吳軍紅吳文中
(1駐馬店市食品藥品檢驗所,河南 駐馬店 463000;2深圳大學(xué)第一附屬醫(yī)院,廣東 深圳518035)
HPLC同時測定人參五味子顆粒中3種人參皂苷含量
吳軍紅1吳文中2
(1駐馬店市食品藥品檢驗所,河南 駐馬店 463000;2深圳大學(xué)第一附屬醫(yī)院,廣東 深圳518035)
目的:建立高效液相色譜法同時測定人參五味子顆粒中人參皂苷Rg1,Re,Rb1含量的方法。方法:色譜柱為Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm,5μm);以乙腈-水為流動相,梯度洗脫;檢測波長為203 nm;流速1.0 m L/min;柱溫30℃。結(jié)果:人參皂苷Rg1進樣量在0.160~3.200μg(r=0.999 7)、人參皂苷Re進樣量在0.216~ 4.320μg(r=0.999 9)、人參皂苷Rb1進樣量在0.274~5.480μg(r=0.999 3)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,平均回收率分別為98.63%(RSD=1.13%),98.26%(RSD=1.17%),98.74%(RSD=1.07%)。結(jié)論:本方法簡單、準確,專屬性強,重復(fù)性好,能同時測定人參五味子顆粒中3種人參皂苷含量。
人參五味子顆粒;人參皂苷Rg1;人參皂苷Re;人參皂苷Rb1;高效液相色譜法
人參五味子顆粒收載于《衛(wèi)生部藥品標準》中藥成方制劑第四冊[1],系由生曬參、五味子兩味傳統(tǒng)中藥組成的復(fù)方制劑,具有益氣斂陰,安神鎮(zhèn)靜功效。用于病后體虛,神經(jīng)衰弱。其中人參為貴細藥材,具有大補元氣,生津養(yǎng)血,安神益智等功效,原質(zhì)量標準只有人參的薄層鑒別,近年來郭強[2]曾對五味子進行了標準提高,生曬參定量分析未見文獻報道。為更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量,提高臨床療效,本文將人參皂苷Rg1,Re,Rb1作為測定指標,建立高效液相色譜法(HPLC)同時測定人參五味子顆粒中人參皂苷Rg1,Re,Rb1含量的方法,現(xiàn)報道如下。
安捷倫1260型高效液相色譜儀 (G4212B二極管陣列檢測器,G1329B標準自動進樣器,G1316A標準柱溫箱);電子天平(BP211D,十萬分之一);人參皂苷 Rg1(供含量測定用,批號:110703-201027,含量以96.3%計)、人參皂苷Re(供含量測定用,批號:110754-200421)、人參皂苷Rb1(供含量測定用,批號:110704-200921,含量以92.6%計)、均購自中國食品藥品檢定研究院;人參五味子顆粒由廣西邦琪藥業(yè)集團有限公司提供(批號:141104,150402,150807);陰性樣品按處方工藝,由駐馬店市中醫(yī)院制劑室制備;甲醇、乙腈為色譜純,水為重蒸水,其他試劑均為分析純。
2.1色譜條件
Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱 (4.6 mm × 250 mm,5μm);流動相:乙腈(A)-水(B),梯度洗脫(表 1);檢測波長:203 nm;流速:1.0 m L/m in;柱溫:30℃。
表1 流動相梯度洗脫程序
2.2溶液的制備
2.2.1對照品溶液制備精密稱取人參皂苷Rg1對照品16.61 mg、人參皂苷Re對照品21.60 mg、人參皂苷Rb1對照品29.59 mg,置100 m L量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得(每1 m L中含人參皂苷Rg10.160 mg、人參皂苷Re 0.216 mg、人參皂苷Rb10.274 mg)。
2.2.2供試品溶液制備[3]取本品1袋,研細,精密稱取1 g,置具塞錐形瓶中,精密加入70%乙醇50m L,稱定質(zhì)量,超聲處理(功率240 W,頻率45 kHz)30分鐘,放冷至室溫,稱定質(zhì)量,用70%乙醇補足減失質(zhì)量,搖勻,濾過,精密量取續(xù)濾液25 m L,蒸干,殘渣用水15 m L溶解,再用水飽和正丁醇萃取3次(25,25,20 m L),合并正丁醇液,用氨試液洗2次,每次20 m L,棄去氨試液,正丁醇液濃縮至干,殘渣加甲醇溶解并定容至5 m L量瓶,即得。
2.2.3陰性樣品溶液制備精密量取陰性樣品1 g,按“2.2.2”項下方法制備陰性樣品溶液。
2.3系統(tǒng)適用性試驗
按照“2.1”色譜條件,吸取對照品溶液、批號為150807的供試品溶液、陰性樣品溶液,自動進樣10μL,記錄色譜圖,理論板數(shù)按人參皂苷Rg1峰計大于6 000,分離度大于1.5,陰性無干擾。見圖1。
圖1 混合對照品、樣品、陰性樣品HPLC圖
2.4線性關(guān)系考察
精密吸取對照品混合溶液1.0,2.0,5.0,10.0,20.0μL,自動進樣,以峰面積積分值對進樣量(μg)進行回歸處理,得人參皂苷 Rg1、人參皂苷 Re、人參皂苷Rb1的標準曲線分別為:
Y=14.12+364.243 3X(r=0.999 7);
Y=2.482+385.122 9X(r=0.999 9);
Y=5.699+296.947 2X(r=0.999 3)。
結(jié)果表明,人參皂苷 Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷 Rb1進樣量分別在 0.160~3.200,0.216~4.320,0.274~5.480μg線性關(guān)系良好。
2.5精密度試驗
精密吸取上述對照品混合液10μL,連續(xù)進樣6次,記錄峰面積。結(jié)果人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1的峰面積RSD分別為0.89%,0.76%,0.94%,表明本方法精密度良好。
2.6穩(wěn)定性試驗
精密吸取批號為150807的供試品溶液,分別于0,1,3,6,9,12,24 h進樣10μL,依法測定。人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1峰面積RSD分別為0.91%,1.15%,1.09%,結(jié)果表明樣品在24 h內(nèi)性質(zhì)穩(wěn)定。
2.7重復(fù)性試驗
取同一批號樣品(150807)6份,按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液,分別進行測定。人參皂苷Rg1、人參皂苷 Re、人參皂苷 Rb1的 RSD分別為1.26%,0.98%,1.38%,結(jié)果表明重現(xiàn)性良好。
2.8加樣回收試驗
取已知含量的批號為150807的樣品1 g,共6份,分別置25 m L量瓶中,再精密加入對照品混合液 5 m L,按“2.2.2”項下方法制備,進樣測定,人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1的加樣回收率見表2。
2.9樣品測定
取人參五味子顆粒樣品3批各3份,以“2.2.2”項下方法制備供試品溶液,進樣測定,按外標法計算含量,結(jié)果見表3。
表2 加樣回收率測定結(jié)果
表3 樣品測定結(jié)果
3.1色譜條件的選擇
按照《中國藥典》及相關(guān)文獻[4-6]方法確定柱型、流速和檢測波長及梯度洗脫系統(tǒng),通過實驗發(fā)現(xiàn)人參皂苷Re后面、人參皂苷Rb1前面有部分雜質(zhì)峰,影響其分離效果,參考了相關(guān)文獻報道[7]的梯度洗脫系統(tǒng)按照其流動相比例變化,可以實現(xiàn)人參皂苷Re峰、人參皂苷Rb1峰與雜質(zhì)峰有效分離,且該梯度洗脫系統(tǒng)能夠使各峰型穩(wěn)定,峰型均較好,因此采用本梯度洗脫系統(tǒng)。
3.2樣品處理方法
本試驗供試品溶液制備方法較多[8],根據(jù)該制劑處方工藝,2味藥材均為浸膏提取物,排除藥典的索氏提取法,根據(jù)文獻報道[9-10],本試驗選取了醇提正丁醇萃取氨試液洗滌和甲醇超聲提取方法。通過試驗,超聲提取的樣品在30分鐘能夠有效提取完全,醇提正丁醇萃取氨試液洗滌法提出的樣品用水飽和正丁醇萃取3次(25,25,20 m L)能夠萃取完全,氨試液洗滌,使樣品處于堿性環(huán)境中,更有利于人參皂苷成分的溶出[3],也許是含量略高于超聲提取的原因,具體機制需進一步研究,該樣品處理最終確定為醇提正丁醇萃取氨試液洗滌。
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Simultaneous Determ ination of Contents of Three Ginsenosides in Ginseng Schisandrae Particles by HPLC
Wu Junhong1,Wu Wenzhong2(1 Zhumadian Institute for Food and Drug Control,Henan Zhumadian 463000,China;2 The First Affiliated Hospital of Shenzhen University,Guangdong Shenzhen 518035)
Objective:To develop a HPLC method for simultane determination of the contents of ginsenoside Rg1,ginsenoside Re and ginsenoside Rb1in ginseng fruit.M ethods:HPLC was performed on agilent eclipse XDB-C18column(4.6 mm×250 mm,5μm)w ith a mobile phase of acetonitrile-water aqueous solution by gradient elution.The detection wavelength was 203 nm,while the flow rate was 1.0 mL/min,and the column temperature was 30℃.Results:Good linear relationships were obtained w ithin the range of 0.160~3.200μg(r=0.999 7),0.216~ 4.320μg(r=0.999 9)and 0.274~ 5.480μg(r=0.999 3)for Ginsenoside Rg1,Ginsenoside Re and ginsenoside Rb1,while the average recovery rates were 98.63% (RSD=1.13%),98.26% (RSD=1.17%)and 98.74%(RSD=1.07%),respectively.Conclusion:This method is simple,accurate,specific,reproducible and may be used for simultaneous determination of contents of three Ginsenosides in ginseng fruit.
Ginseng Schisandrae Particles;Ginsenoside Rg1;Ginsenoside Re;Ginsenoside Rb1;HPLC
10.3969/j.issn.1672-5433.2016.11.004
中華醫(yī)學(xué)會美能皮膚病學(xué)研究基金(2012031206)
吳軍紅,男,主管藥師。研究方向:中藥檢驗及質(zhì)量標準研究。E-mail:48042557@qq.com
吳文中,男,博士,主任醫(yī)師、教授。主要從事Th細胞在銀屑病發(fā)病機制中的作用及復(fù)方甘草酸苷對HaCaT細胞增殖和相關(guān)因子表達影響的臨床和實驗研究工作。通訊作者E-mail:wzwucn@163.com
(2016-06-03)