自體軟骨細(xì)胞移植技術(shù)修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨損傷研究進(jìn)展

姜駱永陳潔琳崔家鳴林威熊建義王大平朱偉民

1深圳大學(xué)第一附屬醫(yī)院運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)科（廣東 深圳 518000）2深圳市運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室（廣東 深圳 518000）3深圳市組織工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（廣東 深圳 518000）

自體軟骨細(xì)胞移植技術(shù)修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨損傷研究進(jìn)展

姜駱永1，2，3陳潔琳2，3崔家鳴1，2，3林威1，2，3熊建義1，2，3王大平1，2，3朱偉民1，2，3

1深圳大學(xué)第一附屬醫(yī)院運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)科（廣東 深圳 518000）2深圳市運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室（廣東 深圳 518000）3深圳市組織工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（廣東 深圳 518000）

關(guān)節(jié)軟骨損傷后其再生能力極為有限。隨著細(xì)胞治療與軟骨組織工程等相關(guān)技術(shù)和學(xué)科的發(fā)展進(jìn)步，自體軟骨細(xì)胞移植術(shù)（autologous chondrocyte implantation，ACI）已發(fā)展到第三代。與傳統(tǒng)的治療方法相比，ACI技術(shù)在治療軟骨損傷方面有著明顯的優(yōu)勢，已被越來越多的患者接受，其臨床效果已得到肯定，但仍需進(jìn)一步改進(jìn)。本文對近年來國內(nèi)外的相關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行總結(jié)，從軟骨損傷的傳統(tǒng)治療方法及其發(fā)展、自體軟骨細(xì)胞移植術(shù)、基因修飾在ACI中的應(yīng)用等三個(gè)方面對自體軟骨細(xì)胞移植技術(shù)修復(fù)軟骨損傷進(jìn)行綜述，并分析其優(yōu)缺點(diǎn)和發(fā)展史，著重介紹自體軟骨細(xì)胞移植技術(shù)和基因修飾在其中的應(yīng)用。

軟骨損傷；自體軟骨細(xì)胞移植；基因修飾

關(guān)節(jié)軟骨損傷是一種常見病，多見于膝關(guān)節(jié)、髖關(guān)節(jié)等負(fù)重關(guān)節(jié)，常引起關(guān)節(jié)疼痛、腫脹及僵硬等癥狀，可對患者尤其是青少年造成不可逆的損害，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量[1]。關(guān)節(jié)軟骨組織主要由大量細(xì)胞外基質(zhì)和包裹其中的軟骨細(xì)胞組成，是一種缺乏血管、淋巴、神經(jīng)的特殊結(jié)締組織，其營養(yǎng)來源主要依賴于關(guān)節(jié)腔內(nèi)滑液和軟骨下骨的血供，再生能力有限，直徑大于4 cm的損傷一般不能自行修復(fù)[2]。至今已有多種治療方法應(yīng)用于膝關(guān)節(jié)軟骨損傷的修復(fù)，包括最初采用的穿破軟骨損傷區(qū)域軟骨下骨，使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化修復(fù)軟骨損傷的骨髓刺激技術(shù)，到后來利用在骨膜和軟骨膜中存在間充質(zhì)干細(xì)胞來修復(fù)軟骨損傷的骨膜移植以及自體/異體軟骨組織移植技術(shù)。近年來，隨著細(xì)胞治療及組織工程技術(shù)的發(fā)展，目前對軟骨損傷的治療方法是基于細(xì)胞和組織工程方法來修復(fù)軟骨損傷的技術(shù)。

1 傳統(tǒng)治療方法及其發(fā)展

傳統(tǒng)治療軟骨損傷的方法主要包括關(guān)節(jié)灌洗、骨髓刺激術(shù)（鉆孔和微骨折術(shù)）及自體軟骨移植術(shù)等。研究報(bào)告稱骨髓刺激術(shù)在小范圍損傷的年輕患者中治療效果顯著，對于年齡偏大的患者效果欠佳[3]。微骨折術(shù)修復(fù)的主要是纖維軟骨，其硬度、生物力學(xué)、耐摩擦能力等均無法與正常的透明軟骨相比[4]，后期退變風(fēng)險(xiǎn)較大。Stanish等[5]將混有自體全血的殼聚糖填塞到運(yùn)用微骨折術(shù)處理過的軟骨損傷處，經(jīng)證實(shí)有利于增加血凝塊的穩(wěn)定性及促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化。Sharma等[6]成功利用可注射性水凝膠結(jié)合微骨折術(shù)對軟骨損傷進(jìn)行修復(fù)，由于該水凝膠具有可注射性和可塑性，因此該方法在修復(fù)不規(guī)則軟骨損傷時(shí)具有明顯的優(yōu)勢。自體骨軟骨移植術(shù)（Osteochondralautograft transfer，OAT）通過移植非負(fù)重區(qū)的骨軟骨栓至軟骨損傷處進(jìn)行修復(fù)。該方法受供區(qū)軟骨來源限制，通常僅用于損傷面積較小的患者。Marcacci等[7]對30例軟骨損傷面積小于2.5 cm2的膝關(guān)節(jié)全層軟骨損傷的患者行自體骨軟骨移植治療，術(shù)后隨訪7年，結(jié)果顯示：對于較小的軟骨損傷，自體骨軟骨移植術(shù)表現(xiàn)出較好的中、長期療效。Lane等[8]研究也表明自體骨軟骨移植對于面積小于2 cm2的軟骨損傷的修復(fù)效果最佳，對于面積在2～4 cm2的軟骨損傷也有很好的臨床療效。面積小于4 cm2的軟骨損傷患者選擇OAT技術(shù)可達(dá)到較好的臨床療效，而對于損傷面積大于4 cm2的患者則建議選擇細(xì)胞移植療法。盡管異體軟骨移植術(shù)可以解決OAT供體來源不足等問題，但是由于存在移植物排斥和疾病傳染等風(fēng)險(xiǎn)，該技術(shù)在應(yīng)用上受到一定的制約[9]。

2 自體軟骨細(xì)胞移植術(shù)

自體軟骨細(xì)胞移植技術(shù)（autologous chondrocyte implantation，ACI）是基于自體軟骨細(xì)胞體外擴(kuò)增后進(jìn)行回植修復(fù)的技術(shù)。研究表明，體外培養(yǎng)擴(kuò)增的軟骨細(xì)胞能較好地維持其細(xì)胞特性，利于軟骨修復(fù)[10]。一項(xiàng)進(jìn)行了至少10年的隨訪研究證實(shí)，ACI能使70%的患者獲得滿意的長期療效[11]。ACI治療軟骨缺損的適應(yīng)癥包括：①軟骨損傷面積大于2 cm2；②外傷或剝脫性骨軟骨炎引起的軟骨缺損；③患者年齡一般在15～55歲；④患者愿意接受并配合執(zhí)行嚴(yán)格的康復(fù)計(jì)劃；⑤無系統(tǒng)性感染[12]。對于有以下情況之一者不建議使用ACI治療：①類風(fēng)濕性或炎性關(guān)節(jié)炎相關(guān)的軟骨缺損；②體重指數(shù)（BMI）高于正常值1.5倍的肥胖患者；③除外下列感染性疾病，如HIV、乙型、丙型肝炎、梅毒等；④伴有全身或局部感染。對于下列病理狀況則需在術(shù)前或術(shù)后予以矯正：①交叉韌帶不穩(wěn)定或承重線不良的關(guān)節(jié)；②髕骨切跡異常；③半月板病變或功能性半月板缺失。以下將分述三代ACI技術(shù)的發(fā)展。

2.1第一代自體軟骨細(xì)胞移植術(shù)

1987年，瑞典醫(yī)生Brittberg在世界范圍內(nèi)首次進(jìn)行了利用體外培養(yǎng)的自體軟骨細(xì)胞治療軟骨損傷的研究，并于1994年將該技術(shù)發(fā)表在《新英格蘭醫(yī)學(xué)》上[13]。第一代ACI（P-ACI）技術(shù)將體外混懸培養(yǎng)的自體軟骨細(xì)胞移植到軟骨損傷處，并結(jié)合自體骨膜進(jìn)行覆蓋，該方法可修復(fù)深度在6～8 mm以上的軟骨損傷[14]。由于其采用自體骨膜覆蓋，容易出現(xiàn)骨膜增生現(xiàn)象，往往需要通過關(guān)節(jié)鏡進(jìn)行再次切除[15]，造成軟骨下骨密度增加，增加了新生軟骨組織承受的應(yīng)力，從而導(dǎo)致新生軟骨組織發(fā)生退化[16]。Henderson[17]等對170例術(shù)后患者進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2年內(nèi)需再次手術(shù)解決骨膜增生問題的患者高達(dá)74%，跟蹤隨訪表明該部分患者關(guān)節(jié)功能恢復(fù)明顯差于未進(jìn)行再次手術(shù)者。

2.2第二代自體軟骨細(xì)胞移植術(shù)

第二代ACI（C-ACI）使用膠原膜替代自體骨膜覆蓋于軟骨損傷處，減少了摘取骨膜引起的并發(fā)癥和簡化了手術(shù)的操作流程。研究顯示C-ACI臨床療效與PACI相當(dāng)，而新生軟骨增生肥大現(xiàn)象則相對減少。Steinwachs等[18]對63例膝關(guān)節(jié)軟骨損傷患者應(yīng)用I/III型膠原膜進(jìn)行覆蓋，術(shù)后隨訪3年，關(guān)節(jié)鏡探查未發(fā)現(xiàn)新生軟骨增生肥大跡象。Samuelson等[19]研究顯示，CACI手術(shù)使用膠原膜的費(fèi)用比用自體骨膜高，但長遠(yuǎn)來看，由于骨膜增生需要進(jìn)行二次手術(shù)及處理相關(guān)并發(fā)癥，因此C-ACI更為經(jīng)濟(jì)。盡管初期的報(bào)告顯示二代ACI骨膜增生的并發(fā)癥較一代ACI更少[20]，但是依然存在細(xì)胞漏滲、分布不均和膠原膜脫落等不足。

2.3第三代自體軟骨細(xì)胞移植術(shù)

為改善前兩代ACI的缺陷，第三代ACI即基質(zhì)誘導(dǎo)的自體軟骨細(xì)胞移植術(shù)（matix-autologous chondrocyteimplantation，MACI）應(yīng)運(yùn)而生。經(jīng)典的MACI技術(shù)通過體外擴(kuò)增培養(yǎng)軟骨細(xì)胞，并將其種植于Ⅰ/Ⅲ型膠原膜粗糙面上然后進(jìn)行回植，最后使用可吸收線縫合固定以進(jìn)行修復(fù)。由于軟骨細(xì)胞粘附于三維膠原膜內(nèi)，該技術(shù)減少了細(xì)胞逸出和分布不均的風(fēng)險(xiǎn)和提高了術(shù)后軟骨細(xì)胞的存活率。研究表明，軟骨細(xì)胞在三維環(huán)境下生長有利于軟骨細(xì)胞表型和正常功能的維持，提高新生組織透明軟骨的生成率[21，22]。Ebert等[23]報(bào)道的20例采用關(guān)節(jié)鏡MACI治療的患者中，在術(shù)后2年隨訪的MRI檢查中，約90%的軟骨損傷被治愈，70%與周邊的軟骨合為一體。Basad等[24]對65名軟骨缺損在3～10 cm2患者M(jìn)ACI治療術(shù)后長達(dá)5年的隨訪研究表明，94%患者功能在術(shù)后2年得到極大提升，術(shù)后5年亦有不錯(cuò)的療效。由此可見，MACI技術(shù)的短期及中長期療效是值得肯定的。

MACI與其他治療方法的比較研究迄今也有不少報(bào)道。Basad等[25]對20例患者采用了微骨折治療，對40例軟骨損傷大于4 cm2的患者采用了MACI治療，術(shù)后兩年將兩組患者進(jìn)行對比發(fā)現(xiàn)，采用MACI治療的患者術(shù)后結(jié)果優(yōu)于微骨折組。而與OAT相比較，Clavé等研究證明，MACI對于面積大于3.5 cm2缺損的臨床療效并沒有OAT理想，而對小于3.5 cm2的缺損兩者沒有明顯差異[26]。Zeifang及Aldrian等[27，28]的臨床研究隨訪顯示，MACI相較ACI在短期和中長期的治療效果上均令人更為滿意。然而，最近有研究對180名MACI術(shù)后患者2年的MRI隨訪表明，約26.1%的患者術(shù)后2年仍存在回植物異常增生的現(xiàn)象，并且年齡小、BMI偏低者，異常增生發(fā)生率更高。因此，MACI的確切療效及適應(yīng)癥還需要更多的數(shù)據(jù)來證實(shí)[29]。

最新的MACI已發(fā)展到使用生物相容性更好的纖維蛋白膠進(jìn)行粘合，不再需要進(jìn)行縫合，使手術(shù)操作更加簡易，大大縮短了手術(shù)時(shí)間，同時(shí)也降低了細(xì)胞滲漏的風(fēng)險(xiǎn)[30]，這將成為今后手術(shù)發(fā)展的一個(gè)方向?，F(xiàn)將三代ACI技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)歸納總結(jié)于表1。

2.4支架材料在自體軟骨細(xì)胞移植術(shù)中的研究與應(yīng)用

支架材料一直是MACI研究中的熱點(diǎn)問題。采用支架材料的三維培養(yǎng)法使軟骨細(xì)胞處于更接近于人體內(nèi)的立體細(xì)胞外基質(zhì)微環(huán)境中，可減少軟骨細(xì)胞經(jīng)多次傳代后的去分化現(xiàn)象。理想的支架材料應(yīng)具有良好的生物相容性、可控的生物降解速率、良好的力學(xué)性能及可塑性，高度多孔的三維立體結(jié)構(gòu)有利于細(xì)胞黏附與生長，從而為種子細(xì)胞提供良好的生長環(huán)境，促進(jìn)細(xì)胞分化與代謝[31]。I/III型膠原膜因其良好的生物相容性和可降解性、與細(xì)胞親和力高、抗原性低及拉伸強(qiáng)度高等優(yōu)良性質(zhì)而在自體軟骨細(xì)胞移植術(shù)中得到廣泛的應(yīng)用[32]。但膠原膜也存在機(jī)械性能差、降解速率過快、強(qiáng)度不足、花費(fèi)較高等缺點(diǎn)。透明質(zhì)酸鈉也常用于軟骨組織工程，在臨床細(xì)胞移植治療軟骨缺損中也有較廣泛的應(yīng)用，它能給種子細(xì)胞生長提供類似胚胎軟骨發(fā)育的微環(huán)境，并能長期促進(jìn)細(xì)胞增殖分化[33，34]。近年來，水凝膠材料因其和軟骨相似的雙極性以及促進(jìn)軟骨細(xì)胞生長分化而成為研究的熱點(diǎn)。Popa等[35]將脂肪干細(xì)胞包裹在水凝膠內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果顯示干細(xì)胞向軟骨方向分化。Kim等[36]使用低聚糖復(fù)合水凝膠作為支架材料復(fù)合軟骨細(xì)胞修復(fù)兔軟骨損傷，結(jié)果顯示修復(fù)組織呈透明軟骨樣。目前軟骨細(xì)胞培養(yǎng)支架研究取得了巨大的進(jìn)步，為了將支架材料不確定的危險(xiǎn)因素降到最低，Shimomura等[37]提出不使用支架材料而使用間充質(zhì)干細(xì)胞（如自體滑膜）代替的方法將是下一代軟骨細(xì)胞移植技術(shù)發(fā)展的方向。但是，該技術(shù)應(yīng)用于臨床前還需進(jìn)行長期而深入的研究。

表1　三代ACI技術(shù)比較

3 基因修飾在ACI中的應(yīng)用

隨著分子生物學(xué)和基因技術(shù)的快速發(fā)展，基因?qū)氲确椒ㄔ诮M織工程中的研究應(yīng)用也日益廣泛。自體軟骨細(xì)胞移植中的基因修飾是將目的基因通過載體導(dǎo)入軟骨細(xì)胞，經(jīng)修飾的軟骨細(xì)胞可在軟骨再生過程中持續(xù)、高效地在局部分泌生長因子，從而促進(jìn)軟骨修復(fù)。Che等[38]將導(dǎo)入骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7（BMP-7）基因的軟骨細(xì)胞種植到膠原膜上，再將該膠原膜植入兔膝關(guān)節(jié)損傷處進(jìn)行修復(fù)，12周后實(shí)驗(yàn)組可形成透明軟骨，糖胺聚糖及DNA含量明顯高于對照組，提示轉(zhuǎn)染BMP-7的軟骨細(xì)胞能夠促進(jìn)軟骨損傷的修復(fù)。此外，轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）轉(zhuǎn)染的軟骨細(xì)胞治療關(guān)節(jié)炎患者已進(jìn)入了一期臨床試驗(yàn)，進(jìn)行安全性評估，初步結(jié)果顯示該方法無明顯的安全性問題[39]。雖然基因修飾在軟骨細(xì)胞移植中有著極好的應(yīng)用前景，但是在該方法應(yīng)用于臨床前還有許多問題亟待解決，比如如何選擇合適的基因、調(diào)節(jié)基因序列、基因轉(zhuǎn)染載體以及基因長期穩(wěn)定的表達(dá)調(diào)控等。

生長因子對軟骨細(xì)胞的增殖、分化及代謝具有重要作用，因此常成為研究者們轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞的首選。其中，轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）、人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-4（BMP-4）及血小板衍生生長因子（PDGF）的研究應(yīng)用最為廣泛。Jin等[40]成功利用TGF-β1誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞，但TGF-β1半衰期短，進(jìn)入體內(nèi)后易快速擴(kuò)散、變性或者發(fā)生酶解，故需反復(fù)大劑量應(yīng)用。Miljkovic等[41]研究證實(shí)，在軟骨細(xì)胞移植時(shí)，無論是體內(nèi)培養(yǎng)還是體外培養(yǎng)，BMP-4都能很好抑制軟骨細(xì)胞過度增生，并能維持穩(wěn)定的軟骨再生，但體外培養(yǎng)時(shí)BMP-4也存在相對半衰期較短的問題。因此，若能采用合理的方式傳遞BMP-4到達(dá)軟骨損傷處如轉(zhuǎn)染至軟骨細(xì)胞將是一種非常有前景的治療軟骨損傷之法。

4 展望

由于自體細(xì)胞移植技術(shù)能夠較好地修復(fù)損傷的關(guān)節(jié)軟骨，具有手術(shù)操作簡單、手術(shù)時(shí)間短、出血少、術(shù)后康復(fù)快、效果好等明顯優(yōu)勢，已成為目前較為理想和有效的軟骨損傷治療方法。但是如何解決軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)過程中的快速增殖并抑制其去分化、術(shù)后修復(fù)軟骨與周圍正常軟骨的融合及其力學(xué)性能等問題，還有待進(jìn)一步研究。對支架材料、生長因子及基因修飾方法的研究及應(yīng)用，有望通過自體細(xì)胞移植技術(shù)實(shí)現(xiàn)軟骨損傷的完全修復(fù)。

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2015.12.13

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（編號：81572198），廣東省自然科學(xué)基金（編號：2015A030313772），廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（編號：2013B021800100，2015A020212001），深圳市科技計(jì)劃項(xiàng)目（編號：JSGG20140519105550503，JCYJ20140414170821200，JCYJ20140414170821164，CXZZ20140813160132596）

朱偉民，Email：szhzwm@126.com