穩(wěn)定表達(dá)人源α2A-腎上腺素受體細(xì)胞系的建立

楊 懌，李玉蕾，劉 夢(mèng)，周培嵐，蘇瑞斌，宮澤輝

（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所，抗毒藥物與毒理學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100850）

·實(shí)驗(yàn)方法·

穩(wěn)定表達(dá)人源α2A-腎上腺素受體細(xì)胞系的建立

楊 懌，李玉蕾，劉 夢(mèng)，周培嵐，蘇瑞斌，宮澤輝

（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所，抗毒藥物與毒理學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100850）

目的建立穩(wěn)定表達(dá)人源α2A-腎上腺素能受體（α2A-AR）的細(xì)胞系。方法將帶有潮霉素B（Hygro）抗性的α2A-AR（pcDNA3.1/Hygro-HA-α2A-AR）重組質(zhì)粒通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染至已表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）標(biāo)記的蛋白激酶A催化亞基（PKAcat）的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢（CHO）細(xì)胞（以Hygro 200 mg·L-1進(jìn)行壓力篩選后，采用PKA重分布實(shí)驗(yàn)篩選陽(yáng)性克隆），然后使用實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證α2A-AR受體在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)，最后以時(shí)間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移免疫實(shí)驗(yàn)檢測(cè)cAMP含量以鑒定受體功能。結(jié)果PKA重分布實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CHO-PKAcat-α2A-AR 7號(hào)克隆反應(yīng)性良好；與CHO-PKAcat-EGFP細(xì)胞相比，該細(xì)胞系α2A-AR mRNA表達(dá)水平較高（P＜0.01），且多次傳代能保持穩(wěn)定；在α2A-AR激動(dòng)劑作用后，能顯著抑制forskolin引起的cAMP水平升高（P＜0.01）。結(jié)論成功構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)α2A-AR的CHO-PKAcat-α2A-AR細(xì)胞系，可用于藥物篩選及機(jī)制研究。

中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞；受體，腎上腺素α2A；蛋白激酶A；cAMP

位于交感神經(jīng)節(jié)前和節(jié)后的α-腎上腺素受體（α-adrenoceptor，α-AR）對(duì)一系列激動(dòng)劑或拮抗劑表現(xiàn)不同效應(yīng)，其分型包括α1-AR和α2-AR。α2-AR主要分布于突觸前，在中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)的腎上腺素和非腎上腺素能神經(jīng)元上反饋調(diào)節(jié)遞質(zhì)釋放［1］，進(jìn)而介導(dǎo)多種生理或藥理作用?；驕y(cè)序又將α2-AR分為3個(gè)亞型，分別位于10，2和4號(hào)染色體上，依次命名為α2A-AR，α2B-AR和α2C-AR［2］。目前已逐漸證實(shí)多數(shù)α2-AR激動(dòng)劑的效應(yīng)是由α2A-AR介導(dǎo)，如可樂(lè)定、右美托咪定（dexmedetomidine，DMED）、莫索尼定和利美尼定的降血壓及心動(dòng)過(guò)緩效應(yīng)僅依賴于α2A-AR［3-4］，而DMED在α2A-AR基因敲除小鼠模型上不再發(fā)揮鎮(zhèn)痛效應(yīng)［5-6］。α2A-AR的主導(dǎo)地位源自其在中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)尤其是腦內(nèi)廣泛而大量的分布，如腦干、大腦皮質(zhì)、下丘腦、海馬、杏仁核、基底前腦和藍(lán)斑等腦區(qū)［7-8］。目前對(duì)α2-AR 3個(gè)亞型的生理功能仍不完全清楚。盡管多數(shù)研究認(rèn)為α2A-AR具有主要作用，但由于缺乏亞型選擇性藥物，尚無(wú)法排除α2B-AR和α2C-AR是否參與介導(dǎo)激動(dòng)劑的作用，且無(wú)法深入分析α2A-AR調(diào)節(jié)生理功能的分子機(jī)制。近年來(lái)，靶向α2A-AR選擇性配體的研究逐漸增加，但在動(dòng)物模型上無(wú)法篩選受體亞型選擇性配體。因此，必須在體外建立快速有效的藥物篩選細(xì)胞模型，對(duì)于發(fā)現(xiàn)靶向α2A-AR的新藥具有重要意義。α2A-AR是經(jīng)典的A類G蛋白偶聯(lián)受體，主要通過(guò)偶聯(lián)并激活Gi/o蛋白產(chǎn)生生物學(xué)功能，激活α2A-AR后可抑制腺苷酸環(huán)化酶（adenylate cyclase，AC）活性，抑制三磷酸腺苷向環(huán)磷酸腺苷（cAMP）轉(zhuǎn)化，進(jìn)而抑制蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）的活性［10］，基于受體激活可以抑制AC-cAMP-PKA通路的原理，本研究擬在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢（Chinese hamster ovary，CHO）細(xì)胞上建立穩(wěn)定表達(dá)人源α2A-AR的細(xì)胞系〔CHO-PKA催化亞基（PKAcat）-α2A-AR〕，用于靶向α2A-AR的藥物篩選及分子機(jī)制研究。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑和儀器

增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（enhanced green fluo?rescent protein，EGFP）標(biāo)記的CHO-PKAcat細(xì)胞（CHO-PKAcat-EGFP）由本研究所王莉莉教授提供；帶有潮霉素B（hygromycin B，Hygro）抗性的質(zhì)粒（pcDNA3.1/Hygro）由本研究所叢玉文教授惠贈(zèng)；人源α2A-AR質(zhì)粒購(gòu)自北京西美杰科技有限公司；KOD FX高保真聚合酶購(gòu)自東洋紡（上海）生物科技有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、E.coli DH5α菌株和D2000 DNA分子質(zhì)量標(biāo)志購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；Hygro購(gòu)自瑞士Roche公司；F-12基礎(chǔ)培養(yǎng)基（粉劑）購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；F-12液體培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)HyClone公司；T4DNA連接酶、RNA酶抑制劑、dNTP混合物和Oligo d（T）18引物購(gòu)自日本TaKaRa公司；瓊脂糖、脂質(zhì)體LipofectaminTM2000、Hoechst33342、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶和2×Power SYBR Green PCR Master Mix購(gòu)自美國(guó)Life Technologies公司；LANCE cAMP 384試劑盒購(gòu)自美國(guó)Perkin Elmer公司；forskolin購(gòu)自美國(guó)Sigma Aldrich公司；限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、XhoⅠ及HindⅢ購(gòu)自美國(guó)Fermentas公司；DMED購(gòu)自濟(jì)南德信佳生物科技有限公司；美托咪定（medetomidine，MED）購(gòu)自濟(jì)南鳳山恒坤化工科技有限公司。

凝膠成像儀購(gòu)自美國(guó)KODAK公司；熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司；Envision 2104 MultilabelReader購(gòu)自美國(guó)Perkin Elmer公司；基因擴(kuò)增儀購(gòu)自北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司；In CellAnalyzer1000購(gòu)自美國(guó)GE Healthcare公司。

1.2 pcDNA3.1/Hygro-HA-α2A-AR重組質(zhì)粒構(gòu)建

PCR法在α2A-AR基因片段引入酶切位點(diǎn)，引物序列正向：CGGAATTCATGCGTTCATGTTCC?GC；反向：CCTCGAGATCACACGATCCGCTTCC；擴(kuò)增條件為：步驟1 94℃2 min；步驟2 94℃30 s；步驟3 65℃30 s；步驟4 72℃60 s；步驟5 72℃10 min，步驟2～4循環(huán)30次，瓊脂糖凝膠電泳分離目的基因并進(jìn)行凝膠回收，產(chǎn)物與pCMV-HA載體均用EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切后進(jìn)行連接并轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)菌，接種于固體LB培養(yǎng)基（氨芐青霉素抗性），挑取單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切驗(yàn)證，并對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行目的基因測(cè)序比對(duì)。

PCR法獲得帶有酶切位點(diǎn)HindⅢ、XhoⅠ和HA標(biāo)簽的目的基因序列，引物序列正向：CAAGCTTGATGTACCCATACGATGTTC；反向：CCTCGAGATCACACGATCCGCTTCC；擴(kuò)增條件同前。再對(duì)pcDNA3.1/Hygro載體與目的基因雙酶切及連接，后續(xù)方法同上，重組質(zhì)粒經(jīng)酶切驗(yàn)證及測(cè)序比對(duì)。

1.3 脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染建立CHO-PKAcat-α2A-AR穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系

CHO-PKAcat-EGFP細(xì)胞接種至培養(yǎng)皿，用含有10%胎牛血清的F-12基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)，細(xì)胞密度達(dá)80%進(jìn)行轉(zhuǎn)染，先將LipofectamineTM2000與pcDNA3.1/Hygro-HA-α2A-AR重組質(zhì)粒進(jìn)行混合孵育，其后加入培養(yǎng)皿中轉(zhuǎn)染。24 h后將培養(yǎng)基換成含有Hygro（200 mg·L-1）的培養(yǎng)基，抗生素壓力篩選10 d，采用有限稀釋法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行克隆化培養(yǎng)。

1.4 PKA重分布實(shí)驗(yàn)篩選陽(yáng)性細(xì)胞株

細(xì)胞克隆接種到96孔板，待密度達(dá)80%時(shí)，用新鮮F-12培養(yǎng)基洗細(xì)胞1次，加入F-12培養(yǎng)基每孔100μL，先后加入激動(dòng)劑DMED和forskolin每孔各50μL，至終濃度分別為10和100μmol·L-1，37℃培養(yǎng)箱中孵育10 min，每孔加入100μL 4%甲醛，室溫固定20 min，PBS緩沖液洗細(xì)胞2次，每孔加入PBS配制的Hoechst33342（1μmol·L-1）100μL進(jìn)行染色，避光反應(yīng)30 min后用In CellAnalyzer 1000獲取細(xì)胞熒光圖像，利用多靶點(diǎn)分析模塊進(jìn)行分析，計(jì)算顆粒形成指數(shù)反映PKA重分布程度。顆粒形成指數(shù)=（顆粒熒光強(qiáng)度-背景熒光強(qiáng)度）×顆粒熒光總面積，受體功能活性（%）=（DMED組顆粒形成指數(shù)-forskolin組顆粒形成指數(shù)）/（對(duì)照組顆粒形成指數(shù)-forskolin組形成指數(shù)）×100%，篩選活性高的細(xì)胞株。

采用計(jì)算Z′因子的方法評(píng)價(jià)該細(xì)胞模型的可靠性，此法在評(píng)價(jià)高通量篩選、高內(nèi)涵分析實(shí)驗(yàn)體系的穩(wěn)定性和可靠性中應(yīng)用廣泛，公式為Z′=1-（3σc++3σc-）/|μc+-μc-|，式中σ為標(biāo)準(zhǔn)差，μ為平均值，c+為陽(yáng)性對(duì)照，c-為陰性對(duì)照，當(dāng)Z′在0.5～1之間時(shí)，說(shuō)明體系穩(wěn)定性，可靠性良好。事先將CHO-PKAcatα2A-AR細(xì)胞接種到96孔板，待細(xì)胞密度達(dá)80%時(shí)，用F-12基礎(chǔ)培養(yǎng)基洗細(xì)胞（每孔100μL）。陰性對(duì)照組加入forskolin每孔50μL（終濃度10μmol·L-1），陽(yáng)性對(duì)照組加入DMED每孔50μL（終濃度100 nmol·L-1）與forskolin每孔50μL（終濃度10μmol·L-1）共孵育，加入F-12培養(yǎng)基補(bǔ)足反應(yīng)體系200μL，培養(yǎng)箱中孵育10 min，加入甲醛（終濃度4%）孵育20 min，PBS緩沖液洗細(xì)胞2次，加入PBS配制的Hoechst33342（1μmol·L-1）進(jìn)行染色，避光反應(yīng)30 min后利用In CellAnalyzer 1000獲取細(xì)胞圖像。重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，計(jì)算各組的顆粒形成指數(shù)，按公式計(jì)算Z′因子。

1.5 實(shí)時(shí)定量-PCR檢測(cè)α2A-AR mRNA水平

細(xì)胞接種于6孔板中，細(xì)胞密度達(dá)90%后，用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，以CHO-PKAcat-EGFP細(xì)胞為對(duì)照，以總RNA為模板，按如下體系反應(yīng)：總RNA1.5μg，5×逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液4μL，dNTP混合物（10 mmol·L-1）2μL，RNA酶抑制劑（20 U）0.5μL，Oligo dT（18）引物（50 pmol）1μL，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶0.75μL，加無(wú)RNA酶的水至總體積20μL。反應(yīng)條件：42℃1 h，70℃5 min，逆轉(zhuǎn)錄合成α2A-AR的cDNA。

qRT-PCR反應(yīng)體系為：模板cDNA 0.6μL，無(wú)RNA酶的H2O 4.0μL，2×Power SYBR Green PCR Master Mix 5μL，上下游引物（10μmol·L-1）各0.2μL。人α2A-AR引物序列正向：GTCGTGCATC?GGCTCCTT；反向：CGACGCTTGGCGATCTG。大鼠β肌動(dòng)蛋白引物序列正向：CGCCAGGTCAT?CACTATTG；反向：CAGGTCTTTACGGATGT?CAAC。反應(yīng)條件為：95℃2 min；95℃15 s，62℃10 s，70℃30 s，40個(gè)循環(huán)；72℃5 min。

反應(yīng)結(jié)束后獲得2株細(xì)胞相關(guān)基因的Ct值，通過(guò)內(nèi)參基因β肌動(dòng)蛋白得出α2A-AR的相對(duì)表達(dá)量△Ct，然后計(jì)算2株細(xì)胞間α2A-AR的△△Ct，最后采用2-△△Ct法計(jì)算CHO-PKAcat-α2A-AR和CHOPKAcat-EGFP細(xì)胞間的α2A-AR表達(dá)差異。

1.6 檢測(cè)cAMP含量驗(yàn)證CHO-PKAcat-α2A-AR中的受體功能

使用LANCE cAMP 384試劑盒檢測(cè)胞內(nèi)cAMP含量，實(shí)驗(yàn)基于一個(gè)競(jìng)爭(zhēng)免疫反應(yīng)，銪標(biāo)的cAMP示蹤復(fù)合物與反應(yīng)體系中的cAMP競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合標(biāo)有熒光染料的cAMP抗體。當(dāng)抗體與示蹤劑結(jié)合時(shí)，340 nm的激發(fā)光可以激發(fā)銪標(biāo)分子，使能量轉(zhuǎn)移到熒光染料上，從而產(chǎn)生665 nm的發(fā)射光；而未結(jié)合抗體的銪標(biāo)分子則會(huì)逃逸615 nm的熒光，因此反應(yīng)體系中的cAMP含量與激發(fā)的熒光強(qiáng)度成反比。CHO-PKAcat-EGFP細(xì)胞和CHO-PKAcatα2A-AR細(xì)胞分別接種到6孔板中，待細(xì)胞密度達(dá)90%后，加入Versene消化液消化細(xì)胞，細(xì)胞分散后用HBSS緩沖液吹打重懸細(xì)胞，800×g離心5 min，棄上清后用200μL刺激緩沖液（含HBSS，0.5 mol·L-1IBMX，7.5%BSA）重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)細(xì)胞，將細(xì)胞密度調(diào)至6×108L-1，在白色OptiPlate-384孔板中加樣，細(xì)胞-抗體復(fù)合物5μL，forskolin和（或）DMED 5μL，室溫孵育30 min后加入檢測(cè)復(fù)合物10μL，混合后室溫孵育1 h，用Envision 2104 Multilabel Reader測(cè)定發(fā)射波長(zhǎng)665 nm的讀數(shù)。

1.7 采用構(gòu)建的CHO-PKAcat-α2A-AR評(píng)價(jià)藥物活性

CHO-PKAcat-α2A-AR細(xì)胞接種到96孔板，待細(xì)胞密度達(dá)80%時(shí)，用F-12基礎(chǔ)培養(yǎng)基洗細(xì)胞每孔100μL；陰性對(duì)照組加入forskolin每孔50μL（終濃度10μmol·L-1），測(cè)量組加入DMED/MED每孔50μL（終濃度1×10-7～1×10-11mol·L-1）與forskolin每孔50μL（終濃度10μmol·L-1）孔共孵育，加入F-12培養(yǎng)基補(bǔ)足反應(yīng)體系200μL，培養(yǎng)箱中孵育10 min，加入甲醛（終濃度4%）孵育20 min，PBS緩沖液洗細(xì)胞2次，加入PBS配制的Hoechst33342（1μmol·L-1）進(jìn)行染色，避光反應(yīng)30 min后利用In Cell Analyzer 1000獲取細(xì)胞圖像，并計(jì)算藥效強(qiáng)度（%）=（DMED各濃度組顆粒形成指數(shù)-forskolin組顆粒形成指數(shù)）/（DMED最高濃度組顆粒形成指數(shù)-forskolin組形成指數(shù)）×100%，反映藥物量效關(guān)系。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果以表示，軟件GraphPad Prism 5.0，用one-way ANOVA，Tukey t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建pcDNA3.1/Hygro-HA-α2A-AR重組質(zhì)粒

圖1結(jié)果顯示，PCR擴(kuò)增獲得帶有酶切位點(diǎn)EcoRⅠ和XhoⅠ的目的基因α2A-AR，瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物條帶在目的基因1398 bp附近（圖1A），表明擴(kuò)增成功。目的基因與pCMV-HA載體進(jìn)行酶切連接，提取質(zhì)粒后酶切鑒定，可見(jiàn)載體和目的基因雙條帶（圖1B），證明連接成功。測(cè)序結(jié)果表明，擴(kuò)增序列與GenBank BC035047.1序列完全吻合。

Fig.1 PCR product ofα2A-adrenoceptor（α2A-AR）（A）and recombinant plasmid pCMV-HA-α2A-AR digested with EcoRⅠand XhoⅠ（B）by agarose gel electrophoresis.M：marker．Lane 1 was construction ofα2A-AR product in A and recombinantplasmid pCMV-HA-α2A-AR in B，respectively.

PCR擴(kuò)增獲得帶有酶切位點(diǎn)HindⅢ和XhoⅠ的目的基因HA-α2A-AR，電泳條帶位置正確（圖2A）。目的基因與pcDNA3.1/Hygro載體酶切后進(jìn)行連接，提取質(zhì)粒后酶切鑒定，可見(jiàn)載體和目的基因雙條帶（圖2B），證明連接成功。測(cè)序結(jié)果表明，擴(kuò)增序列與GenBank BC035047.1序列完全吻合，證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

Fig.2 PCR product of HA-α2A-AR（A）and recombinant plasmid pcDNA3.1/hygromycin B（Hygro）-HA-α2A-AR digested with HindⅢand XhoⅠ（B）by agarose gel elec?trophoresis.M：marker；lane 1：PCR product of HA-α2A-AR in A and recombinant plasmid pcDNA3.1/Hygro-HA-α2A-AR in B，respectively.

2.2 PKA重分布實(shí)驗(yàn)篩選陽(yáng)性細(xì)胞株

pcDNA3.1/Hygro-HA-α2A-AR重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO-PKAcat-EGFP細(xì)胞后先經(jīng)Hygro 200 mg·L-1壓力篩選，共獲得24株細(xì)胞克??；采用PKA重分布實(shí)驗(yàn)，經(jīng)初篩和多代培養(yǎng)復(fù)篩，最終選出對(duì)PKA重分布抑制程度高且狀態(tài)良好的細(xì)胞株-7號(hào)克隆（圖3A，B）；經(jīng)計(jì)算，7號(hào)克隆的Z′因子在0.5～1之間（圖3C），表明細(xì)胞株穩(wěn)定。后續(xù)采用的CHO-PKAcat-EGFP-α2A-AR均為7號(hào)克隆。

2.3 α2A-AR mRNA在CHO-PKAcat-α2A-AR細(xì)胞中的表達(dá)

連續(xù)傳代1～20代，采用qRT-PCR方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)（圖4），與CHO-PKAcat-EGFP細(xì)胞相比，CHOPKAcat-α2A-AR細(xì)胞α2A-AR mRNA表達(dá)水平顯著增加（P＜0.01），且多次傳代均有高水平表達(dá)，表明α2A-AR在該細(xì)胞中已穩(wěn)定表達(dá)。

2.4 α2A-AR激動(dòng)劑對(duì)CHO-PKAcat-α2A-AR細(xì)胞cAMP含量的影響

圖5表明，forskolin（10μmol·L-1）刺激CHOPKAcat-EGFP和CHO-PKAcat-α2A-AR細(xì)胞后，均可顯著增加cAMP含量，表現(xiàn)為L(zhǎng)ANCE信號(hào)強(qiáng)度（665 nm）明顯降低，DMED（1×10-8～1×10-4mol·L-1）對(duì)CHO-PKAcat-EGFP的cAMP含量無(wú)顯著影響，但DMED（1×10-6～1×10-4mol·L-1）可顯著抑制CHO-PKAcat-α2A-AR中的cAMP生成。進(jìn)一步證明α2A-AR已在該細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。

Fig.3 Screening clone of CHO-PKAcat-α2A-AR cells by protein kinase A（PKA）redistribution assay.A：the primary screening of clones of CHO-PKAcat-α2A-AR cells；B：the second screening of clones of CHO-PKAcat-α2A-AR cells；C：the values of Z′in experiments independently replicated three times.

Fig.4α2A-AR mRNA expression in CHO-PKAcat-α2A-AR cells.**P＜0.01，compared with CHO-PKAcatenhanced green fluorescent protein（EGFP）cells.

Fig.5 Effect of forskolin and dexmedetomidine（DMED）on cAMP content in CHO-PKAcat-EGFP cells and CHOPKAcat-α2A-AR cells.**P＜0.01，compared with corresponding controlgroup；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with forskolin group.

2.5 采用構(gòu)建的CHO-PKAcat-α2A-AR細(xì)胞評(píng)價(jià)藥物活性

使用DMED和MED（1×10-7～1×10-11mol·L-1）作用于CHO-PKAcat-α2A-AR細(xì)胞，通過(guò)PKA重分布實(shí)驗(yàn)，兩者對(duì)α2A-AR表現(xiàn)出濃度依賴性的激動(dòng)活性（圖6），二者均能抑制PKA激活，DMED的EC50為（1.03±0.66）nmol·L-1，MED的EC50為（1.95± 0.08）nmol·L-1。

Fig.6 Concentration response curve of DMED and medetomidine（MED）in CHO-PKAcat-α2A-AR cells by PKA redistribution assay.

3 討論

本模型采用的工具細(xì)胞為CHO-PKAcat-EGFP，基礎(chǔ)狀態(tài)下PKAcat熒光顆粒聚集，AC-cAMP-PKA通路激活后，PKAcat活化并解離［10］，表現(xiàn)為熒光顆粒彌散；α2A-AR激活后可抑制AC-cAMP-PKA通路，即可抑制熒光顆粒彌散過(guò)程，用In CellAnalyzer 1000獲得細(xì)胞熒光圖像，分析熒光顆粒彌散程度即可量化藥物對(duì)受體的激活程度，從而分析α2A-AR的表達(dá)量及藥物的作用強(qiáng)度。本研究結(jié)果表明，α2A-AR激動(dòng)劑DMED可顯著抑制forskolin引起的cAMP含量增多，與PKA重分布實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致。

DMED是強(qiáng)效的α2A-AR激動(dòng)劑，1999年美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市，用于重癥監(jiān)護(hù)患者和非插管患者術(shù)前及術(shù)中短期鎮(zhèn)靜，臨床使用非常廣泛。在分子水平，研究者用［35S］GTPγS結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明，DMED作為部分激動(dòng)劑激活α2A-AR，介導(dǎo)受體偶聯(lián)并激活Gi蛋白［11］，且可有效抑制AC活性，其EC50均在納摩爾水平［12］。相較于其余多種α2A-AR激動(dòng)劑，DMED表現(xiàn)出較高的效價(jià)強(qiáng)度。在本細(xì)胞模型上對(duì)DMED的藥效學(xué)評(píng)價(jià)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致。由于DMED是MED的右旋體有效成分，理論上DMED藥效強(qiáng)度應(yīng)為MED的2倍，研究結(jié)果也表明二者的EC50值符合這一推論。對(duì)不表達(dá)α2A-AR的細(xì)胞，DMED和MED均不表現(xiàn)抑制作用。通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，本研究成功構(gòu)建了細(xì)胞模型CHO-PKAcat-α2A-AR，并采用多種方法驗(yàn)證了細(xì)胞中α2A-AR的表達(dá)和功能，均表明本細(xì)胞模型穩(wěn)定可靠，用于化合物活性篩選操作方便快捷，為篩選靶向α2A-A R的選擇性配體及探討其作用的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

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Establishment of recombinant cellline stably expressing humanα2A-adrenoceptor

YANG Yi，LIYu-lei，LIU Meng，ZHOU Pei-lan，SU Rui-bin，GONG Ze-hui
（State Key Laboratory of Toxicology and MedicalCountermeasures，Institute of Pharmacology and Toxicology，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100850，China）

OBJECTIVE To establish a new cellline thatcan stably express humanα2A-adrenoceptor（α2A-AR）.METHODS Recombinant plasmid ofα2A-AR with hygromycin B（Hygro）resistance（pcDNA3.1/Hygro-HA-α2A-AR）was stably transfected into Chinese hamster ovary（CHO）cells which had expressed protein kinase A catalytic subunits（PKAcat）with labeling of enhanced green fluorescent protein（EGFP）by a Lipofectamine based method.A single positive clone expressingα2A-AR was selected through cultivation in the presence of 200 mg·L-1hygromycin B followed by PKA redistribution assay. The transcriptionalexpression ofα2A-AR was detected by quantitative real-time PCR（qRT-PCR）.Timeresolved fluorescence resonance energy transfer immunoassay was used to identify the function of inhibiting cAMP accumulation ofα2A-AR.RESULTS The CHO-PKAcat-α2A-AR cell line No.7 exhibited stable response in PKA redistribution assay.qRT-PCR analysis demonstrated that the high expression of α2A-AR in the cellline remained stable after a few generations compared with CHO-PKAcat-EGFP cells（P＜0.01）.The cAMP accumulation caused by forskolin was significantly inhibited byα2A-AR agonist in CHO-PKAcat-α2A-AR cells（P＜0.01）.CONCLUSION CHO-PKAcat-α2A-AR cell line is constructed successfully,which provides an effective modelfordrug screening and studies ofmechanisms.

Chinese hamster ovary cells；receptors，adrenergicα2A；protein kinase A；cAMP

The projectsupported by NationalScience and Technology Major Projectof China（2012ZX09301003-003）

SU Rui-bin，E-mail：ruibinsu@126.com，Tel：（010）66931607；ZHOU Pei-lan，E-mail：zhoupeilan0502@sina.com，Tel：（010）66931612

R965.1

A

1000-3002-（2016）05-0576-06

10.3867/j.issn.1000-3002.2016.05.015

2015-12-25接受日期：2016-03-30）

（本文編輯：?jiǎn)?虹）

國(guó)家科技重大專項(xiàng)（2012ZX09301003-003）

楊懌，女，碩士研究生，Tel：（010）66874604，E-mail：murongjiuyy@126.com；蘇瑞斌，男，研究員，博士生導(dǎo)師，主要從事神經(jīng)精神藥理學(xué)研究。

蘇瑞斌，E-mail：ruibinsu@126.com，Tel：（010）66931607；周培嵐，E-mail：zhoupeilan0502@sina.com，Tel：（010）66931621