小葉樸組織培養(yǎng)無菌體系的建立

王斯彤

(遼寧省固沙造林研究所，遼寧阜新 123000)

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小葉樸組織培養(yǎng)無菌體系的建立

王斯彤

(遼寧省固沙造林研究所，遼寧阜新 123000)

[目的]建立小葉樸組織培養(yǎng)初代無菌體系。[方法]通過對不同消毒劑及消毒時間的對比，篩選出能夠有效控制小葉樸初代培養(yǎng)的污染率，且不抑制小葉樸莖段萌發(fā)的消毒處理。[結果]小葉樸莖段經(jīng)70%乙醇消毒30 s 2次，再用氯化汞消毒6 min所得莖段污染率低，萌發(fā)率高。對于后期出現(xiàn)的真菌污染采用多菌靈作為消毒劑和添加劑，用200 mg/L多菌靈浸泡外植體60 min能有效地控制污染，且具有較高的萌發(fā)率。在培養(yǎng)基中添加200 mg/L多菌靈也能抑制真菌污染，且效果優(yōu)于多菌靈浸泡處理。[結論]建立了小葉樸組織培養(yǎng)無菌體系，為小葉樸組培苗的增殖和生根提供參考。

小葉樸；消毒處理；組織培養(yǎng)

小葉樸(Celtisbungenana)為榆科樸屬落葉喬木，其樹形端正，遮陰好，是常用的庭院綠化及行道樹種，也可以利用其鄉(xiāng)土樹種的優(yōu)勢，進行荒山造林。由于小葉樸生長緩慢，主要繁殖方式是播種繁殖，繁殖時間長，極大地制約了小葉樸在林業(yè)上的推廣應用。將組織培養(yǎng)技術應用于小葉樸的繁殖上，不僅可以縮短繁育年限，同時對小葉樸的良種選育起到促進作用。污染是小葉樸組織培養(yǎng)過程中的技術難題。外植體材料、培養(yǎng)基、接種工具、接種室消毒不嚴格或無菌操作不規(guī)范及植物內(nèi)生菌的存在等因素均可導致污染的發(fā)生。乙醇、氯化汞等消毒試劑的使用能夠很好地消滅莖段表面的細菌，但對于植物莖段內(nèi)的內(nèi)生菌及真菌難以消除。筆者采用多菌靈作為消除內(nèi)生菌和真菌的藥劑，采用消毒劑和添加劑2種形式進行對比，建立初代無菌體系，為小葉樸組培苗的增殖和生根提供參考[1-5]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 供試材料采自沈陽農(nóng)業(yè)大學后山的小葉樸，枝條應在連續(xù)3個晴天后采集，采集當天天氣晴朗，時間在11：00～15：00，選取小葉樸當年萌發(fā)的幼嫩莖段作為外植體進行消毒對比試驗。消毒試劑：乙醇、氯化汞、次氯酸鈉、青霉素、多菌靈。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體的預處理。選取生長良好、無病蟲害的小葉樸新萌發(fā)枝條，將枝條剪成長約5 cm帶腋芽或頂芽的小段，去除葉片，加少量洗衣粉清洗表面的雜質(zhì)，用流水沖洗30～60 min后，再用蒸餾水沖洗4～5次(不斷振蕩燒杯)，置于超凈工作臺上備用。

1.2.2 外值體的消毒。①乙醇(70%、75%)、氯化汞(0.1%)配合使用進行消毒，消毒后無菌水沖洗3～4次，接種至培養(yǎng)基中。②使用次氯酸鈉(2%)消毒6、9、12、15 min，消毒后無菌水沖洗3～4次，接種至培養(yǎng)基中。③使用多菌靈(3%)溶液浸泡消毒20、40、60 min，消毒后無菌水沖洗3～4次，再用乙醇和氯化汞配合消毒，接種至培養(yǎng)基后進行觀察。與多菌靈作為添加劑進行對真菌抑制對比。

1.2.3 培養(yǎng)基中消毒劑的添加。在配制培養(yǎng)基過程中，加入瓊脂、植物生長調(diào)節(jié)劑和蔗糖后，在各組培養(yǎng)基中分別單獨加入不同濃度的青霉素和多菌靈，青霉素濃度為25、50、100、200 mg/L ，多菌靈(50%)為25、50、100、200 mg/L。

1.3 數(shù)據(jù)分析 采用隨機區(qū)組設計，通過腋芽萌發(fā)率、污染率等指標，研究消毒劑和消毒時間對污染率和萌發(fā)率的影響。計算公式：

萌發(fā)率=萌發(fā)的莖段數(shù)/外植體數(shù)×100%

污染率=污染的莖段數(shù)/外植體數(shù)×100%

2 結果與分析

2.1 不同乙醇與氯化汞配合處理對外植體的影響 由表1可知，乙醇與氯化汞配合使用能有效地控制污染率，促進莖段萌發(fā)。隨著乙醇和氯化汞消毒時間的增加，污染率逐漸降低，但消毒時間過長會抑制莖段的萌發(fā)，降低莖段的萌發(fā)率。綜合考慮，處理⑤污染率偏低，萌發(fā)率較高，為小葉樸較好的消毒處理。

方差分析結果表明，乙醇對小葉樸莖段的預處理具有顯著影響，乙醇具有較強的穿透性，利用此特性，可以清除小葉樸莖段表面細菌，同時加強了氯化汞的消毒效果。2.2 不同次氯酸鈉消毒時間對外植體的影響 用2%次氯酸鈉對小葉樸莖段進行不同時間的消毒處理，其污染率及萌發(fā)率見表2。由表2可知，隨著消毒時間的增加，污染率逐漸降低，當消毒時間達15 min時污染率降低不明顯，且會抑制莖段萌發(fā)。因此，最適消毒時間為12 min，此時污染率和萌發(fā)率都控制在較適宜的范圍。

表1 乙醇和氯化汞對小葉樸莖段的消毒效果

Table 1 Disinfection effect of Alcohol and mercuric chloride to Celtis bungenana

處理Treat-ment滅菌時間Thesterilizationtime乙醇Alcohol氯化汞mercuricchloridemin污染率Pollutionrate∥%萌發(fā)率Germinationrate∥%①70%30s1次355.133.7②70%30s1次638.744.5③70%30s1次936.645.9④70%30s2次349.737.9⑤70%30s2次634.549.1⑥70%30s2次933.347.8⑦75%30s1次355.834.7⑧75%30s1次637.942.3⑨75%30s1次932.539.8⑩75%30s2次347.332.575%30s2次633.142.775%30s2次932.738.6

注：樣本數(shù)為60。

Note：Samle number was 60.

表2 2%次氯酸鈉對小葉樸莖段的消毒效果

Table 2 Disinfection effect of 2% sodium hypochlorite toCeltisbungenana

處理Treatment滅菌時間Thesterilizationtime∥min污染率Pollutionrate∥%萌發(fā)率Germinationrate∥%①655.839.4②943.942.2③1239.745.3④1538.141.9

2.3 多菌靈對外植體真菌污染的抑制作用 由圖1可知，多菌靈作為消毒劑和添加劑均能降低污染率。隨著多菌靈濃度的升高，污染率降低，多菌靈濃度從50 mg/L升至100 mg/L時污染率降低最明顯，當多菌靈濃度為100～200 mg/L時，污染率降低趨于平緩。而多菌靈作為添加劑的消毒效果優(yōu)于消毒劑，其原因為多菌靈作為添加劑加入培養(yǎng)基中，能夠參與其新陳代謝，進入植物體內(nèi)起到殺菌消毒的作用。而作為消毒劑時，消毒劑的濃度和消毒時間都會影響消毒效果。由圖2可知，隨著消毒時間的增加，污染率降低，消毒時間在60～80 min時趨于平緩，污染率變化較小，且萌發(fā)率有所下降，說明當消毒時間達80 min時，污染率降低不明顯，但會抑制莖段的萌發(fā)。

圖1 多菌靈作為消毒液和添加劑對真菌污染的影響Fig.1 Effect of Carbendazim as disinfectant and additive on fungi pollution

圖2 不同消毒時間對污染率和萌發(fā)率的影響Fig.2 Effect of Different disinfection time on pollution rate and germination rate

2.4 添加劑的消毒效果 通過在培養(yǎng)基中添加青霉素和多菌靈，對比2種消毒劑的消毒效果，結果見圖3。由圖3可知，青霉素對細菌污染的發(fā)生有一定的抑制作用，特別是前10 d，效果明顯，但對真菌污染作用不明顯。多菌靈對細菌污染的抑制效果一般，但對后期真菌污染有較好的效果，這與李穎等[6]研究結果一致。

圖3 添加劑的消毒效果Fig.3 Additive effect of disinfection

3 結論與討論

小葉樸莖段具有污染率高、消毒困難的問題，需要進行多種消毒試劑以及消毒時間的篩選。消毒時間過長影響萌發(fā)率，過短則消毒不徹底，易污染。該試驗對小葉樸莖段進行消毒篩選，結果表明，經(jīng)70%乙醇消毒30 s 2次，再用氯化汞消毒6 min所得莖段污染率低，萌發(fā)率高。在用2%次氯酸鈉進行消毒試驗中，次氯酸鈉對小葉樸莖段的消毒效果較好，用2%次氯酸鈉浸泡12 min時，消毒效果好，萌發(fā)率高，但與乙醇和氯化汞配合使用相比略有不足。因此，生產(chǎn)實踐中，追求較低的污染率和較高的萌芽率時可采用乙醇與氯化汞。

針對出現(xiàn)的真菌污染，該研究采用的多菌靈效果突出，分別作為消毒劑和添加劑加入到培養(yǎng)基中，發(fā)現(xiàn)其抗污染能力強，對外植體的副作用小，且萌發(fā)率高。而作為消毒劑時，長時間的浸泡會刺激植物表皮，影響莖段萌發(fā)。

在青霉素和多菌靈作為添加劑的對比試驗中，青霉素能夠較好地控制細菌污染，多菌靈能夠控制真菌污染，且萌發(fā)率高，因此，可嘗試青霉素和多菌靈混合使用，以減少污染。多菌靈和青霉素對小葉樸莖段的生長發(fā)育是否有影響鮮見報道，因此需要后續(xù)試驗進行規(guī)范和調(diào)整，以建立小葉樸組織培養(yǎng)的完整體系。

[1] 王繼飛，胡天華，朱莉華.寧夏賀蘭山珍稀瀕危植物小葉樸資源現(xiàn)狀及保護對策[J].寧夏農(nóng)林科技，2012，53(6)：103-104.

[2] 彭廣霖，李青，衣淑玉，等.次氯酸鈉防治組培苗污染的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2012，40( 16)：8806-8808.

[3] 劉紹雄，王娟，王明月，等.巨龍竹組培苗污染優(yōu)勢內(nèi)生菌的分離與鑒定[J].南方農(nóng)業(yè)學報，2013，44(3)：416-421.

[4] 彭廣霖，于詠梅，薛元霞，等.氯化汞防治組培苗污染的研究[J].北方園藝，2012(15)：131-133.

[5] 方麗，汪一婷，呂永平，等.植物組培產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)中污染防控技術研究[J].浙江農(nóng)業(yè)學報，2012，24(6)：1074-1078.

[6] 李穎，李春燕.多菌靈和青霉素在組培污染中的應用[J].林業(yè)科技，2012，27(1)：6-8.

The Establishment of Tissue Culture Sterile System ofCeltisbungenana

WANG Si-tong

(Sand-fixation Afforestation Institute in Liaoning Province,Fuxin,Liaoning 123000)

[Objective] The aim was to establish tissue culture sterile system ofCeltisbungenana. [Method]Through the comparison of different disinfectants and disinfection time, tissue culture sterile system ofCeltisbungenanawith lowerpollution rate and higher germination rate were screened. [Result]By comparison with 70% alcohol disinfection 30 s 2 times, with mercuric chloride for 6 minutes from the stem segments were of low pollution, high germination rate.Late for the fungus pollution using carbendazim as disinfectant and additives, soaking with 200 mg/L carbendazim explant 60 min, can effectively control the pollution, and can have better germination rate. 200 mg/L is added in the culture medium carbendazim can restrain fungus contamination, and better than carbendazol soaking process. [Conclusion] The study stablihed tissue culture sterile system ofCeltisbungenana, and provide reference for proliferation and rooting ofCeltisbungenana.

Celtisbungenana; Disinfection treatment; Tissue culture

王斯彤(1990- )，女，遼寧阜新人，助理工程師，從事林木遺傳育種研究。

2016-08-24

S 723

A

0517-6611(2016)31-0153-03