二烯丙基硫化物對(duì)百草枯中毒急性肺損傷大鼠的抗氧化作用

曹玉芳，王洪武，蘇 醒，侯 宇，管 軍，謝 斌，余燕梅，王蓮藕，陳穎斌，韓艷麗，邱平，宋 維

（?？谑腥嗣襻t(yī)院1.重癥醫(yī)學(xué)科；2.腎內(nèi)科，海南?？?70208；3.海南省人民醫(yī)院急診科，海南?？?70102）

二烯丙基硫化物對(duì)百草枯中毒急性肺損傷大鼠的抗氧化作用

曹玉芳1，王洪武1，蘇 醒1，侯 宇1，管 軍1，謝 斌1，余燕梅1，王蓮藕1，陳穎斌1，韓艷麗1，邱平2，宋 維3

（?？谑腥嗣襻t(yī)院1.重癥醫(yī)學(xué)科；2.腎內(nèi)科，海南?？?70208；3.海南省人民醫(yī)院急診科，海南?？?70102）

目的探討二烯丙基硫化物（DAS）對(duì)百草枯（PQ）中毒大鼠急性肺損傷的影響。方法100只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為5組，正常對(duì)照組、PQ 70 mg·kg-1模型組、DAS 25，50和100 mg·kg-1治療組，每組20只。一次性ig給予PQ 70 mg·kg-1制備PQ中毒模型，DAS組于造模前、后30 min ip給予相應(yīng)劑量藥物，正常對(duì)照組ip給予等量生理鹽水。各組分別于造模后1，3，6和12 h麻醉大鼠，取右肺下葉進(jìn)行HE染色，光鏡下觀察肺組織病理?yè)p傷程度并評(píng)分；右肺上葉進(jìn)行肺組織一氧化氮（NO）含量檢測(cè)；左肺進(jìn)行支氣管肺泡灌洗獲取肺泡巨噬細(xì)胞（AM），培養(yǎng)24 h取上清，分光光度法測(cè)定誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）含量；培養(yǎng)至72 h，采用細(xì)胞免疫化學(xué)方法檢測(cè)AM中iNOS蛋白的表達(dá)。結(jié)果與正常對(duì)照組比較，模型組肺泡結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，病理評(píng)分明顯升高（P＜0.01），肺組織中NO含量明顯升高（P＜0.01），AM培養(yǎng)上清液中iNOS含量明顯升高（P＜0.01），iNOS蛋白表達(dá)增加（P＜0.05）；與模型組比較，DAS 50 mg·kg-1組在造模后3，6和12 h以及DAS 100 mg·kg-1組在造模后1，3，6和12 h肺泡結(jié)構(gòu)損傷顯著減輕，病理評(píng)分降低（P＜0.05）；DAS 25和50 mg·kg-1組肺組織中NO和iNOS含量及iNOS蛋白表達(dá)減少（P＜0.05），DAS 100 mg·kg-1組NO含量減少更為明顯（P＜0.01）。結(jié)論DAS可能通過(guò)抑制PQ中毒大鼠肺組織中的氧化損傷因子減輕肺損傷。

百草枯；一氧化氮；誘導(dǎo)型一氧化氮合酶；急性肺損傷；二烯丙基硫化物

百草枯（paraquat，PQ）中毒后死亡率高，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)有效的治療手段，是目前治療的難點(diǎn)和研究的熱點(diǎn)。一旦誤服，很快被胃腸黏膜吸收并于0.5～2 h達(dá)到血漿峰濃度，主要集聚在肺組織，其毒性較強(qiáng)，口服致死量小（口服20%PQ溶液5 mL即可致死）。PQ可經(jīng)皮膚、呼吸道和消化道3種途徑進(jìn)入體內(nèi)造成中毒，病程進(jìn)展快，病死率高達(dá)33%～78%［1-2］。

目前，對(duì)PQ的毒理作用機(jī)制已做了大量工作，但PQ中毒患者死亡率仍然很高，缺乏特效的解毒藥物［3-4］，PQ中毒后很快出現(xiàn)多器官功能衰竭致使患者死亡［5-6］。大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為氧化還原反應(yīng)是PQ中毒的主要死因。Flora等［7］研究也證實(shí)，過(guò)度的氧化應(yīng)激反應(yīng)累及人體功能紊亂，其中氧、氮、碳和硫等反應(yīng)分子在氧化應(yīng)激反應(yīng)中擔(dān)任重要角色。在生物體系中，這些自由基或活性氧通常是通過(guò)異常代謝激活的。如電離輻射、毒物刺激及炎癥細(xì)胞分泌等等［8］。PQ進(jìn)入體內(nèi)可改變氧化還原循環(huán)，但PQ中毒的重要生化反應(yīng)還不十分清楚。誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）是一氧化氮（nitric oxide，NO）的合成酶，由內(nèi)毒素及多種炎癥細(xì)胞因子刺激合成，常存在于血管平滑肌細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞（alveolar macrophages，AM）、成纖維細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及氣道上皮細(xì)胞中。iNOS激活后產(chǎn)生的過(guò)量NO使炎癥細(xì)胞在肺血管內(nèi)皮細(xì)胞上黏附并相互作用，引起血管通透性增加，導(dǎo)致肺水腫及急性肺損傷。通常iNOS在生理狀態(tài)下很少表達(dá)，但在炎癥、中毒、毒素刺激及創(chuàng)傷等情況下其表達(dá)增強(qiáng)，并促使NO的分泌增加，高濃度NO可抑制三羧酸循環(huán)和DNA復(fù)制中的關(guān)鍵酶，造成能量代謝障礙和DNA損傷［9］，并增強(qiáng)NF-κB活性及其下游炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，擴(kuò)大炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致肺損傷進(jìn)一步加重。

二烯丙基硫化物（diallylsulfide，DAS）為大蒜中提取的化合物，具有較強(qiáng)的抗氧化活性［10-11］。這類有機(jī)化合物通過(guò)周期素依賴性蛋白激酶阻止G2/M期分裂［12］。本研究旨在模擬人體中毒途徑，對(duì)AM進(jìn)行培養(yǎng)，測(cè)定iNOS表達(dá)，研究DAS的抗氧化作用，以尋找PQ中毒患者的新的救治方法，提高治愈率，降低死亡率。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑和主要儀器

20%PQ（河北桃園農(nóng)藥有限公司，批號(hào)：20080606，避光保存）；DAS（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：592-88-1，避光4℃保存）；96T/48T大鼠NO ELISA測(cè)定試劑盒（北京方程生物科技有限公司）；IM-30336大鼠iNOS免疫組化檢測(cè)試劑盒（上海雅吉生物科技有限公司）；CM胎牛血清（武漢博士德生物工程有限公司）；多聚甲醛、二甲苯和乙醇等常規(guī)試劑（海南省海口市人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室）。Image-Pro Plus專業(yè)圖像分析軟件（美國(guó)Media Cybernetics公司）；BBD6220 CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Scientific公司）；ULT2586-4-v超低溫冰箱（美國(guó)Revco公司）；3k30臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Sigma公司）；Ti-E倒置熒光顯微鏡（日本Nikon公司）；722S型分光光度儀（上海儀電分析儀器有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、模型制備和分組

5～7周齡清潔級(jí)雄性Wistar大鼠100只，體質(zhì)量為200～250 g，購(gòu)于四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物試驗(yàn)資格認(rèn)可證：川動(dòng)管第2005-853號(hào)。實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)2周，每籠5只，溫度22～24℃，濕度40%～60%，動(dòng)物自由進(jìn)食進(jìn)水，自然晝夜節(jié)律光照；按隨機(jī)數(shù)字表法將Wistar雄性大鼠100只分為正常對(duì)照組、模型組及DAS 25，50和100 mg·kg-1組，每組20只。一次性ig給予PQ 70 mg·kg-1制備中毒大鼠模型；造模當(dāng)日（造模前、后30 min）對(duì)DAS組ip給予DAS 25，50和100 mg·kg-1，PQ組和正常對(duì)照組ip給予等量生理鹽水。動(dòng)物處置方法符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)并經(jīng)過(guò)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3 肺組織病理觀察

各組大鼠分別于造模后1，3，6和12 h給予2.5%水合氯醛麻醉，取大鼠氣管、右下肺組織，用4%甲醛固定，HE染色后觀察并照相。每張切片觀察5個(gè)高倍視野，采用Smith等［13］評(píng)分方法對(duì)肺組織進(jìn)行病理?yè)p傷評(píng)分。主要觀察指標(biāo)包括肺水腫、肺泡間質(zhì)炎癥、肺泡間質(zhì)充血、肺出血、肺不張和透明膜形成。分別進(jìn)行0～4評(píng)分，其中無(wú)病理?yè)p傷為0分，病變范圍＜25%為1分，病變范圍占25%～50%為2分，50%～75%為3分，病變滿視野為4分，總肺損傷評(píng)分為上述各項(xiàng)之和。

1.4 硝酸還原酶法檢測(cè)肺組織中NO含量

各組大鼠分別于造模后1，3，6和12 h給予2.5%水合氯醛麻醉，無(wú)菌狀態(tài)下取大鼠右上肺組織0.1 g制備成10%的勻漿，以999×g離心15 min后取上清液，檢測(cè)肺組織NO含量（μmol·g-1蛋白）。

1.5 肺泡巨噬細(xì)胞分離培養(yǎng)及iNOS含量測(cè)定

各組大鼠分別于造模后1，3，6和12 h給予2.5%水合氯醛麻醉，左肺進(jìn)行支氣管肺泡灌洗。收集支氣管肺泡灌洗液，離心獲取細(xì)胞，用差速貼壁方法分離純化AM，30 min可見較多的AM貼壁，通過(guò)換液將大量的未貼壁細(xì)胞換去，獲得純度較高的貼壁細(xì)胞。于37℃，5%CO2溫箱中培養(yǎng)24 h，取上清按試劑盒步驟測(cè)定，計(jì)算iNOS含量（μmol·L-1）。

1.6 肺泡巨噬細(xì)胞中iNOS蛋白表達(dá)測(cè)定

棄去AM培養(yǎng)上清，繼續(xù)培養(yǎng)72 h。用Wright-Giemsa染色觀察AM活性狀態(tài)并證實(shí)貼壁細(xì)胞為巨噬細(xì)胞，采用倒置顯微鏡下觀察，純度＞90%。對(duì)培養(yǎng)的AM進(jìn)行免疫熒光細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)iNOS蛋白表達(dá)。Image-promedia圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行平均吸光度值（average absorbance，AA）分析。每張切片攝取5個(gè)視野。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)以x±s表示，經(jīng)SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩比較進(jìn)行t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 二烯丙基硫化物對(duì)百草枯中毒大鼠肺組織病理變化的影響

HE染色結(jié)果見圖1，正常對(duì)照組肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡壁無(wú)水腫，肺實(shí)質(zhì)無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。PQ中毒組肺部炎癥明顯，肺泡壁有明顯水腫、增厚及肺泡間隔斷裂，肺間質(zhì)增生及肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺間質(zhì)及肺泡腔炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，部分肺泡腔形成透明膜。而DAS治療組隨著給藥濃度增加，肺組織僅有部分增生、少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡結(jié)構(gòu)破壞逐漸減輕，肺泡腔內(nèi)無(wú)透明膜形成。肺組織病理評(píng)分結(jié)果（表1）表明，與正常對(duì)照組比較，模型組病理評(píng)分明顯升高（P＜0.01）。與PQ模型組比較，DAS 50 mg·kg-1組在（3，6和12 h）時(shí)段和DAS 100 mg·kg-1組在各時(shí)段病理評(píng)分降低（P＜0.05）。

2.2 DAS對(duì)大鼠肺組織中NO含量的影響

由表2可見，與正常對(duì)照組比較，模型組NO含量明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，DAS 25和50 mg·kg-1組NO含量減少（P＜0.05），DAS 100 mg·kg-1組NO含量明顯減少（P＜0.01）。提示DAS可降低PQ中毒大鼠肺組織中NO含量。

Fig.1 Effect of diallyl sulfide（DAS）on morphology of lung tissue damage induced by paraquat（PQ）（HE staining）. DAS was intraperitoneally injected before and after 30 min PQ 70 mg·kg-1exposure.Five rats in each group were sacrificed after PQ exposure at 1，3，6 and 12 h respectively.The blue arrows show a large number of inflammatory cells and collagen deposition.The black arrows show hyaline membrane formation.

Tab.1 Effect of DAS on lung injury score of rats induced by PQ

2.3 DAS對(duì)百草枯中毒大鼠肺泡巨噬細(xì)胞上清液中iNOS含量的影響

由表3可見，模型組iNOS含量自1 h開始明顯升高，3和6 h達(dá)到高峰，12 h又逐漸降低。與正常對(duì)照組相比，模型組iNOS含量顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，DAS 100 mg·kg-1組iNOS含量顯著降低（P＜0.05）。提示DAS 100 mg·kg-1可降低PQ中毒大鼠AM分泌的iNOS含量。

Tab.2 Effect of DAS on content of nitric oxide（NO）of rats with acute lung injury induced by PQ

Tab.3 Effect of DAS on content of inducible nitric oxide synthase（iNOS）in culture medium of alveolar macro?phages of rats with acute lung injury induced by PQ

2.4 DAS對(duì)百草枯中毒大鼠肺泡巨噬細(xì)胞中iNOS蛋白表達(dá)的影響

免疫熒光結(jié)果顯示（圖2），AM培養(yǎng)72 h后，正常對(duì)照組AM胞漿無(wú)亮綠色陽(yáng)性反應(yīng)，模型組中AM胞漿有明顯亮綠色陽(yáng)性反應(yīng)，DAS組中可見少量亮綠色陽(yáng)性反應(yīng)，提示DAS對(duì)AM中iNOS表達(dá)具有下調(diào)作用。免疫熒光AA值結(jié)果表明，與正常對(duì)照組AA值（2.3±0.05）比較，模型組AA值（6.1±0.15）顯著升高（P＜0.01，t=7.214）。與模型組比較，DAS 25，50和100 mg·kg-1組AA值（5.59±0.311，5.48± 0.58和5.01±0.19）均降低（P＜0.05）。提示DAS具有抗PQ中毒所致肺部氧化損傷作用。

Fig.2 Effect of DAS on iNOS protein expression of alveolar macrophages of rats with acute lung injury by direct immunofluorescence and fluorescence micros?copy.See Fig.1 for the rat treatment.The arrows indicate the expression of iNOS in the alveolar macrophages.

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)PQ造模后，大鼠表現(xiàn)為蜷縮、自發(fā)活動(dòng)減少、毛發(fā)豎起、呼吸急促、進(jìn)食飲水量明顯減少。給予DAS治療組大鼠自發(fā)活動(dòng)無(wú)明顯減少，部分大鼠毛發(fā)有豎起，進(jìn)食進(jìn)水量稍有減少，無(wú)明顯呼吸急促；PQ組肺組織病理見肺泡結(jié)構(gòu)破壞、肺間質(zhì)增厚、大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡腔內(nèi)透明膜形成。在治療組肺泡結(jié)構(gòu)部分破壞、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)較PQ組明顯減少，無(wú)明顯肺泡內(nèi)透明膜形成；BALF分離純化AM并培養(yǎng)，取其上清液檢測(cè)iNOS含量及AM中iNOS蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)PQ中毒發(fā)生后AM中iNOS的含量及蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，并隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增強(qiáng)，給予DAS干預(yù)治療后，治療組iNOS蛋白表達(dá)及含量顯著降低；因氧化應(yīng)激在急性肺損傷中占有重要地位［14］，DAS通過(guò)增加谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、谷胱甘肽還原酶和過(guò)氧化氫酶的活性等途徑達(dá)到抑制氧化損傷的作用［15］。由于該物質(zhì)是大蒜中提取的一種化合物，通過(guò)抑制氧化損傷來(lái)阻斷肺損傷的進(jìn)一步加重，從而改善肺功能，糾正大鼠低氧血癥。而中毒者多為從事農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的勞動(dòng)者，距離醫(yī)院相對(duì)較遠(yuǎn)。本研究結(jié)果提示，當(dāng)患者PQ中毒后，盡快口服一定量的大蒜，進(jìn)行第一時(shí)間的抗炎及抗氧化治療，為后期就醫(yī)挽救生命提供機(jī)會(huì)。也可通過(guò)提純后獲得制劑直接進(jìn)行呼吸道霧化，使DAS直接作用于肺部抑制氧自由基釋放及iNOS蛋白表達(dá)，下調(diào)NO含量來(lái)減輕肺部氧化損傷，抑制或逆轉(zhuǎn)肺纖維化的形成。本研究不足之處，用細(xì)胞免疫化學(xué)方法對(duì)AM中iNOS進(jìn)行半定量分析，使得切片能長(zhǎng)期保存、反復(fù)觀察。但酶與抗體形成的共價(jià)鍵，可損害抗體和酶的活性，易產(chǎn)生非特異染色。故細(xì)胞免疫化學(xué)方法中存在的不足，通過(guò)取上清液用分光光度計(jì)檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)iNOS水平以彌補(bǔ)細(xì)胞免疫化學(xué)方法的不足，該方法穩(wěn)定性好，可重復(fù)性強(qiáng)。該研究與Kalayarasan等［16］研究博來(lái)霉素引起肺纖維化結(jié)論相符。

綜上所述，PQ中毒后患者隨劑量及中毒時(shí)間的不同而有不同預(yù)后，現(xiàn)尚無(wú)確切的治療手段，死亡率高。DAS為大蒜中提取的化合物，已有大量實(shí)驗(yàn)證明其具有抗炎抗氧化損傷作用。因此，DAS抗氧化作用并非偶然現(xiàn)象，但迄今仍無(wú)DAS能用于PQ中毒所致肺損傷方面研究，下一步需要進(jìn)行更深入的定量研究和臨床研究。如將DAS制造為噴霧劑，進(jìn)行霧化吸入，直接作用于肺部，以減輕肺氧化損傷及抑制肺纖維化進(jìn)程。為降低PQ中毒患者死亡率，提高治愈率尋找新路徑。

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Antioxidanteffectofdiallylsulfide on acute lung injury in rats with paraquat poisoning

CAO Yu-fang1，WANG Hong-wu1，SU Xing1，HOU Yu1，GUAN Jun1，XIE Bing1，YU Yan-mei1，WANG Lian-ou1，CHENG Ying-bing1，HAN Yan-li1，QIU Ping2，SONG Wei3
（1.Department of Critical Care Medicine，2.Department of Nephrology，Haikou Municipal People′s Hospital，Haikou 570208，China；3.Department of Emergency Medicine，Hainan Provincial People′s Hospital，Haikou 570102，China）

OBJECTIVE To investigate the effect of diallyl sulfide（DAS）in protection against acute lung injury in rats induced by paraquat（PQ）.METHODS A total of 100 male Wistar rats were randomly divided into normalcontrolgroup，PQ 70 mg·kg-1modelgroup，and DAS 25，50 and 100 mg·kg-1treatmentgroups，with 20 rats in each group.A poisoning modelwas estalolished after administration ig ata single dose of PQ 70 mg·kg-1，while the normalcontrolgroup was ip given the same volume ofnormal saline.DAS 25，50 and 100 mg·kg-1was intraperitoneally injected 30 min before and after PQ exposure. Five rats in each group were sacrificed at 1，3，6 and 12 h，respectively.The inferior lobe ofthe right lung was observed by HE staining under an opticalmicroscope.Tissue of the upper lobe of the right lung was used to detect the content of nitric oxide（NO）.Alveolar macrophages（AMs）were collected and cultured for 24 h，and the contentofnitric oxide synthase（iNOS）in the supernatantwas detected.AMs were cultured for 72 h and the expression of iNOS protein in AMs was detected by immunocytochemistry method.RESULTS Compared with normalcontrolgroup，the alveolar structure of PQ group was severely damaged and the pathologicalscore was significantly increased（P＜0.01）. The NO contentof PQ group was significantly higher than in normalcontrolgroup（P＜0.01）.The content and protein expression ofiNOS were significantly increased in PQ group（P＜0.01）.Compared with PQ group，the lung injury score ofrats in DAS 50 mg·kg-1group at3，6 and 12 h and in the DAS 100 mg·kg-1group at each time point was decreased（P＜0.05）.Compared with PQ group，the NO content of DAS 25 and 50 mg·kg-1group was decreased（P＜0.05），and the NO content of DAS 100 mg·kg-1group was significantly reduced（P＜0.01）.The content of iNOS was reduced in DAS 100 mg·kg-1group（P＜0.05）.Compared with PQ group，the expression of iNOS protein in DAS groups was decreased（P＜0.05）.CONCLUSION DAS can inhibitthe oxidative damage in rats induced by PQ.

paraquat；nitric oxide；inducible nitric oxide synthase；acute lung injury；diallylsulfide

The projectsupported by NaturalScience Foundation of Hainan Province（310143）

QIU Ping，Tel：13807565230，E-mail：hksn@163.com；SONG Wei，Tel：13005019731，E-mail：swhn1212@aliyun.com

R285.5

A

1000-3002-（2016）05-0526-06

10.3867/j.issn.1000-3002.2016.05.007

2015-07-24接受日期：2016-04-15）

（本文編輯：賀云霞）

海南省自然科學(xué)基金（310143）

曹玉芳，女，博士研究生，主要從事百草枯中毒研究，E-mail：cyf12636@163.com

邱平，Tel：13807565230，E-mail：hksn@163.com；宋維，Tel：13005019731，E-mail：swhn1212@aliyun.com