杜建紅寇新民王艷麗涂顯勤
(1成都軍區(qū)聯(lián)勤部藥品儀器檢驗所,四川 成都610017;2成都軍區(qū)八一骨科醫(yī)院,610015)
HPLC測定止痛壯骨散中川續(xù)斷皂苷Ⅵ的含量
杜建紅1寇新民2王艷麗1涂顯勤2
(1成都軍區(qū)聯(lián)勤部藥品儀器檢驗所,四川 成都610017;2成都軍區(qū)八一骨科醫(yī)院,610015)
目的:建立高效液相色譜法測定止痛壯骨散中川續(xù)斷皂苷Ⅵ的含量。方法:采用十八烷基硅烷鍵合硅膠(250 mm×4.6 mm,5μm)為填充劑色譜柱,流動相:乙腈-水(30∶70),流速1.0 m L/m in,檢測波長212 nm,柱溫30℃,進樣量10μL。結(jié)果:川續(xù)斷皂苷Ⅵ濃度在10.22~ 204.44μg/m L(n=7)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.999 3);回收率在98.40%~ 101.16%之間,試驗結(jié)果RSD為1.07%(n=9)。結(jié)論:該方法操作簡便、準確、專屬性好,可用于止痛壯骨散質(zhì)量控制的方法。
止痛壯骨散;川續(xù)斷皂苷Ⅵ;高效液相色譜法
止痛壯骨散為成都軍區(qū)八一骨科醫(yī)院研制的院內(nèi)制劑,由杜仲、續(xù)斷、桑寄生等9味中藥材組成,方中杜仲甘溫,補肝腎,強筋骨,“主腰脊痛,益精氣,堅筋骨”,為治腎虛腰痛要藥;續(xù)斷增強杜仲補肝腎、強筋骨功效,對腰部勞損,能行血脈、續(xù)筋骨,故二者為本方君藥。腎虛,寒濕之邪易犯,桑寄生苦溫,配以“主治濕痹邪”之酸、可增強杜仲、續(xù)斷補腎壯陽,且善逐寒濕,為臣藥。本方具有活血化瘀,溫經(jīng)通絡(luò),壯腰固腎等功效,臨床用于腰肌勞損,風濕痹痛,陳舊性軟組織傷,久治不愈的各種筋骨痛。該藥2000年獲得制劑批準文號,分別于 2005年、2010年按要求換發(fā)批準文號,期間標準未作修訂。根據(jù)止痛壯骨散中的處方組成,綜合考慮,參照文獻[1-2]建立高效液相色譜法(HPLC)測定君藥續(xù)斷中川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量的方法,以更好地控制本品的質(zhì)量。
島津LC-20AB型液相色譜儀;電子分析天平(Sartorius CPA225D,感量0.1 mg);川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品(批號:111685-201304;含量:94.30%;來源于中國食品藥品檢定研究院);止痛壯骨散(每袋裝50 g,成都軍區(qū)八一骨科醫(yī)院,批號:20131129,20140224,20140416),乙腈為色譜純,水為重蒸水,其余試劑均為分析純。
2.1色譜條件
色譜柱:十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(250 mm×4.6 mm,5μm);流動相為:乙腈-水(30∶70);檢測波長:212 nm;柱溫:30℃;流速:1.0 m L/min;進樣量:10μL.
2.2供試品制備方法考察
2.2.1提取方式考察取供試品(批號:20131129)約1.5 g,4份,精密稱定,采用甲醇作為提取溶劑,分別采用超聲(功率240W,頻率40 kHz)、回流方法提取60分鐘,取出放冷后,再用流動相稀釋至刻度,搖勻作為供試品溶液,分別測定供試品溶液中川續(xù)斷皂苷Ⅵ的含量,試驗結(jié)果見表1。由表1中測定結(jié)果可知,超聲提取比回流提取所制備的供試品溶液中川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量略高,且超聲提取方法簡便易行。因此,選擇超聲(功率240W,頻率40 kHz)提取作為止痛壯骨散中續(xù)斷含量測定供試品溶液的提取方法。
表1 提取方式考察結(jié)果
2.2.2提取溶劑考察取供試品(批號:20131129)約1.5 g,精密稱定,分別用50%甲醇、甲醇、流動相作為提取溶劑(平行制備兩份),超聲60分鐘,取出,放冷,過濾,取續(xù)濾液用流動相稀釋至刻度,搖勻作為供試品溶液,分別測定供試品溶液中川續(xù)斷皂苷Ⅵ的含量,試驗結(jié)果見表2。結(jié)果顯示,50%甲醇和甲醇的超聲提取效果無明顯差異,用流動相提取的含量略低于前兩種溶劑的提取量且易堵塞濾頭。擬采用甲醇作為本品含量測定的供試品提取溶劑。
表2 提取溶劑考察結(jié)果
2.2.3提取溶劑用量考察取供試品(批號:20131129)約 1.5 g,6份,精密稱定,采用不同量的甲醇作為提取溶劑(平行制備兩份),超聲(功率240 W,頻率40 kHz)提取60分鐘,制備供試品溶液,分別測定供試品中川續(xù)斷皂苷Ⅵ的含量,試驗結(jié)果見表3。結(jié)果顯示,對于稱樣量相同的供試品,采用25 m L和50 m L的甲醇提取,結(jié)果差異較小,暫定采用25 m L的溶劑進行超聲提取。
表3 提取溶劑用量考察結(jié)果
2.2.4提取時間考察取供試品(批號:20131129)約1.5 g,精密稱定,甲醇作為提取溶劑(平行制備兩份),分別超聲處理(功率240 W,頻率40 kHz)10,20,30,45分鐘,取出,放冷,加甲醇至刻度,搖勻,過濾,取續(xù)濾液,即得,分別測定供試品溶液中川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量。試驗結(jié)果見表4。
表4 提取時間考察結(jié)果
結(jié)果顯示,超聲提取10,20,30,45分鐘,供試品溶液中的川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量無明顯的差異,表明在此提取時間段內(nèi)樣品中的川續(xù)斷皂苷Ⅵ基本提取完全,綜合考慮,采用20 m in作為供試品溶液的提取時間。
2.3溶液的制備
①供試品溶液的制備取本品約1.5 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入甲醇25 m L,密塞,稱定質(zhì)量,超聲處理(功率240 W,頻率40 kHz)60分鐘,放冷,再稱定質(zhì)量,用甲醇補足減失的質(zhì)量,搖勻,濾過,精密量取續(xù)濾液2 m L,置10 m L量瓶中,加流動相稀釋至刻度,搖勻,即得。②對照品溶液的制備取川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品適量,精密稱定,加甲醇溶解并稀釋,制成每1m L含0.18mg的溶液,搖勻,即得。③陰性對照溶液按處方比例及工藝制備缺續(xù)斷的陰性對照樣品,按供試品溶液項下方法制成陰性對照溶液。
2.4專屬性考察
分別吸取供試品,按“2.1”項下的色譜條件,進樣測定,記錄色譜圖。結(jié)果顯示陰性對照溶液色譜峰對測定無干擾,專屬性良好,見圖1。
圖1 止痛壯骨散的HPLC圖譜
2.5線性關(guān)系考察
精密稱取川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品適量,精密稱定,制備對照品儲備液,再用流動相稀釋成一系列的線性對照品溶液。按照擬定的測定條件進行測定,記錄峰面積。以川續(xù)斷皂苷Ⅵ濃度X(μg/m L)為橫坐標,數(shù)據(jù)分別為10.22,20.44,51.11,102.22,122.67,153.33,204.44,川續(xù)斷皂苷Ⅵ峰面積Y為縱坐標,數(shù)據(jù)分別為19 415,39 488,100 277,227 266,259 789,326 449,452 892,進行回歸,回歸方程為:
Y=2 221.4X-7 155.9,
試驗結(jié)果顯示,川續(xù)斷皂苷Ⅵ濃度在10.22~204.44μg/m L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.999 3)。
2.6精密度試驗
取同一對照品溶液(每1 m L含0.18 mg的溶液),按照擬定的測定條件重復測定6次,記錄川續(xù)斷皂苷Ⅵ峰面積,考察進樣精密度,試驗結(jié)果RSD為0.08%,表明進樣精密度良好。
2.7溶液穩(wěn)定性試驗
取新配制的川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品溶液及供試品溶液,分別在0,2,4,8,12小時進樣,每次進樣10μL,記錄川續(xù)斷皂苷Ⅵ峰面積,試驗結(jié)果顯示,對照品溶液及供試品溶液均在12小時內(nèi)穩(wěn)定性良好(RSD小于2%)。
2.8重復性試驗
取本品(批號:20131129),稱取6份,按擬定方法制備供試品溶液,測定川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量,試驗結(jié)果RSD為1.94%,表明該方法重現(xiàn)性較好。
2.9回收率試驗
采用加樣回收法,取已知含量的供試品 (批號:20131129,含量:0.8%)9份,每份約0.75 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,分別加入川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品3,5,9 mg(每個水平3份),照擬定的方法制備供試品溶液并測定川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量,計算川續(xù)斷皂苷Ⅵ的回收率,結(jié)果見表5。
表5 回收率試驗結(jié)果
試驗結(jié)果RSD為1.07%,回收率在98.40%~101.16%之間,表明擬定的含量測定方法回收率良好。
2.10樣品測定
采用經(jīng)過驗證,專屬性、重復性良好,準確度良好的含量測定方法,對于多批樣品中的川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量進行測定,試驗結(jié)果見表6。
表6 多批樣品測定結(jié)果
為加強醫(yī)療機構(gòu)制劑規(guī)范化、標準化、科學化管理,提高醫(yī)療機構(gòu)制劑質(zhì)量,保障公眾用藥安全,按《中國藥典》(2010年版)及有關(guān)補充要求,遵循“科學、規(guī)范、實用”的原則,對制劑標準進行升級研究。因本制劑原制劑標準質(zhì)控項目與指標與藥典差距較大,本文在質(zhì)量標準含量測定項目擬定過程中,對君藥杜仲、續(xù)斷和臣藥桑寄生等均進行了前期預試驗,對3種藥材的化學成分或活性成分進行測試,杜仲活性成分綠原酸和桑寄生活性成分槲皮素的HPLC試驗中色譜峰分離度效果不佳,而續(xù)斷化學成分川續(xù)斷皂苷Ⅵ的HPLC試驗系統(tǒng)性參數(shù)較好,結(jié)合武密山等[3]報道續(xù)斷皂苷Ⅵ具有促進大鼠體外骨髓間充質(zhì)干細胞向成熟骨細胞增殖和分化的作用,在基因水平上為篩選促進骨形成的有效藥物提供了作用靶點,故選擇作為含量測定指標。
本文的波長選擇方面,參照《中國藥典》(2010年版)一部續(xù)斷含量測定項目,擬定以川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量作為衡量指標,在進行紫外光譜掃描后,川續(xù)斷皂苷Ⅵ在212 nm波長處有最大吸收,故選擇測定的波長為212 nm。
本文的含量限度確定方面,根據(jù)《中國藥典》(2010年版)對于續(xù)斷藥材的質(zhì)量控制的規(guī)定,以及本品是由續(xù)斷等原藥材粉直接入藥,考慮轉(zhuǎn)移率為90%,因此本品中川續(xù)斷皂苷Ⅵ的最低含量為2.4 mg/g,結(jié)合實際測定結(jié)果(由于各批次樣品的藥材批次不同,因此多批樣品的含量結(jié)果有一定差異),暫擬定本品中川續(xù)斷皂苷Ⅵ的含量限度為:不得少于2.4 mg/g。
[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(2010年版)一部[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:附錄XVIIIA.
[2]吳春園,王俊,高錦飚.高效液相色譜法測定仙靈骨葆膠囊中川續(xù)斷皂苷Ⅵ的含量[J].中國現(xiàn)代藥物應用,2014,8(17):238-239.
[3]武密山,趙素芝,任立中,等.川續(xù)斷皂苷Ⅵ誘導大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨細胞方向分化的研究[J].中國藥理學通報,2012,28(2):222-226.
Determ ination of AsperosaponinⅥ Content in Zhitong Zhuanggu San by HPLC
Du Jianhong,Kou Xinmin,Wang Yanli,Tu Xianqin(1 Institute for Drug and Instrument Control of Chengdu M ilitary Region,Sichuan Chengdu 610017,China;2 Bayi Orthopedics Hospital of Chengdu M ilitary Region,610015)
Objective:To develop a HPLC method for determination of asperosaponinⅥ content in zhitong zhuanggu san.M ethods:HPLC analysis was carried out on a C18column(250 mm×4.6 mm,5μm),using acetonitrile-water(30∶70)as mobile phase at a flow rate of 1.0 m L/min.The detection wavelength was 212 nm,while the column temperature was 30℃,and the injection volume was 10μL.Results:The linear range of asperosaponinⅥwas 10.22~204.44μg/mL(n=7,r=0.999 3).The average recovery was 98.40%~101.16%(n=9),w ith a RSD of 1.07%.Conclusion:The method is simple,accurate and specific,which may be used for the quality control of zhitong zhuanggu san.
Zhitong Zhuanggu San;AsperosaponinⅥ;HPLC
10.3969/j.issn.1672-5433.2016.11.005
軍隊醫(yī)療機構(gòu)制劑標準提高科研專項課題(14ZJZ15-2)
杜建紅,男,副主任藥師。研究方向:藥物分析。通訊作者E-mail:yjsdjh@163.com
(2016-07-05)