HPLC同時(shí)測(cè)定人參五味子顆粒中3種人參皂苷含量

吳軍紅吳文中

（1駐馬店市食品藥品檢驗(yàn)所，河南 駐馬店 463000；2深圳大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 深圳518035）

HPLC同時(shí)測(cè)定人參五味子顆粒中3種人參皂苷含量

吳軍紅1吳文中2

（1駐馬店市食品藥品檢驗(yàn)所，河南 駐馬店 463000；2深圳大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 深圳518035）

目的：建立高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定人參五味子顆粒中人參皂苷Rg1，Re，Rb1含量的方法。方法：色譜柱為Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5μm）；以乙腈-水為流動(dòng)相，梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm；流速1.0 m L/min；柱溫30℃。結(jié)果：人參皂苷Rg1進(jìn)樣量在0.160～3.200μg（r=0.999 7）、人參皂苷Re進(jìn)樣量在0.216～ 4.320μg（r=0.999 9）、人參皂苷Rb1進(jìn)樣量在0.274～5.480μg（r=0.999 3）范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率分別為98.63%（RSD=1.13%），98.26%（RSD=1.17%），98.74%（RSD=1.07%）。結(jié)論：本方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確，專(zhuān)屬性強(qiáng)，重復(fù)性好，能同時(shí)測(cè)定人參五味子顆粒中3種人參皂苷含量。

人參五味子顆粒；人參皂苷Rg1；人參皂苷Re；人參皂苷Rb1；高效液相色譜法

人參五味子顆粒收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第四冊(cè)[1]，系由生曬參、五味子兩味傳統(tǒng)中藥組成的復(fù)方制劑，具有益氣斂陰，安神鎮(zhèn)靜功效。用于病后體虛，神經(jīng)衰弱。其中人參為貴細(xì)藥材，具有大補(bǔ)元?dú)?，生津養(yǎng)血，安神益智等功效，原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)只有人參的薄層鑒別，近年來(lái)郭強(qiáng)[2]曾對(duì)五味子進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)提高，生曬參定量分析未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。為更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量，提高臨床療效，本文將人參皂苷Rg1，Re，Rb1作為測(cè)定指標(biāo)，建立高效液相色譜法（HPLC）同時(shí)測(cè)定人參五味子顆粒中人參皂苷Rg1，Re，Rb1含量的方法，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　儀器與試藥

安捷倫1260型高效液相色譜儀 （G4212B二極管陣列檢測(cè)器，G1329B標(biāo)準(zhǔn)自動(dòng)進(jìn)樣器，G1316A標(biāo)準(zhǔn)柱溫箱）；電子天平（BP211D，十萬(wàn)分之一）；人參皂苷 Rg1（供含量測(cè)定用，批號(hào)：110703-201027，含量以96.3%計(jì)）、人參皂苷Re（供含量測(cè)定用，批號(hào)：110754-200421）、人參皂苷Rb1（供含量測(cè)定用，批號(hào)：110704-200921，含量以92.6%計(jì)）、均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；人參五味子顆粒由廣西邦琪藥業(yè)集團(tuán)有限公司提供（批號(hào)：141104，150402，150807）；陰性樣品按處方工藝，由駐馬店市中醫(yī)院制劑室制備；甲醇、乙腈為色譜純，水為重蒸水，其他試劑均為分析純。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件

Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱 （4.6 mm × 250 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（表 1）；檢測(cè)波長(zhǎng)：203 nm；流速：1.0 m L/m in；柱溫：30℃。

表1　流動(dòng)相梯度洗脫程序

2.2溶液的制備

2.2.1對(duì)照品溶液制備精密稱(chēng)取人參皂苷Rg1對(duì)照品16.61 mg、人參皂苷Re對(duì)照品21.60 mg、人參皂苷Rb1對(duì)照品29.59 mg，置100 m L量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得（每1 m L中含人參皂苷Rg10.160 mg、人參皂苷Re 0.216 mg、人參皂苷Rb10.274 mg）。

2.2.2供試品溶液制備[3]取本品1袋，研細(xì)，精密稱(chēng)取1 g，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇50m L，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲處理（功率240 W，頻率45 kHz）30分鐘，放冷至室溫，稱(chēng)定質(zhì)量，用70%乙醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液25 m L，蒸干，殘?jiān)盟?5 m L溶解，再用水飽和正丁醇萃取3次（25，25，20 m L），合并正丁醇液，用氨試液洗2次，每次20 m L，棄去氨試液，正丁醇液濃縮至干，殘?jiān)蛹状既芙獠⒍ㄈ葜? m L量瓶，即得。

2.2.3陰性樣品溶液制備精密量取陰性樣品1 g，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備陰性樣品溶液。

2.3系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

按照“2.1”色譜條件，吸取對(duì)照品溶液、批號(hào)為150807的供試品溶液、陰性樣品溶液，自動(dòng)進(jìn)樣10μL，記錄色譜圖，理論板數(shù)按人參皂苷Rg1峰計(jì)大于6 000，分離度大于1.5，陰性無(wú)干擾。見(jiàn)圖1。

圖1　混合對(duì)照品、樣品、陰性樣品HPLC圖

2.4線性關(guān)系考察

精密吸取對(duì)照品混合溶液1.0，2.0，5.0，10.0，20.0μL，自動(dòng)進(jìn)樣，以峰面積積分值對(duì)進(jìn)樣量（μg）進(jìn)行回歸處理，得人參皂苷 Rg1、人參皂苷 Re、人參皂苷Rb1的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為：

Y=14.12+364.243 3X（r=0.999 7）；

Y=2.482+385.122 9X（r=0.999 9）；

Y=5.699+296.947 2X（r=0.999 3）。

結(jié)果表明，人參皂苷 Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷 Rb1進(jìn)樣量分別在 0.160～3.200，0.216～4.320，0.274～5.480μg線性關(guān)系良好。

2.5精密度試驗(yàn)

精密吸取上述對(duì)照品混合液10μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1的峰面積RSD分別為0.89%，0.76%，0.94%，表明本方法精密度良好。

2.6穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取批號(hào)為150807的供試品溶液，分別于0，1，3，6，9，12，24 h進(jìn)樣10μL，依法測(cè)定。人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1峰面積RSD分別為0.91%，1.15%，1.09%，結(jié)果表明樣品在24 h內(nèi)性質(zhì)穩(wěn)定。

2.7重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)樣品（150807）6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)行測(cè)定。人參皂苷Rg1、人參皂苷 Re、人參皂苷 Rb1的 RSD分別為1.26%，0.98%，1.38%，結(jié)果表明重現(xiàn)性良好。

2.8加樣回收試驗(yàn)

取已知含量的批號(hào)為150807的樣品1 g，共6份，分別置25 m L量瓶中，再精密加入對(duì)照品混合液 5 m L，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，進(jìn)樣測(cè)定，人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1的加樣回收率見(jiàn)表2。

2.9樣品測(cè)定

取人參五味子顆粒樣品3批各3份，以“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，按外標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表2　加樣回收率測(cè)定結(jié)果

表3　樣品測(cè)定結(jié)果

3　討論

3.1色譜條件的選擇

按照《中國(guó)藥典》及相關(guān)文獻(xiàn)[4-6]方法確定柱型、流速和檢測(cè)波長(zhǎng)及梯度洗脫系統(tǒng)，通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)人參皂苷Re后面、人參皂苷Rb1前面有部分雜質(zhì)峰，影響其分離效果，參考了相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[7]的梯度洗脫系統(tǒng)按照其流動(dòng)相比例變化，可以實(shí)現(xiàn)人參皂苷Re峰、人參皂苷Rb1峰與雜質(zhì)峰有效分離，且該梯度洗脫系統(tǒng)能夠使各峰型穩(wěn)定，峰型均較好，因此采用本梯度洗脫系統(tǒng)。

3.2樣品處理方法

本試驗(yàn)供試品溶液制備方法較多[8]，根據(jù)該制劑處方工藝，2味藥材均為浸膏提取物，排除藥典的索氏提取法，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[9-10]，本試驗(yàn)選取了醇提正丁醇萃取氨試液洗滌和甲醇超聲提取方法。通過(guò)試驗(yàn)，超聲提取的樣品在30分鐘能夠有效提取完全，醇提正丁醇萃取氨試液洗滌法提出的樣品用水飽和正丁醇萃取3次（25，25，20 m L）能夠萃取完全，氨試液洗滌，使樣品處于堿性環(huán)境中，更有利于人參皂苷成分的溶出[3]，也許是含量略高于超聲提取的原因，具體機(jī)制需進(jìn)一步研究，該樣品處理最終確定為醇提正丁醇萃取氨試液洗滌。

[1]衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)（中藥成方制劑第四冊(cè)）[S].北京：人民衛(wèi)生出版社.1989.

[2]郭強(qiáng).人參五味子沖劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].中醫(yī)臨床研究，2015，7（4）：16-18.

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[7]吳和珍，李婷婷，李菁，等.高效液相色譜法測(cè)定益智寧顆粒中人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1含量[J].湖北中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，14（2）：25-27.

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Simultaneous Determ ination of Contents of Three Ginsenosides in Ginseng Schisandrae Particles by HPLC

Wu Junhong1，Wu Wenzhong2（1 Zhumadian Institute for Food and Drug Control，Henan Zhumadian 463000，China；2 The First Affiliated Hospital of Shenzhen University，Guangdong Shenzhen 518035）

Objective：To develop a HPLC method for simultane determination of the contents of ginsenoside Rg1，ginsenoside Re and ginsenoside Rb1in ginseng fruit.M ethods：HPLC was performed on agilent eclipse XDB-C18column（4.6 mm×250 mm，5μm）w ith a mobile phase of acetonitrile-water aqueous solution by gradient elution.The detection wavelength was 203 nm，while the flow rate was 1.0 mL/min，and the column temperature was 30℃.Results：Good linear relationships were obtained w ithin the range of 0.160～3.200μg（r=0.999 7），0.216～ 4.320μg（r=0.999 9）and 0.274～ 5.480μg（r=0.999 3）for Ginsenoside Rg1，Ginsenoside Re and ginsenoside Rb1，while the average recovery rates were 98.63% （RSD=1.13%），98.26% （RSD=1.17%）and 98.74%（RSD=1.07%），respectively.Conclusion：This method is simple，accurate，specific，reproducible and may be used for simultaneous determination of contents of three Ginsenosides in ginseng fruit.

Ginseng Schisandrae Particles；Ginsenoside Rg1；Ginsenoside Re；Ginsenoside Rb1；HPLC

10.3969/j.issn.1672-5433.2016.11.004

中華醫(yī)學(xué)會(huì)美能皮膚病學(xué)研究基金（2012031206）

吳軍紅，男，主管藥師。研究方向：中藥檢驗(yàn)及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。E-mail：48042557@qq.com

吳文中，男，博士，主任醫(yī)師、教授。主要從事Th細(xì)胞在銀屑病發(fā)病機(jī)制中的作用及復(fù)方甘草酸苷對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖和相關(guān)因子表達(dá)影響的臨床和實(shí)驗(yàn)研究工作。通訊作者E-mail：wzwucn@163.com

（2016-06-03）