擬南芥Patellin 2相互作用蛋白的篩選及鑒定

李 瓊，王學(xué)路，2，蘇 偉

(1. 復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 植物科學(xué)研究所，上海 200438；2. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，武漢 430070)

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擬南芥Patellin 2相互作用蛋白的篩選及鑒定

李 瓊1，王學(xué)路1，2，蘇 偉1

(1. 復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 植物科學(xué)研究所，上海 200438；2. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，武漢 430070)

Patellin 2(PATL2)蛋白是具有SEC14蛋白結(jié)構(gòu)域的脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白，定位于細(xì)胞分裂后期的細(xì)胞板上，在細(xì)胞分裂過程中發(fā)揮重要的作用.同時(shí)，PATL2蛋白還受到植物激素和環(huán)境變化的調(diào)控，說明PATL2可能在植物激素和環(huán)境變化的調(diào)控下參與細(xì)胞分裂過程.為了深入了解PATL2蛋白的生物學(xué)功能，研究PATL2蛋白發(fā)揮作用的分子生物學(xué)機(jī)制，我們分析了它在植物體內(nèi)的表達(dá)特點(diǎn)和與之相互作用的蛋白.我們通過免疫共沉淀與液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)分析了過表達(dá)PATL2的轉(zhuǎn)基因植株，并獲得了多個(gè)可能與PATL2相互作用的蛋白，其中一個(gè)是細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶CDKB2；2.通過觀察PATL2啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS報(bào)告基因在植物中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)PATL2基因在葉片、花瓣、花粉中廣泛表達(dá)，但在角果中的表達(dá)非常有限，僅存在于角果的兩端，這與已報(bào)道的CDKB2；2的組織分布部分相同.同時(shí)，煙草葉表皮細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)結(jié)果表明PATL2和CDKB2；2能夠共定位于煙草葉表皮細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中.體外pull-down實(shí)驗(yàn)和雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)(BiFC)實(shí)驗(yàn)分別確定了PATL2和CDKB2；2在植物體外和植物體內(nèi)的相互作用.

Patellin 2； CDKB2；2； 蛋白質(zhì)相互作用

擬南芥Patellins蛋白是一類含有SEC14蛋白結(jié)構(gòu)域的、具有脂質(zhì)轉(zhuǎn)移活性的蛋白，因定位于分裂細(xì)胞的細(xì)胞板上而得名[1].擬南芥中共有6個(gè)Patellins蛋白，依次命名為Patellin 1(PATL1)～Patellin 6(PATL6).PATLs蛋白具有潛在的轉(zhuǎn)移脂質(zhì)的能力，可能在生物膜運(yùn)輸?shù)冗^程中發(fā)揮功能[1].擬南芥PATL1蛋白是一個(gè)外周膜蛋白，它能夠與PtdIns(5)P，PtdIns(4，5)P2和PtdIns(3)P[1]結(jié)合.并且，PATL3和PATL6定位于煙草葉表皮細(xì)胞的細(xì)胞膜，參與植物對(duì)病毒的防御[2].

Patellins蛋白家族成員由不保守的N端、SEC14結(jié)構(gòu)域和GOLD結(jié)構(gòu)域(Golgi dynamics domain)3部分構(gòu)成[1].其中，SEC14結(jié)構(gòu)域在進(jìn)化上最為保守，廣泛存在于植物、酵母、無脊椎動(dòng)物和哺乳動(dòng)物中[3].SEC14結(jié)構(gòu)域可以與不同類型的脂類結(jié)合并在脂質(zhì)代謝、生物膜運(yùn)輸?shù)冗^程中發(fā)揮作用[3-8].同時(shí)，SEC14結(jié)構(gòu)域也可與其他蛋白結(jié)構(gòu)域組合，形成超家族，僅在擬南芥中就存在31個(gè)Sec14p相關(guān)蛋白[9-12].GOLD結(jié)構(gòu)域存在于一系列參與高爾基體囊泡運(yùn)輸?shù)牡鞍字衃13].擬南芥PATLs蛋白是SEC14結(jié)構(gòu)域蛋白家族的重要成員之一.遺傳學(xué)分析PATLs多突變體表明，PATLs家族成員均參與調(diào)控植物胚根原的細(xì)胞分裂[14].在胞質(zhì)分裂過程中，PATL1和PATL2被招募到正在擴(kuò)張和成熟的細(xì)胞板的成膜體上[1，14].PATLs蛋白參與調(diào)控植物特有的胞質(zhì)分裂過程.PATL2蛋白還受到外界環(huán)境和激素的調(diào)控[15-17]，說明PATL2可能在植物激素和環(huán)境變化的調(diào)控下參與細(xì)胞分裂過程.但是PATL2的調(diào)節(jié)因子和底物尚不清楚，PATL2在環(huán)境和激素信號(hào)調(diào)控下的細(xì)胞分裂過程中的作用機(jī)制也不可知.此時(shí)，篩選PATL2互作蛋白、探究PATL2在環(huán)境和激素信號(hào)調(diào)節(jié)下的細(xì)胞分裂過程中的分子生物學(xué)功能顯得尤為重要.

在真核生物的細(xì)胞分裂過程中，細(xì)胞周期蛋白(cyclins)是一類依賴細(xì)胞分裂周期性特異表達(dá)的蛋白質(zhì)，它們與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(Cyclin-Dependent Kinases， CDKs)共同調(diào)控細(xì)胞周期的運(yùn)行[18-19].細(xì)胞周期蛋白與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶結(jié)合并將之激活[18-19].CDKs和細(xì)胞周期蛋白都由龐大的基因家族構(gòu)成，而且它們能夠形成種類繁多的復(fù)合體，不同的復(fù)合體在細(xì)胞分裂的不同時(shí)期和不同位置發(fā)揮不同的功能，確保細(xì)胞分裂的正常進(jìn)行[18-19].CDKs與細(xì)胞周期蛋白復(fù)合體作用的底物包括轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子、細(xì)胞骨架、核基質(zhì)、核膜蛋白等一系列細(xì)胞分裂相關(guān)蛋白[18-19].

植物CDKs被分為7類[20-22]，從CDKA到CDKG.其中，CDKA家族成員最多，它含有PSTAIRE基序，與酵母Sc；CDC28、Sc；CDC2和人類CDK1、CDK2、CDK3最相似.CDKA可以互補(bǔ)酵母突變體cdc2/cdc28表型的植物CDKs，它們調(diào)控細(xì)胞分裂G1/S期和G2/M期[19].CDKC和CDKE的成員很少、分別含有PITAIRE基序和SPTAIRE基序，能夠磷酸化RNA聚合酶Ⅱ的C端，進(jìn)而調(diào)控轉(zhuǎn)錄[19，23].CDKD和CDKF是植物的CAK(CDK-activating kinases)，具有磷酸化并激活CDK的酶活性[24-26].CDKG參與調(diào)節(jié)花粉細(xì)胞壁胼胝質(zhì)體的合成和雄性減數(shù)分裂[22，27].CDKB是一類植物特有的CDK，被分為兩個(gè)亞類：CDKB1和CDKB2.擬南芥中這兩個(gè)亞類分別包含兩個(gè)基因：CDKB1；1和CDKB1；2、CDKB2；1和CDKB2；2.它們的轉(zhuǎn)錄嚴(yán)格依賴細(xì)胞分裂，僅在細(xì)胞分裂的G2/M期轉(zhuǎn)錄[19-20，28-29].其中，CDKB2；2參與調(diào)控莖尖分生組織的細(xì)胞分裂[30]，并且在花中呈現(xiàn)一定程度的高豐度表達(dá)[30-31].

本研究為了尋找PATL2蛋白的互作蛋白，通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)找到PATL2的互作蛋白CDKB2；2.組織化學(xué)GUS染色和煙草瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)說明了兩個(gè)蛋白相互作用的生物學(xué)基礎(chǔ).雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)(BiFC)和體外pull-down實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了PATL2與CDKB2；2的相互作用，研究結(jié)果為深入研究PATLs家族蛋白在細(xì)胞分裂過程中的遺傳功能奠定了分子基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

擬南芥(Arabidopsisthaliana)Col-0和35S∶∶PATL2-FLAG：Col-0.野生煙草Nicotianabenthamiana.大腸桿菌克隆菌株EscherichiacoliDH5α，表達(dá)菌株EscherichiacoliTransetta.根瘤農(nóng)桿菌菌株AgrobacteriumtumefaciensGV3101.植物表達(dá)載體pCAMBIA-1302E(pCAMBIA-1302改造，GFP標(biāo)簽)、pCAMBIA-mCherry、pCAMBIA-1306(Flag標(biāo)簽)和pCAMBIA-1391Z(GUS報(bào)告基因).煙草瞬時(shí)表達(dá)載體pXY104(cYFP)、pXY106(nYFP).大腸桿菌表達(dá)載體pMAL-c2X(MBP標(biāo)簽)和pET-28a(His-tag).這些材料均由本實(shí)驗(yàn)室保存.

植物生長(zhǎng)培養(yǎng)基(1/2MS培養(yǎng)基)：2.2g/L MS粉、0.8%瓊脂粉、pH5.6～6.0，向其中添加700μL/L潮霉素用于抗性篩選.大腸桿菌和根癌農(nóng)桿菌完全培養(yǎng)基LB：1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%氯化鈉，向其中添加抗生素進(jìn)行篩選，抗生素濃度分別為：卡那霉素100μg/mL、氨芐青霉素100μg/mL、慶大霉素50μg/mL、利福平25μg/mL，液體培養(yǎng)基中加入1%瓊脂粉即配制成相應(yīng)的固體培養(yǎng)基.限制性內(nèi)切酶購于TaKaRa或NEB公司.T4DNA連接酶購于TaKaRa公司.

1.2 方法

1.2.1 植物材料和生長(zhǎng)條件

將干燥的擬南芥種子用75%酒精表面消毒20min(共兩次，每次10min)后，100%酒精超凈臺(tái)消毒并播種于植物生長(zhǎng)培養(yǎng)基上.播種的培養(yǎng)基置于4℃冰箱處理3d后，放于擬南芥專用恒溫光照培養(yǎng)箱(Percival)內(nèi)生長(zhǎng)，培養(yǎng)條件為23℃、16h光照/8h黑暗.本研究中，用于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)的植物材料為在該條件下培養(yǎng)12d的植物幼苗.

人工氣候室內(nèi)23℃、16h光照/8h黑暗條件下將煙草種子播種于土中，生長(zhǎng)7d后移苗，單穴單株培養(yǎng)，培養(yǎng)條件不變.

1.2.2 免疫共沉淀和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

稱取3g生長(zhǎng)12d的35S∶∶PATL2-FLAG：Col-0幼苗，吸水紙吸干、液氮研磨后，加入2倍等體積植物蛋白提取液和1/100植物蛋白酶抑制劑，震蕩混勻，4℃結(jié)合1h.然后4℃低溫離心獲取上清液，并加入預(yù)處理的Flag樹脂(購于Sigma公司)，再次4℃結(jié)合3h.隨后洗滌5次.獲取的沉淀加入等體積的SDS上樣緩沖液，95℃變性10min后，SDS-PAGE電泳.最后切膠送樣至復(fù)旦大學(xué)遺傳工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室生物化學(xué)平臺(tái)進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析.

PC機(jī)上還可以提供比智能手機(jī)豐富的控制功能和更人性化的人機(jī)界面，通過Internet訪問農(nóng)產(chǎn)品服務(wù)器上的視頻信息：一方面可以實(shí)時(shí)監(jiān)控農(nóng)產(chǎn)品長(zhǎng)勢(shì)與營(yíng)養(yǎng)需求，提供及時(shí)決策；另一方面可供農(nóng)業(yè)專家系統(tǒng)對(duì)自然災(zāi)害防御，農(nóng)作物病蟲害分析，農(nóng)產(chǎn)品后期可視化溯源提供依據(jù)。

1.2.3 組織化學(xué)GUS染色

分析擬南芥基因組(www.Arabidopsis.org)獲得PATL2基因編碼區(qū)上游1.5kb啟動(dòng)子序列信息，通過PCR擴(kuò)增并構(gòu)建于含有GUS基因的pCAMBIA-1391Z載體上.獲得轉(zhuǎn)基因純合植株后，選取不同時(shí)期的植物材料，放入GUS染液中，在37℃黑暗條件下染色2h，逐次用50%酒精、75%酒精和100%酒精脫色至植物材料褪綠.在100%的酒精中保存，用Leica DFC290體視顯微鏡拍照.

1.2.4 煙草共定位及雙分子熒光互補(bǔ)(BiFC)實(shí)驗(yàn)

將所構(gòu)建的植物表達(dá)載體PATL2-mCherry、PATL2-GFP、PATL2-cYFP、nYFP-CDKB2；2等轉(zhuǎn)化進(jìn)入根癌農(nóng)桿菌GV3101(慶大霉素抗性和利福平抗性).固體培養(yǎng)基在28℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)生長(zhǎng)2d后，挑菌，液體培養(yǎng)基28℃、200r/min過夜擴(kuò)大培養(yǎng).用50mL塑料管收集菌液，離心獲得菌體沉淀.將菌體沉淀重懸于煙草轉(zhuǎn)化緩沖液中，并調(diào)至OD600=1.重懸的根癌農(nóng)桿菌注射于適齡煙草葉片背面，暗處生長(zhǎng)1d、光照條件下生長(zhǎng)2d后，用Leica SP8激光共聚焦顯微鏡觀察對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)的熒光信號(hào).DAPI染色時(shí)，將煙草葉片切片置于 2μg/mL 的DAPI工作液中染色30～50min，Leica SP8激光共聚焦顯微鏡觀察 405nm 波長(zhǎng)激發(fā)光下收到的熒光信號(hào).

1.2.5 重組蛋白的表達(dá)及純化

大腸桿菌表達(dá)載體轉(zhuǎn)入E.coliTransetta中，挑菌，37℃過夜培養(yǎng)，然后于37℃、200r/min擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600=1.加入0.4mmol/L IPTG、25℃誘導(dǎo)過夜.收集菌液，12000g離心10min，收集沉淀，并重懸于10mL的蛋白結(jié)合緩沖液中，加入溶菌酶至終濃度為1mg/mL，混勻，冰上放置 30min.超聲裂解菌體后，在上清液中加入250μL預(yù)處理過的MBP樹脂(購于New England公司)或His樹脂(購于TaKaRa旗下Clontech公司)，4℃結(jié)合2h，然后使用蛋白結(jié)合緩沖液洗滌5次，最后使用蛋白洗脫緩沖液將重組蛋白洗脫收集.SDS-PAGE電泳檢測(cè)重組蛋白的大小和純化量.

1.2.6 體外pull-down實(shí)驗(yàn)

將等量的MBP-PATL2重組蛋白和MBP蛋白分別與預(yù)處理過的MBP樹脂相結(jié)合，接著加入His-CDKB2；2蛋白，4℃孵育2h.用蛋白緩沖液洗滌5次后，在樹脂中加入等量的蛋白上樣緩沖液，95℃變性10min后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，并分別用MBP抗體和His抗體進(jìn)行Western blot分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 PATL2互作蛋白CDKB2；2的發(fā)現(xiàn)

為了研究PATLs蛋白的生物學(xué)功能和發(fā)揮作用的分子機(jī)制，我們首先獲得了PATL2的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株35S∶∶PATL2-FlAG：Col-0，使用FLAG樹脂在擬南芥細(xì)胞中沉淀出與PATL2相結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合體，并將復(fù)合體進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)測(cè)定(圖1).通過分析獲得的肽段信息，我們發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)特異肽段qAIFAGDSELQQLLR和QAGQNIPQNTVK，它們都屬于一個(gè)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶CDKB2；2，這說明在擬南芥中PATL2可能與CDKB2；2相互作用，并與之一起發(fā)揮一定的生物學(xué)功能.

2.2 組織化學(xué)方法分析PATL2在擬南芥的組織分布

CDKB2；2在莖頂端分生組織(SAM)的細(xì)胞分裂中發(fā)揮作用，并且在花中也有一定程度的富集表達(dá)[30-31].為了研究PATL2與CDKB2；2是否具有共同的組織分布，我們構(gòu)建了PATL2啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS報(bào)告基因載體pPATL2∶∶GUS.獲得轉(zhuǎn)基因純合植株后，分別對(duì)幼苗和成體植株的各個(gè)組織器官進(jìn)行染色分析.如圖2所示，PATL2在植物的各個(gè)營(yíng)養(yǎng)器官和生殖器官中廣泛表達(dá).對(duì)在長(zhǎng)日照培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)6d的擬南芥幼苗進(jìn)行的染色分析表明，PATL2在植物的莖尖分生組織和子葉中都有表達(dá)(圖2(a))，在擬南芥的下胚軸、根以及真葉中也有能檢測(cè)到PATL2的表達(dá)(圖2(b)～(d)).角果和花中雖然能夠檢測(cè)到PATL2的表達(dá)(圖2(e)～(h))，但是PATL2的表達(dá)主要集中在角果的兩端、花藥、柱頭和萼片上(圖2(f)～(h)).這些結(jié)果說明PATL2與CDKB2；2在莖頂端分生組織和花上具有相似的組織分布，這為PATL2和CDKB2；2的相互作用提供了組織水平上的可能性.

2.3 PATL2和CDKB2；2共定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)

TAIR網(wǎng)站(http：∥www.Arabidopsis.org/)的GO(Gene Ontology)預(yù)測(cè)分析表明：CDKB2；2可能定位于細(xì)胞核，PATL2位于細(xì)胞膜和葉綠體中.而SUBA網(wǎng)站(http：∥suba.plantenergy.uwa.edu.au/)則預(yù)測(cè)CDKB2；2和PATL2均廣泛定位于細(xì)胞質(zhì)中.為了分析探究PATL2和CDKB2；2在植物細(xì)胞內(nèi)真正的亞細(xì)胞定位，我們?cè)跓煵荼砥ぜ?xì)胞中分別瞬時(shí)表達(dá)PATL2-mCherry和CDKB2；2-GFP融合蛋白，并通過Leica SP8激光共聚焦顯微鏡的三維分層掃描技術(shù)(3D)進(jìn)行分析和呈現(xiàn).在本實(shí)驗(yàn)中，我們使用DAPI染料標(biāo)記細(xì)胞核的位置.如圖3(見第618頁)所示，PATL2定位于細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)，但是在細(xì)胞核中沒有表達(dá)，而是分布在細(xì)胞核周圍(圖3(a)).與GFP融合表達(dá)的CDKB2；2不僅定位于細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核周圍，而且CDKB2；2信號(hào)與DAPI染色重疊，說明CDKB2；2還定位于細(xì)胞核中(圖3(b)).這些結(jié)果說明除細(xì)胞核以外，PATL2和CDKB2；2在細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)以及細(xì)胞核周圍均有分布.

為了進(jìn)一步探究PATL2與CDKB2；2是否在細(xì)胞中具有共同的亞細(xì)胞定位，我們?cè)谕粺煵萑~片中同時(shí)表達(dá)PATL2-mCherry和CDKB2；2-GFP.如圖4所示，由于圖像獲得技術(shù)與3D圖像不同，2D圖像的細(xì)胞質(zhì)信號(hào)和細(xì)胞核信號(hào)看起來比3D圖像的弱.PATL2-mCherry的紅色熒光信號(hào)和CDKB2；2-GFP的綠色熒光信號(hào)在細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)以及細(xì)胞核周圍重疊為黃色(圖4)，說明PATL2和CDKB2；2在細(xì)胞水平上共同定位于細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)以及細(xì)胞核周圍，這為PATL2和CDKB2；2的相互作用提供了細(xì)胞水平上的可能性.

2.4 PATL2和CDKB2；2在植物體外直接相互作用

為了探究PATL2是否與CDKB2；2直接相互作用，我們首先在大腸桿菌表達(dá)菌株中表達(dá)純化重組蛋白MBP-PATL2和His-CDKB2；2，同時(shí)表達(dá)純化MBP標(biāo)簽蛋白作為對(duì)照.通過體外pull-down實(shí)驗(yàn)和Western blot檢測(cè)PATL2與CDKB2；2的相互作用：使用MBP抗體檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組MBP-PATL2和對(duì)照組MBP的用量，使用His-tag抗體檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組His-CDKB2；2的信號(hào).如圖5所示，MBP抗體檢測(cè)到實(shí)驗(yàn)組MBP-PATL2與對(duì)照組MBP的用量相同；His-tag抗體檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組有較強(qiáng)的雜交信號(hào)，而對(duì)照組無雜交信號(hào).His-tag抗體檢測(cè)的Input的雜交信號(hào)位置與實(shí)驗(yàn)組信號(hào)位置一致，說明實(shí)驗(yàn)組的蛋白質(zhì)條帶確實(shí)代表了His-CDKB2；2蛋白(圖5).體外pull-down實(shí)驗(yàn)證實(shí)了PATL2和CDKB2；2蛋白在體外能夠直接相互作用.

2.5 PATL2和CDKB2；2在植物體內(nèi)相互作用

為了進(jìn)一步驗(yàn)證PATL2和CDKB2；2在植物體內(nèi)的相互作用，我們?cè)跓煵萑~片表皮細(xì)胞中共表達(dá)黃色熒光蛋白(YFP)C端和PATL2融合的重組蛋白PATL2-cYFP以及黃色熒光蛋白N端和CDKB2；2融合的重組蛋白CDKB2；2-nYFP，用Leica SP8激光共聚焦顯微鏡觀察黃色熒光信號(hào).如圖6所示，共轉(zhuǎn)入PATL2-cYFP和nYFP-CDKB2；2的實(shí)驗(yàn)組能夠在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中觀察到黃色熒光信號(hào)，而對(duì)照組PATL2-cYFP與nYFP、cYFP與nYFP-CDKB2；2和cYFP與nYFP共轉(zhuǎn)后不能觀察到黃色熒光信號(hào)(圖6).這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了PATL2蛋白和CDKB2；2蛋白在植物葉片細(xì)胞中的相互作用，并表明PATL2和CDKB2；2的相互作用部位與它們的亞細(xì)胞共定位相吻合，均在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)上.

3 討 論

本研究通過組織化學(xué)方法發(fā)現(xiàn)PATL2與CDKB2；2在莖頂端分生組織和花器官上具有相似的組織分布.植物的地上部分均起源于莖頂端分生組織內(nèi)的多能干細(xì)胞.植物的莖頂端分生組織內(nèi)旺盛的細(xì)胞分裂源源不斷地為植物的胚胎后期發(fā)育提供未分化的細(xì)胞源，因此植物的莖尖需要具有較高的細(xì)胞分裂活性.而植物的正在開放的花中，大量成熟花粉粒的形成也需要較高的有絲分裂和減數(shù)分裂活性.本研究的組織化學(xué)染色表明PATL2在細(xì)胞分裂活性旺盛的莖尖和花藥中均有轉(zhuǎn)錄分布，這與已報(bào)道的CDKB2；2在莖尖和正在開放的花中的富集表達(dá)相吻合[30-31].除此之外，CDKB2；2已被證實(shí)在莖尖分生組織的細(xì)胞分裂過程中發(fā)揮重要的作用[30]；PATLs蛋白家族也被報(bào)道在細(xì)胞分裂中發(fā)揮重要的功能[1].PATL2與CDKB2；2在細(xì)胞分裂旺盛組織部位的共同轉(zhuǎn)錄分布和相互作用暗示它們可能在這些區(qū)域共同調(diào)控植物的細(xì)胞分裂.

本研究通過免疫共沉淀和質(zhì)譜相結(jié)合的方法獲得了PATL2的相互作用蛋白CDKB2；2，并且它們之間的作用得到了體外pull-down和BiFC實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證.PATL1和PATL2定位于分裂細(xì)胞的細(xì)胞板上[1]，因此PATLs蛋白在細(xì)胞分裂末期，即M期可能參與細(xì)胞膜或者細(xì)胞壁的形成，進(jìn)而完成植物特有的胞質(zhì)分裂過程.而CDKBs蛋白在細(xì)胞分裂G2/M期特異表達(dá)[19-20，28-29]；對(duì)CDKB2雙突變體和過表達(dá)植株的研究表明，CDKB2缺失會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞分裂異常，莖尖分生組織細(xì)胞數(shù)目減少、細(xì)胞體積變大、細(xì)胞核變大，葉片細(xì)胞核倍性增加，說明CDKB2蛋白調(diào)控了細(xì)胞分裂由G2期到M期的轉(zhuǎn)變[30].本研究證明，調(diào)控細(xì)胞分裂G2/M期的CDKB2；2與處于細(xì)胞分裂M期的PATL2在植物體內(nèi)和體外均可以相互作用，這些結(jié)果為研究CDKB2；2在細(xì)胞分裂其他時(shí)期的作用提供了思路.事實(shí)上，一些研究表明，除細(xì)胞分裂G2/M期外，CDKB2也在細(xì)胞分裂M期和DNA損傷響應(yīng)中發(fā)揮作用[32-34].甚至，水稻中CDKB2；1的綠色熒光蛋白(GFP)并不像細(xì)胞周期蛋白B那樣在細(xì)胞分裂中期就消失，它的熒光信號(hào)一直延伸到了細(xì)胞分裂末期的細(xì)胞板上[33].綜上，在今后的研究中，我們既要探究PATL2和CDKB2；2在細(xì)胞板形成過程中的作用，也要繼續(xù)考慮CDKB2；2在細(xì)胞分裂其他時(shí)期的生物學(xué)功能.

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Identification and Validation of the Interaction between Patellin 2 and CDKB2；2 inArabidopsisthaliana

LI Qiong1， WANG Xuelu1，2， SU Wei1

(1. Institute of Plant Biology， School of Life Sciences， Fudan University， Shanghai 200438， China；2.CollegeofLifeScienceandTechnology，HuazhongAgriculturalUniversity，Wuhan430070，China)

TheArabidopsisPatellin 2(PATL2) protein is a lipid transfer protein with SEC14 domain and participates in plant cell division given its location at the cell plate. Meanwhile， PATL2 is subjected to phytohormone and environment which may indicate its role in cell division under phytohormone regulation and environment fluctuation.To further study the function of PATL2， we analyzed its expression pattern and screened Patellin 2-interacting proteins using immunoprecipitation and liquid chromatography-tandem mass spectrometry(LC-MS/MS). Several Patellin 2-interacting proteins including cell division associated kinase CDKB2;2 were detected. Simultaneously histochemical staining results showed that PATL2 widely transcribes in leaves， petals， pollens and at the terminals of siliques， which demonstrates similar distribution with CDKB2；2. PATL2 and CDKB2;2 co-localize on the plasma membrane and in the cytoplasm in tobacco epidermal cells. Pull-down assay showed that PATL2 directly interacts with CDKB2;2invitro， and bimolecular fluorescence complementation(BiFC) experiment further demonstrated theirinvivointeraction.

Patellin 2； CDKB2；2； protein interaction

0427-7104(2016)05-0614-09

2016-02-19

國(guó)家自然科學(xué)基金(31371231)

李 瓊(1990—)，女，碩士研究生；蘇 偉，女，副教授，通訊聯(lián)系人，E-mail：weisu@fudan.edu.cn

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