白藜蘆醇對輻射誘導調(diào)節(jié)T細胞紊亂的調(diào)節(jié)作用

王 輝 張 恒 王 浩 閻 皓

白藜蘆醇對輻射誘導調(diào)節(jié)T細胞紊亂的調(diào)節(jié)作用

王 輝1張 恒1王 浩2閻 皓1

目的觀察電離輻射及白藜蘆醇對調(diào)節(jié)T細胞的影響，探討其對細胞因子TGF-β及IFN-γ的影響，闡明白藜蘆醇對輻射誘導免疫抑制的改善作用。方法將24只C57BL/6雄性小鼠隨機分為對照組、照射組和照射給藥組，每組8只。照射組和照射給藥組接受137Cs源γ射線全身照射（6.0 Gy），對照組小鼠接受偽照射。照射前7 d及照射后28 d，每日予白藜蘆醇（20 mg/kg）灌胃。末次給藥后1 d，檢測各組小鼠外周血CD4+CD25+細胞數(shù)量，CD4+CD25+細胞內(nèi)FoxP3表達水平，脾淋巴細胞TGF-β分泌水平，以及CD8+細胞及脾淋巴細胞TNF-γ表達水平。采用單因素方差分析對3組間的細胞比例及細胞因子表達水平進行比較，組間多重比較采用LSD-t檢驗。結(jié)果與正常小鼠比較，電離輻射可以增高CD4+CD25+細胞在外周血單核細胞和CD4+中的比例125.0%和57.2%，增高脾細胞TGF-β水平31.4%，降低脾細胞IFN-γ表達水平26.9%，組間差異均具有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；白藜蘆醇干預可以降低單純照射組小鼠調(diào)節(jié)T細胞在外周血單核細胞和CD4+中的比例32.3%和27.8%，降低CD4+CD25+細胞的FoxP3陽性比例26.6%，以及脾淋巴細胞TGF-β水平62.9%，增加CD8+T細胞及脾淋巴細胞生成的IFN-γ水平133.0%和87.4%，組間差異均具有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。結(jié)論白藜蘆醇可以抑制調(diào)節(jié)T細胞，改善受照小鼠的免疫功能。

白藜蘆醇；調(diào)節(jié)T細胞；TGF-β；IFN-γ；電離輻射

Int J Med Radiol，2016，39（6）：603-606

放療是惡性腫瘤重要的治療手段，尤其對于部分病人是唯一的治療手段[1]。相關(guān)研究表明放療期間病人可出現(xiàn)免疫功能下降，對病人預后造成不良影響[2]，因此對其機制及改善手段的研究具有重要的理論和臨床價值。惡性腫瘤具有多種免疫逃避機制，包括分泌多種免疫抑制因子、介導細胞表面FasL表達、誘導具有免疫抑制作用的調(diào)節(jié)T細胞增殖和分化[2-3]等。有研究[4]表明，腫瘤進展期間常伴隨調(diào)節(jié)T細胞增殖，并可能通過TGF-β通路介導。

白藜蘆醇富含于虎杖、葡萄等植物體內(nèi)，是一種非黃酮多酚類化合物，對人類免疫缺陷病毒（HIV-1）、單純皰疹病毒等多種病毒具有抑制作用，對于幽門螺旋桿菌等具有抗菌作用[5]。低劑量的白藜蘆醇可以增加小鼠Th1細胞相關(guān)細胞因子，如白細胞介素-12（IL-12）和干擾素-γ（IFN-γ），可以促進淋巴細胞增殖及IL-2水平，進而增強小鼠免疫力[6]。相關(guān)研究表明，白藜蘆醇對多種實體瘤，如胃癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、乳腺癌等具有抑制作用，并可能與免疫調(diào)節(jié)作用相關(guān)[6]。以上免疫調(diào)節(jié)作用及抗腫瘤作用，均與調(diào)節(jié)T細胞功能相關(guān)，本研究對受照小鼠用白藜蘆醇干預，研究電離輻射及白藜蘆醇對調(diào)節(jié)T細胞的影響，并探討其對免疫抑制細胞因子（轉(zhuǎn)化生長因子-β，TGF-β）及CD8+生成的IFN-γ的影響，闡明白藜蘆醇對輻射誘導免疫抑制的改善作用。

1 材料與方法

1.1 一般材料①實驗動物。C57BL/6雄性小鼠(SPF級)24只，8周齡，體質(zhì)量20～22 g，購自中國醫(yī)學科學院動物研究所，合格證號[SCXK(京)2005-0013]，實驗動物的使用經(jīng)天津市人民醫(yī)院實驗動物管理委員會批準。小鼠每籠4只飼養(yǎng)于SPF級動物房（飼養(yǎng)設施合格證號：SVXK津2009-0002）。②主要儀器和試劑。照射源為137Cs伽馬射線輻照儀（加拿大Atomic Energy公司）；LSRII流式細胞計數(shù)儀（美國BD Bioscience公司），F(xiàn)lowjo7.6.2版流式細胞分析軟件（美國FlowJo公司）；白藜蘆醇購自美國Sigma公司；BD Pharm LyseTM裂解液購自美國BD公司；FoxP3染色緩沖液（美國eBioscience公司，Cat. No.005523）；布雷菲德菌素A（美國Sigma公司）；CD16/32mAb（2.4G2，美國BD Pharmingen公司)；anti-CD4 PE-CY5抗體，anti-CD8 FITC（53-6.7），anti-CD25 PE抗體，F(xiàn)ITC anti-mouse FoxP3抗體（FJK-16），anti-IFN-γ PE抗體（XMG1.2）均購自美國eBioscience公司；酶聯(lián)免疫吸附試劑盒購自美國R&D公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及處理24只小鼠按體質(zhì)量隨機分為正常對照組、單純照射組和照射給藥組。每組8只，對照組給予假照射（即不照射），單純照射組和照射給藥組小鼠進行腹部137Cs伽馬射線照射，吸收劑量6.0 Gy，源靶距40 cm，吸收劑量率0.73 Gy/min。白藜蘆醇用0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液助溶配制成懸濁液，照射前7 d至照射后28 d每天灌胃給藥（20 mg/kg）。對照組和單純照射組小鼠按照射給藥組方法給予同等量載體灌胃。用藥劑量和給藥方式根據(jù)相關(guān)前期工作和預實驗制定[7]。

1.2.2 免疫細胞準備小鼠照射后第29天，從眼靜脈叢取血，EDTAK3抗凝，用BD Pharm LyseTM裂解液在4℃裂解5 min，制備的外周血單核細胞（PBMC）用含1%小牛血清的磷酸鹽溶液（PBSBSA，pH7.4）洗2次，在RPMI 1640液中再懸浮備用。小鼠脫頸處死后收獲脾，研磨后用400目的不銹鋼網(wǎng)制備單細胞懸液，淋巴細胞用Hank’s平衡鹽液（HBSS）清洗后，裂解紅細胞方法同上，在RPMI 1640液中再懸浮備用。

1.2.3 流式細胞計數(shù)儀分析PBMC懸液在CD16/ 32mAb中孵育阻斷FcRs非特異染色，加入適當濃度anti-CD4 PE-CY5抗體、anti-CD25 PE抗體，在4℃暗光孵育30 min。細胞洗3次后在流式細胞分析(FCM)緩沖液（磷酸鹽緩沖液加0.1%小牛血清加0.1%NaN3）中懸浮。細胞清洗3次后用LSRII流式細胞計數(shù)儀分析，每樣本至少分析5 000個細胞，隨后進行數(shù)據(jù)分析。

1.2.4 細胞內(nèi)FoxP3和IFN-γ染色為檢測PBMC內(nèi)FoxP3表達，細胞用anti-CD4 PE-CY5抗體、anti-CD25 PE抗體孵育，清洗后按說明書操作步驟用

FoxP3染色緩沖液固定和通透，用FITC anti-mouse FoxP3抗體（FJK-16）于4℃暗光孵育30 min。為檢測CD8+T細胞核內(nèi)IFN-γ表達，蛋白轉(zhuǎn)運抑制劑布雷菲德菌素A加入細胞培養(yǎng)液孵育5 h以累積細胞內(nèi)細胞因子。加入Fc阻斷劑在4℃孵育5 min，加入anti-CD8 FITC抗體暗光孵育30 min。染色后，細胞送LSRII流式細胞計數(shù)儀分析，每樣本至少分析5 000個細胞，隨后進行數(shù)據(jù)分析。

1.2.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）法檢測IFN-γ、TGF-β脾淋巴細胞用含200 μg/mL小牛血清的PRMI培養(yǎng)液調(diào)為1×107個細胞/mL孵育24 h，按說明書步驟用酶聯(lián)免疫試劑盒檢測上清液IFN-γ含量；按說明書步驟通過酸化將無活性的Lat-TGF-β活化，用酶聯(lián)免疫試劑盒檢測上清液活化TGF-β含量。

1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS16.0軟件包分析數(shù)據(jù)。計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠一般情況對照組小鼠皮毛光滑，身體健壯，飲食、活動正常，體質(zhì)量增長，實驗結(jié)束時無死亡。照射組小鼠皮毛干枯無光澤，精神弱，反應遲鈍，進食不積極，呼吸急促，體質(zhì)量無增長，無死亡。照射給藥組與照射組比較，小鼠皮毛光澤尚可，身體較壯，飲食、活動積極，體質(zhì)量有增長，無死亡。

2.2 白藜蘆醇對CD4+CD25+細胞數(shù)量的影響正常對照小鼠的CD4+CD25+細胞數(shù)量處于較低水平，電離輻射可以導致CD4+CD25+細胞在PBMC中的比例升高125.0%，在CD4+細胞中的比例升高57.2%；照射給藥組與單純照射組比較，CD4+CD25+細胞在PBMC中的比例降低32.3%，在CD4+T細胞中的比例降低27.8%，各組間差異均具有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見表1。

2.3 白藜蘆醇對CD4+CD25+細胞的FoxP3陽性比例的影響電離輻射對CD4+CD25+細胞的FoxP3陽性比例沒有顯著影響，照射給藥組較照射組小鼠CD4+CD25+細胞的FoxP3陽性比例降低26.6%，兩組間差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表1）。

2.4 白藜蘆醇對脾淋巴細胞TGF-β水平的影響照射組較正常對照組TGF-β水平增高31.4%；照射給藥組較照射組小鼠TGF-β水平降低62.9%，組間差異均具有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）（表1）。

2.5 白藜蘆醇對IFN-γ水平的影響照射組脾細胞IFN-γ表達水平為703.2pg/mL，較對照組降低26.9%（P＜0.05），照射給藥組CD8+T細胞中IFN-γ陽性比例為2.113%，較單純照射組提高133.0%；照射給藥組脾淋巴細胞分泌IFN-γ水平較照射組增高87.4%，達到1 317.8 pg/mL，組間差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表1）。

3 討論

在腫瘤發(fā)生發(fā)展中，調(diào)節(jié)T細胞誘導的免疫抑制起到重要作用，在腫瘤的放化療中，調(diào)節(jié)T細胞也對預后起到不良作用。相關(guān)研究表明電離輻射可以短期誘導調(diào)節(jié)T細胞比例增高，并可能抑制細胞免疫和體液免疫，但尚無有效的防護措施[8]。本研究表明，小鼠接受亞致死劑量（6 Gy）的γ射線全身照射，可以導致長期調(diào)節(jié)T細胞比例增高，而白藜蘆醇連續(xù)干預可以有效降低受照小鼠調(diào)節(jié)T細胞比例，提示白藜蘆醇可以改善受照小鼠由調(diào)節(jié)T細胞誘導的免疫抑制。

表1 各組間細胞比例及細胞因子表達水平比較（n=8,x±s）

以往研究中，調(diào)節(jié)T細胞定義為細胞膜表面表達CD4和CD25蛋白，調(diào)節(jié)T細胞多數(shù)表達叉頭狀家族轉(zhuǎn)錄蛋白FoxP3，對調(diào)節(jié)T細胞的發(fā)育和功能起到重要作用[9]。FoxP3作為調(diào)節(jié)T細胞重要的胞內(nèi)標志，并與細胞膜表面蛋白CD4和CD25共同用于調(diào)節(jié)T細胞的定義。Chen等[4]的研究表明，小鼠CD4+ CD25+細胞內(nèi)表達FoxP3的比例為72%～79%，對抑制細胞免疫起到重要作用。本研究中這一比例為

76.32%，與上述研究結(jié)果基本相符，如表1所示，電離輻射對CD4+CD25+細胞FoxP3陽性比例有增加趨勢，而長期低劑量白藜蘆醇干預可以有效降低CD4+CD25+表達FoxP3，改善受照小鼠免疫功能。

TGF-β是具有免疫抑制作用的細胞因子，對癌細胞的生長起重要作用，TGF-β可以誘導CD4+ CD25+增生[10-11]，可以協(xié)同刺激FoxP3表達，進而將外周血CD4+CD25-細胞分化為CD4+CD25+調(diào)節(jié)T細胞[12]，而調(diào)節(jié)T細胞可以通過TGF-β通路抑制CD8+T細胞介導的腫瘤細胞特異細胞毒作用[4]。本研究結(jié)果顯示，電離輻射可以誘導TGF-β分泌；白藜蘆醇干預可以有效降低受照小鼠TGF-β水平，提示白藜蘆醇可以有效改善輻射誘導的免疫功能抑制。本研究中TGF-β分泌水平下降伴隨FoxP3表達水平降低，與Islas-Vazquez等[11]的研究結(jié)論相符。白藜蘆醇對腫瘤免疫作用的調(diào)節(jié)機制尚未明確，是否通過抑制TGF-β抑制FoxP3表達進而抑制調(diào)節(jié)T細胞生成和功能，尚有待進一步研究。

IFN-γ具有抗病毒、免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤作用，可被調(diào)節(jié)T細胞及TGF-β信號通路抑制，抑制調(diào)節(jié)T細胞、刺激CD8+T細胞可以促進IFN-γ生成[13]。本研究表明，白藜蘆醇可以有效增加CD8+T細胞IFN-γ陽性比例及脾淋巴細胞生成IFN-γ水平，提示白藜蘆醇可以作為免疫刺激劑對機體免疫起到積極作用。本研究結(jié)果表明IFN-γ水平升高與調(diào)節(jié)T細胞數(shù)量及TGF-β水平呈負相關(guān)，這與Luz-Crawford等[13]的研究結(jié)果相符。但白藜蘆醇對IFN-γ調(diào)節(jié)的作用機制尚不明確，是否與抑制調(diào)節(jié)T細胞及降低TGF-β表達水平相關(guān)尚需進一步研究。

總之，電離輻射可以增加調(diào)節(jié)T細胞比例，增高脾淋巴細胞TGF-β水平；白藜蘆醇可以降低調(diào)節(jié)T細胞比例，降低脾淋巴細胞TGF-β水平，增加CD8+T細胞生成的IFN-γ水平，其調(diào)節(jié)機制需要進一步研究闡明。

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（收稿2016－08－17）

Regulatory effect of resveratrol on radiation induced regulatory T cell disorder

WANG Hui1,ZHANG Heng1,WANG Hao2,YAN Hao1.
1 Department of Oncology,Tianjin Union Medical Center,Tianjin 300121,China;2 Department of Pharmaceutical,Institute of Radiation Medicine,Chinese Academy of Medical Sciences

ObjectiveTo observe the effects of ionizing radiation and resveratrol on the regulatory T cells and to investigate the effects of resveratrol on TGF-β from spleen cells and IFN-γ from CD8+T cells and splenic lymphocytes.To elucidate the effect of resveratrol on radiation induced immunosuppression.MethodsTwenty-four C57BL/6 male mice were randomly divided into control group,irradiation group,and irradiation+resveratrol group.Irradiation group and irradiation+ resveratrol group received total body irradiation（γ-ray,6.0 Gy）,while the control group received pseudo-irradiation. Resveratrol（20 mg/kg）was orally administered to the mice 7 days before and 28 days after irradiation.One day after the last administration,the number of CD4+CD25+cells in peripheral blood of mice was detected.The expression of FoxP3 in CD4+ CD25+cells was detected.The level of TGF-β in splenic lymphocytes and the expression of TNF-γ in CD8+cells and splenic lymphocytes were detected.The cell ratio and the expression of cytokines were compared by single factor analysis of variance（ANOVA）.Multiple comparisons between groups were performed by LSD-t test.ResultsCompared with control mice,irradiation increased the percentage of CD4+CD25+cells in peripheral blood mononuclear cells and CD4+cells by 125.0%and 57.2%,increased the level of TGF-β in spleen cells by 31.4%,and decreased the level of IFN-γ expression in spleen cells by 26.9%.The differences between groups were statistically significant（all P＜0.05）.Treatment of resveratrol could decrease the ratio of regulatory T cells in peripheral blood mononuclear cells and CD4+cells of irradiated mice by 32.3%and 27.8%,decrease the level of TGF-β in splenic lymphocytes by 62.9%,respectively,increase the level of IFN-γ in the CD8+T cells and spleen lymphocytes by 133.0%and 87.4%,respectively.The differences between groups were

Resveratrol;Regulatory T cells;TGF-β;IFN-γ;Ionizing radiation

10.19300/j.2016.L4641

R815

A

1天津市人民醫(yī)院腫瘤科，天津300121；2中國醫(yī)學科學院放射醫(yī)學研究所輻射防護與藥物研究室

王輝，E-mail：ezxwanghui@sohu.com

國家自然科學基金面上項目（81573089），天津市衛(wèi)計委科技基金（2015KZ061）

statistically significant（all P＜0.05）.ConclusionResveratrol can inhibit the regulatory T cells and improve the immune function of irradiated mice.