhuǎn)位至細胞膜，導(dǎo)致葡萄糖不能被運載進入細胞內(nèi)；運動情況下，TBC1D1在AMPK的刺激下發(fā)生磷酸化，失去Rab-GAP活性，細胞內(nèi)Rab蛋白裝載GTP致GLUT4囊泡轉(zhuǎn)位至細胞膜，葡萄糖被運載進入細胞內(nèi)(詳見圖1)。實驗證實，TBC1D1與GLUT4囊泡的結(jié)合對骨骼肌細胞內(nèi)GLUT4囊泡的穩(wěn)定性發(fā)揮重要作用，TBC1D1的缺失或突變會導(dǎo)致大量GLUT4囊泡進入溶酶體降解[16]。

與野生型小鼠相比，在有氧運動刺激下，TBC1D1基因敲除(TBC1D1-/-)小鼠骨骼肌細胞葡萄糖轉(zhuǎn)運能力顯著降低，而由胰島素刺激的葡萄糖轉(zhuǎn)運并未發(fā)生改變，同時TBC1D1-/-小鼠的運動能力顯著下降，提示TBC1D1在有氧運動引起的葡萄糖轉(zhuǎn)運過程中發(fā)揮重要作用。但是TBC1D1的缺失對小鼠的最大運動速度并無影響[16]。然而，TBC1D1-/-小鼠骨骼肌細胞線粒體氧化磷酸化蛋白水平、非酯化脂肪酸水平以及糖原水平與野生型小鼠相比均沒有顯著變化[16]。與野生型小鼠相比，TBC1D1-/-小鼠趾長伸肌中GLUT4的表達水平減少了50%，而TBC1D1-/-小鼠和野生型小鼠趾長伸肌中GLUT4 mRNA表達水平?jīng)]有顯著差異，表明TBC1D1可能對GLUT4轉(zhuǎn)錄后修飾過程有潛在影響[17]。TBC1D1-/-小鼠骨骼肌細胞中GLUT4表達水平的顯著降低只發(fā)生于TBC1D4表達較少的肌肉類型，如趾長伸肌和脛骨前肌中，說明在骨骼肌細胞葡萄糖轉(zhuǎn)運中TBC1D4對TBC1D1的缺失具有補償效應(yīng)。值得注意的是，TBC1D4-/-小鼠骨骼肌細胞中GLUT4表達水平的降低發(fā)生在脛骨前肌和脂肪組織中[18]。與野生型小鼠相比，TBC1D1-/-小鼠經(jīng)有氧運動后，其骨骼肌細胞甘油三酯水平顯著下降，說明在有氧運動干預(yù)下，TBC1D1-/-小鼠骨骼肌細胞脂肪酸氧化水平增加[16]。實驗證實，人類骨骼肌細胞中，TBC1D1不同磷酸化位點對不同的刺激產(chǎn)生磷酸化效應(yīng)，TBC1D1-絲氨酸237、絲氨酸660和絲氨酸700位點只在運動干預(yù)下發(fā)生磷酸化，而TBC1D1-蘇氨酸596在運動干預(yù)和胰島素作用下均能發(fā)生磷酸化改變[11]。

與野生型小鼠相比，有氧運動對AMPKα2基因敲除(AMPKα2-/-)小鼠骨骼肌細胞中TBC1D1磷酸化位點的磷酸化作用明顯降低[19]，因此，有氧運動下，AMPKα2-/-小鼠骨骼肌細胞葡萄糖轉(zhuǎn)運顯著減少[20]，但是有氧運動對AKT失活小鼠骨骼肌細胞中TBC1D1磷酸化位點的作用以及葡萄糖攝入影響沒有異常[21]。野生型小鼠趾長伸肌收縮會增加TBC1D1-絲氨酸237和TBC1D1-蘇氨酸596的磷酸化，但是AMPKα2-/-小鼠中，在趾長伸肌收縮作用下，任何磷酸化位點都沒有磷酸化水平的增加[21]。同時，有氧運動也會增強骨骼肌細胞中TBC1D1和14-3-3蛋白的結(jié)合能力，但是AMPKα2-/-小鼠骨骼肌細胞中這種結(jié)合作用不會在有氧運動作用下增強，而AKT的失活不會影響有氧運動下骨骼肌細胞中TBC1D1和14-3-3蛋白的結(jié)合作用的增強[21]。跑臺運動干預(yù)能夠增加小鼠趾長伸肌TBC1D1-絲氨酸237、蘇氨酸596、絲氨酸660和絲氨酸700的磷酸化水平，但在比目魚肌中以上各個磷酸化位點的磷酸化水平均未發(fā)生改變，提示有氧運動對TBC1D1磷酸化活性的影響具有骨骼肌類型特異性，即酵解型快肌纖維的TBC1D1磷酸化水平易受運動干預(yù)的影響，而氧化型纖維TBC1D1磷酸化水平無顯著變化。此外，人體實驗表明，骨骼肌細胞TBC1D1還參與調(diào)控細胞代謝的能量感受信號AMPK相關(guān)途徑，但具體機制尚需進一步研究來證實[22]。

圖1　TBC1D1/4調(diào)節(jié)骨骼肌細胞葡萄糖轉(zhuǎn)運作用模式

3 TBC1D4在有氧運動促進骨骼肌細胞葡萄糖轉(zhuǎn)運中的作用

骨骼肌細胞中TBC1D4主要在胰島素作用下發(fā)生磷酸化從而促進葡萄糖轉(zhuǎn)運，但有研究表明，TBC1D4也是骨骼肌細胞中AMPK的作用靶點，同時AMPK的激活劑AICAR也能夠增加TBC1D4的磷酸化水平[24]。表達TBC1D4突變體的骨骼肌細胞中，有氧運動刺激的葡萄糖轉(zhuǎn)運降低20%～25%，進一步佐證了TBC1D4參與有氧運動刺激的葡萄糖轉(zhuǎn)運。

研究表明，TBC1D4-蘇氨酸642位點磷酸化是骨骼肌細胞葡萄糖轉(zhuǎn)運機制的關(guān)鍵步驟[23]。有氧運動刺激下，骨骼肌細胞中TBC1D4以與TBC1D1相同的方式作用于GLUT4囊泡，從而對葡萄糖轉(zhuǎn)運發(fā)揮作用(詳見圖1)。實驗證明，當骨骼肌細胞中表達能夠抑制TBC1D4磷酸化的突變體時，有氧運動刺激的葡萄糖轉(zhuǎn)運會明顯減少。小鼠脛骨前肌中TBC1D4會影響有氧運動刺激的葡萄糖轉(zhuǎn)運，但是對胰島素刺激的葡萄糖轉(zhuǎn)運沒有影響[25]，其中的機制尚不清楚。質(zhì)譜分析顯示，與其他骨骼肌組織類型相比，有氧運動后小鼠腓腸肌中TBC1D4有更高的磷酸化水平[26]。當小鼠進行30分鐘跑臺運動后，其腓腸肌組織中TBC1D4-蘇氨酸642磷酸化活性即增加[27]。而即使小鼠進行跑臺運動達60分鐘后，其趾長伸肌組織中TBC1D4上所有磷酸化位點均未發(fā)生變化[28]，同樣有氧運動亦未引起比目魚肌組織TBC1D4的磷酸化活性變化，提示有氧運動對TBC1D4磷酸化水平的增強作用具有骨骼肌類型表現(xiàn)特異性，但是這種特異性變化的機制目前尚不清楚。而當大鼠進行有氧運動后3～4 h，其脛骨前肌組織中TBC1D4-蘇氨酸642、絲氨酸588的磷酸化水平均顯著提高[28]。眾所周知，細胞內(nèi)的Ca2+是骨骼肌收縮的必要條件，小鼠脛骨前肌組織中，表達CBD突變體的TBC1D4不會影響胰島素刺激的葡萄糖轉(zhuǎn)運，但是會顯著抑制有氧運動引起的葡萄糖轉(zhuǎn)運[29]，提示Ca2+也是有氧運動增強骨骼肌細胞中TBC1D4磷酸化水平的必要條件。

耐力運動可增加氧化型肌纖維中TBC1D4的磷酸化水平。正常成年男性進行自行車訓(xùn)練(最大攝氧量67%)時，運動持續(xù)時間在30分鐘以內(nèi)，骨骼肌組織TBC1D4的磷酸化水平未發(fā)現(xiàn)顯著變化，運動持續(xù)時間達到60分鐘時，骨骼肌組織TBC1D4的磷酸化水平明顯升高，且隨著運動持續(xù)時間的延長其磷酸化水平隨之增加，并在90分鐘時達到峰值[26]。雖然正常成年男性有氧運動持續(xù)時間達到60分鐘時，骨骼肌組織TBC1D4磷酸化水平才會升高，但是14-3-3蛋白與TBC1D4的結(jié)合能力只在運動結(jié)束后即刻有所增加[28]。最新研究表明，在持續(xù)時間為60分鐘的電刺激實驗中，小鼠骨骼肌細胞中TBC1D4的磷酸化水平升高是短暫的，但是葡萄糖轉(zhuǎn)運一直持續(xù)進行[3]，提示有氧運動刺激的骨骼肌細胞中TBC1D4磷酸化和葡萄糖轉(zhuǎn)運并不是伴隨進行的。與其同源物TBC1D1一樣，人類骨骼肌細胞中TBC1D4不同磷酸化位點對不同的刺激產(chǎn)生磷酸化效應(yīng)，TBC1D4-絲氨酸588、絲氨酸751僅在運動干預(yù)下發(fā)生磷酸化，TBC1D4-絲氨酸318只在胰島素作用下發(fā)生磷酸化，TBC1D4-絲氨酸341、蘇氨酸642和絲氨酸704位點在運動干預(yù)和胰島素作用下均能發(fā)生磷酸化，而TBC1D4-絲氨酸666在運動干預(yù)和胰島素作用下均不能發(fā)生磷酸化[25]；與TBC1D1不同的是，有氧運動對TBC1D4的磷酸化作用與AMPKα2/β2/ γ1三聚體相關(guān)[11]。與有氧運動不同，急性運動刺激下，正常成年男性骨骼肌組織TBC1D4的磷酸化水平在運動結(jié)束即刻會降低，直到運動結(jié)束后幾小時有所增加，提示不同運動形式對骨骼肌組織TBC1D4的作用機制可能有所不同[30]。

4 小結(jié)

在有氧運動過程中，TBC1D1和TBC1D4共同促進骨骼肌細胞葡萄糖轉(zhuǎn)運，同時二者具有補償效應(yīng)。TBC1D1已被證實是骨骼肌細胞AMPK的主要作用底物，雖然TBC1D4主要在胰島素刺激的葡萄糖轉(zhuǎn)運中發(fā)揮作用，但有研究表明其對有氧運動刺激的葡萄糖轉(zhuǎn)運也具有促進效應(yīng)[29]。有氧運動激活A(yù)MPK，進而磷酸化骨骼肌細胞中的TBC1D1和TBC1D4，使其喪失Rab-GAP活性，從而促進GLUT4囊泡向細胞膜的轉(zhuǎn)位，促進骨骼肌細胞中葡萄糖的攝入；與此同時，TBC1D1和TBC1D4對細胞內(nèi)GLUT4囊泡的穩(wěn)定性也具有重要作用。探索有氧運動下TBC1D1和TBC1D4在骨骼肌細胞葡萄糖轉(zhuǎn)運中的作用對于胰島素抵抗、肥胖、2型糖尿病等代謝性疾病的預(yù)防及治療具有積極的意義。但是目前對TBC1D1和TBC1D4在骨骼肌細胞葡萄糖轉(zhuǎn)運中作用的具體機制所知甚少，仍然有許多問題需要更為深入的探討。

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2016.03.11

國家自然科學(xué)基金面上項目(31571220,31671237),天津市科技項目計劃(13ZCZDSY02000)

傅力，Email：lifu@tmu.edu.cn