結(jié)核分枝桿菌ClpX與人UBC9蛋白的相互作用抑制宿主細(xì)胞增殖

王亞倩，石 超，霍克克

(復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 遺傳工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200438)

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結(jié)核分枝桿菌ClpX與人UBC9蛋白的相互作用抑制宿主細(xì)胞增殖

王亞倩，石 超，霍克克

(復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 遺傳工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200438)

ClpX是原核生物中高度保守的基因，其編碼絲氨酸蛋白酶ClpXP的ATP結(jié)合亞基，具有底物識(shí)別及ATP水解活性.ClpX參與調(diào)控細(xì)胞周期與應(yīng)激反應(yīng)，且為多種病原微生物致病所必需，但目前相關(guān)研究仍非常有限.為了探索結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)ClpX在感染宿主細(xì)胞過(guò)程中的作用機(jī)制，本文首先通過(guò)酵母雙雜交技術(shù)在人類淋巴細(xì)胞cDNA文庫(kù)中篩選得到了一個(gè)新的與結(jié)核ClpX相互作用的蛋白UBC9，并利用GST pull-down和Co-IP技術(shù)證實(shí)了這兩個(gè)蛋白在體外和體內(nèi)相互作用的特異性.將ClpX轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞過(guò)表達(dá)，RNA干擾與回復(fù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了ClpX蛋白能夠通過(guò)與UBC9的相互作用抑制宿主細(xì)胞的增殖.

結(jié)核分枝桿菌； ClpX； UBC9； 蛋白質(zhì)相互作用； 細(xì)胞增殖

結(jié)核病(Tuberculosis)，作為全世界最致命的疾病之一，嚴(yán)重威脅人類健康.世界衛(wèi)生組織(WHO)最新數(shù)據(jù)顯示，僅2013年就有超過(guò)900萬(wàn)人發(fā)病，其中150萬(wàn)人死亡.結(jié)核病因結(jié)核分枝桿菌(以下簡(jiǎn)稱結(jié)核桿菌)感染發(fā)生，據(jù)估算，全球現(xiàn)有超過(guò)6億人感染結(jié)核桿菌，其中約10%最終發(fā)展為結(jié)核病[1].結(jié)核桿菌與宿主免疫系統(tǒng)間的交互最終決定感染者發(fā)病與否：一方面，結(jié)核桿菌通過(guò)減緩生長(zhǎng)速度，降低物質(zhì)和能量需求，以藏匿于宿主體內(nèi)；或作用于宿主，減弱甚至抑制宿主細(xì)胞對(duì)它的殺傷.另一方面，宿主也激發(fā)免疫機(jī)制反作用于結(jié)核桿菌，譬如通過(guò)溶酶體殺滅、凋亡感染了結(jié)核桿菌的細(xì)胞，或呈遞結(jié)核桿菌抗原特異性的T細(xì)胞，促進(jìn)機(jī)體對(duì)結(jié)核桿菌的特異性清除[2].

蛋白酶對(duì)于結(jié)核桿菌的致病性和對(duì)巨噬細(xì)胞中的脅迫耐受有著至關(guān)重要的作用[3].結(jié)核桿菌ClpX(ClpX， Rv2457c)屬于AAA+ATP酶家族，具有底物識(shí)別以及ATP水解活性，可特異性地識(shí)別并解聚或重塑靶蛋白；也可與具蛋白水解酶活性的ClpP結(jié)合形成ClpXP異源二聚體，特異性地降解目的蛋白[4-7].ClpX是結(jié)核桿菌存活與致病所必需，感染宿主后，ClpX下調(diào)自身細(xì)胞分裂蛋白FtsZ的活性，參與調(diào)控結(jié)核桿菌自身的細(xì)胞分裂[8]].此外，作為細(xì)胞膜組分[9-11]，ClpX也可能參與結(jié)核桿菌與宿主的免疫互作，有潛力成為評(píng)定結(jié)核桿菌毒力的優(yōu)良靶標(biāo).

我們的前期研究中發(fā)現(xiàn)結(jié)核桿菌來(lái)源的ClpX具有抑制宿主細(xì)胞增殖的能力，并且利用酵母雙雜交技術(shù)，在人cDNA文庫(kù)中篩選到一個(gè)能與ClpX直接相互作用的蛋白——UBC9(UBE2I，NM_003345.4，GI：342307071).在本文中，我們將借助分子和細(xì)胞生物學(xué)方法，嘗試評(píng)估ClpX對(duì)細(xì)胞增殖的影響，并探討其作用于宿主的遺傳調(diào)控機(jī)理.

1 材料與方法

1.1 材料

SfiⅠ限制性內(nèi)切酶、dNTP Mix購(gòu)自TaKaRa公司.FastPfu和Taq酶購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司.Ligation High Kit購(gòu)自TOYOBO公司.Agarose為Biowest公司產(chǎn)品.TRYPTONE，YEAST EXTRACT購(gòu)自O(shè)xoid公司.Bacto-Agar、Yeast Nitrogen Base購(gòu)自BD公司.氨基酸混合物Dropout、鮭魚精ssDNA購(gòu)自北京博大泰克公司.X-gal、Triton X-100，HEPES，Nodient P-40，IPTG，Tween-20均購(gòu)自于Amresco公司.氨基-1，2，4-三唑(3-AT)、PEG3350、鼠抗Myc、Flag、GST、6His的單克隆抗體和巰基乙醇，以及FACS流式細(xì)胞術(shù)染色試劑碘化丙錠(PI)均購(gòu)自Sigma & Aldrich公司.

GAL4酵母雙雜交系統(tǒng)和酵母雙雜交人淋巴細(xì)胞cDNA文庫(kù)購(gòu)自Clontech公司.質(zhì)粒抽提試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自AXYGEN公司.酵母質(zhì)粒抽提試劑盒、細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM、胎牛血清和胰酶Trypsin-EDTA(0.25%)購(gòu)自上海索萊寶生物科技有限公司.Lipofectamine 2000脂質(zhì)體購(gòu)自Invitrogen公司.一次性細(xì)胞培養(yǎng)皿購(gòu)自Corning.PVDF膜、化學(xué)發(fā)光底物檢測(cè)試劑(ImmobilonTMWestern Chemiluminescent HRP Substrate， Cat. No. WBKLS0100)均購(gòu)自Millipore公司.厚濾紙購(gòu)自Biorad公司.蛋白酶抑制劑(protease inhibitor cocktail tables， complete EDTA-free)購(gòu)自Roche.Protein G beads購(gòu)自GE公司.Glutathione Sepharose 4B購(gòu)自于Pharmacia Biotech公司.鼠抗GAPDH的單克隆抗體購(gòu)自Abmart公司.HRP交聯(lián)的兔抗鼠二抗購(gòu)自Rockland公司.X光片為Kodak公司產(chǎn)品.蛋白預(yù)染分子量標(biāo)準(zhǔn)為Thermo Scientific公司產(chǎn)品.雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)試劑盒是Promega公司產(chǎn)品.其他實(shí)驗(yàn)所用試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純.表1為實(shí)驗(yàn)中所用引物列表.

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

HEK293T細(xì)胞在DMEM+10% FBS培養(yǎng)液中培養(yǎng).每隔2～3d換一次新鮮培養(yǎng)液.當(dāng)細(xì)胞的鋪滿率達(dá)到70%以上后，用0.25%胰酶消化，傳代繼續(xù)培養(yǎng).

細(xì)胞的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染：細(xì)胞計(jì)數(shù)后接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)，培養(yǎng)18～24h.當(dāng)細(xì)胞的鋪滿率達(dá)到70%后，用Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，37℃，5% CO2培養(yǎng)24～72h收細(xì)胞.

1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期

該實(shí)驗(yàn)每一實(shí)驗(yàn)組均設(shè)置3個(gè)重復(fù)，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，每個(gè)樣品檢測(cè)細(xì)胞數(shù)目約為10000個(gè).為防止實(shí)驗(yàn)時(shí)產(chǎn)生大量的細(xì)胞碎片，所有細(xì)胞經(jīng)0.25%胰酶消化并輕輕吹打，使之成為單細(xì)胞，離心收集細(xì)胞，用PBS(1.38mmol/L NaCl，0.027mmol/L KCl，0.01mmol/L Na2HPO4，0.018mmol/L KH2PO4，pH 7.4)清洗一遍，加入預(yù)冷的70%乙醇固定細(xì)胞，用0.1% FCS的PBS洗滌3次，用1mL含20μg/mL PI的PBS重懸細(xì)胞，室溫避光放置20min，500目(28μm)篩過(guò)濾至流式管中，標(biāo)記，流式細(xì)胞儀(BD FACS Calibur)檢測(cè)細(xì)胞DNA情況，F(xiàn)lowjo 7.6軟件分析細(xì)胞周期.

1.4 酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)

構(gòu)建誘餌質(zhì)粒pGBKT7-ClpX并轉(zhuǎn)化入酵母受體菌AH109，經(jīng)對(duì)酵母轉(zhuǎn)化子檢測(cè)無(wú)自激活反應(yīng)后，將其制備成酵母轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞.用化學(xué)轉(zhuǎn)化方法將pACT2-淋巴細(xì)胞cDNA文庫(kù)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入已含有誘餌質(zhì)粒的酵母感受態(tài)細(xì)胞，涂布SD-Leu-Trp-His+5 mM 3AT(SD-3)平板，30℃培養(yǎng)2～3d，用無(wú)菌絨布對(duì)SD-3平板上長(zhǎng)出的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行影印清除后，繼續(xù)培養(yǎng)至陽(yáng)性菌落長(zhǎng)出.將陽(yáng)性菌落分別轉(zhuǎn)接到SD-Leu-Trp(SD-2)和SD-Leu-Trp-His-Ade(SD-4)平板上進(jìn)行培養(yǎng)，以檢測(cè)HIS3和ADE2報(bào)告基因是否被激活.同時(shí)將陽(yáng)性菌落接種于后濾紙上，液氮冷凍處理后將濾紙放入含有X-Gal的Z Buffer中檢測(cè)LacZ報(bào)告基因的激活情況.挑取能同時(shí)激活HIS3、ADE2和LacZ3個(gè)報(bào)告基因的陽(yáng)性菌落，抽提酵母陽(yáng)性克隆質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化大腸桿菌擴(kuò)增，對(duì)陽(yáng)性克隆質(zhì)粒DNA測(cè)序及BLAST分析.最后將篩選到的陽(yáng)性克隆質(zhì)粒與誘餌質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞，再次檢測(cè)對(duì)上述3個(gè)報(bào)告基因的激活情況，以確認(rèn)兩者的蛋白相互作用.

1.5 GST pull-down體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)

構(gòu)建pGEX-5x-1-UBC9和pET-28a-ClpX表達(dá)載體，分別轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)以表達(dá)GST-UBC9以及6His-ClpX融合蛋白.同時(shí)轉(zhuǎn)化pGEX-5x-1和pET-28a空載體作為陰性對(duì)照.

GST pull-down：將結(jié)合有GST融合蛋白的Glutathione Sepharose 4B懸浮于500μL NETN(100mmol/L NaCl，1mmol/L EDTA，20mmol/L Tris-HCl pH 7.0，0.5% Nonidet P-40，1mmol/L PMSF)緩沖液中，加入50μL純化的6His-ClpX融合蛋白，于4℃結(jié)合4～8h.離心后沉淀用500μL buffer H(20mmol/L Tris-HCl pH 7.7，50mmol/L KCl，20% Glycerol，0.1% Nonidet P-40，0.007%β-巰基乙醇)洗滌3次.在沉淀中加入20μL 1×SDS蛋白上樣緩沖液，在沸水浴中變性5min，離心后取上清作SDS-PAGE凝膠電泳.以mouse Anti-His的單克隆抗體進(jìn)行Western blot檢測(cè).

1.6 體內(nèi)結(jié)合實(shí)驗(yàn)(Co-IP)

將pCMV-Myc-ClpX和pEF-Flag-UBC9兩個(gè)重組質(zhì)粒瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中.轉(zhuǎn)染48h后收集細(xì)胞，加入1mL細(xì)胞裂解液(150mmol/L NaCl，50mmol/L Tris-HCL，1% NP-40，1mmol/L DTT，5mmol/L EDTA，使用前加入蛋白酶抑制劑)，4℃裂解1h，從中預(yù)留10μL加入2×蛋白電泳上樣緩沖液作為陽(yáng)性對(duì)照，其余細(xì)胞裂解液平均分成2份，其中1份樣品中加入Myc標(biāo)簽抗體1μg，另1份樣品中加入mouse IgG 1μg作為陰性對(duì)照，將兩個(gè)樣品同時(shí)在4℃水平搖床上低速搖動(dòng)過(guò)夜，次日向每個(gè)樣品中各加入20μL protein G瓊脂糖凝珠，4℃水平搖床上低速搖動(dòng)6～8h，離心后吸去上清，用細(xì)胞裂解液洗滌瓊脂糖凝珠抗原抗體復(fù)合物3次，吸干珠子上方的水層后，加入20μL 1×蛋白電泳上樣緩沖液，沸水浴5min，離心后對(duì)上清用Flag抗體進(jìn)行Western blot檢測(cè).

1.7 細(xì)胞增殖檢測(cè)

將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染18h后充分消化細(xì)胞，稀釋后種入96孔板內(nèi).使用與酶標(biāo)儀匹配的96孔板按照每孔1000個(gè)細(xì)胞(培液100μL)計(jì)算細(xì)胞總量，并按照測(cè)量天數(shù)作為所分細(xì)胞孔數(shù)的倍數(shù)，每組設(shè)3個(gè)重復(fù).待3h左右細(xì)胞基本貼壁后每孔加入10μL MTT顯色劑(5mg/mL)進(jìn)行顯色反應(yīng)，在37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4h后，吸出培養(yǎng)基，在每孔中加入100μL DMSO，振蕩混合10min，使藍(lán)紫色沉淀充分溶解，在490nm測(cè)定吸光值，以確定細(xì)胞實(shí)際的起始密度，作為生長(zhǎng)相對(duì)零點(diǎn).按照同樣的方法每隔24h測(cè)量一次，連續(xù)測(cè)定3～4d.等所有數(shù)據(jù)收集后，用Excel繪出圖表.

1.8 螢光素酶信號(hào)檢測(cè)

Luciferase報(bào)告基因系統(tǒng)是以熒光素(luciferin)為底物來(lái)檢測(cè)螢火蟲熒光素酶(firefly luciferase)活性的一種報(bào)告系統(tǒng)，是檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子與目的基因啟動(dòng)子區(qū)DNA相互作用的一種檢測(cè)方法.本實(shí)驗(yàn)所用的Luciferase報(bào)告基因質(zhì)粒中含有5個(gè)拷貝的NF-κB(Nuclear Factor κB)應(yīng)答元件，可與NF-κB轉(zhuǎn)錄因子相互作用而激活螢光素酶報(bào)告基因luc2P的轉(zhuǎn)錄，通過(guò)測(cè)定螢光素酶的表達(dá)量來(lái)檢測(cè)對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子的活性.

接種細(xì)胞至24孔板培養(yǎng)過(guò)夜，將3種質(zhì)粒按照一定的比例共轉(zhuǎn)染細(xì)胞(目的基因質(zhì)粒或空載體對(duì)照質(zhì)粒，600ng；Luciferase報(bào)告基因質(zhì)粒，100ng；Renilla質(zhì)粒，10ng)，37℃，5% CO2，繼續(xù)培養(yǎng)24～48h后，用PBS洗滌1次，每孔加100μL 1×PLB細(xì)胞裂解液，室溫振蕩裂解15min后把裂解液吸入1.5mL的離心管中，離心取上清.

Luciferase檢測(cè)分析：按照Promega公司Dual Luciferase reporter assay system操作手冊(cè)進(jìn)行操作，用Promega公司的發(fā)光檢測(cè)儀上機(jī)檢測(cè)；每個(gè)檢測(cè)孔(96孔板)內(nèi)加入20μL細(xì)胞裂解液上清，先在每孔添加100μL LARⅡ測(cè)定Firefly Luciferase活性，再添加100μL Stop&Glo試劑，以測(cè)定Renilla Luciferase活性.每個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù)孔，用Excel軟件繪制柱形圖，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果.

2 結(jié)果與分析

2.1 ClpX抑制宿主細(xì)胞增殖

為了檢測(cè)ClpX對(duì)宿主細(xì)胞增殖的影響，我們將pCMV-Myc-ClpX質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞使其進(jìn)行過(guò)表達(dá)，并利用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)速率.結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染pCMV-Myc空質(zhì)粒的陰性對(duì)照相比，過(guò)表達(dá)ClpX會(huì)顯著減緩細(xì)胞的增殖(圖1(a)).經(jīng)過(guò)24，48和72h培養(yǎng)后，過(guò)表達(dá)ClpX的HEK293T細(xì)胞數(shù)量分別只有對(duì)照組的96.0%(P=3.0×10-2)，92.3%(P=3.5×10-4)和85.2%(P=5.7×10-6).

我們隨后對(duì)該組細(xì)胞進(jìn)行了流式細(xì)胞儀檢測(cè)，以觀察ClpX對(duì)細(xì)胞周期的影響.結(jié)果表明，與對(duì)照相比，在過(guò)表達(dá)ClpX的HEK293T細(xì)胞中，處于G2期細(xì)胞的比例由10.57%上升至14.35%(P=3.7×10-2)，見(jiàn)圖1(b)，提示ClpX的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致HEK293T細(xì)胞G2期阻滯，并可能因此抑制細(xì)胞增殖.

2.2 ClpX與人UBC9間存在直接相互作用

為探索結(jié)核分枝桿菌在感染宿主并激活免疫反應(yīng)的過(guò)程中，作為病原體的蛋白酶亞基ClpX是否有可能通過(guò)與宿主蛋白間的直接相互作用而行使激活免疫系統(tǒng)的分子功能.我們采用酵母雙雜交技術(shù)，以ClpX為誘餌蛋白(bait)篩選人類免疫淋巴細(xì)胞文庫(kù)，以期獲得人類細(xì)胞中能夠與ClpX直接相互作用的蛋白.通過(guò)酵母雙雜交文庫(kù)篩選獲得2個(gè)陽(yáng)性克隆，經(jīng)BLAST比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)均編碼同一蛋白，人UBC9.經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的回轉(zhuǎn)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示構(gòu)建在酵母雙雜交獵物(prey)載體pGADT7上的UBC9與構(gòu)建在誘餌載體pGBKT7上的ClpX共轉(zhuǎn)化酵母菌株AH109后能有效激活報(bào)告中全部3個(gè)報(bào)告基因ADE2、HIS3和LacZ，且并未檢測(cè)到UBC9存在自激活效應(yīng)，證實(shí)ClpX與UBC9這兩個(gè)蛋白之間存在直接的物理相互作用(圖2(b)).

為了進(jìn)一步檢驗(yàn)ClpX與UBC9兩者間的相互作用，我們進(jìn)行了體外GST pull-down實(shí)驗(yàn)，并證實(shí)經(jīng)原核表達(dá)的6His-ClpX與GST-UBC9融合蛋白間在體外也能發(fā)生直接的相互作用(圖2(b)).同時(shí)，為了檢驗(yàn)這兩個(gè)蛋白在宿主細(xì)胞內(nèi)是否存在相互作用，我們又在HEK293T細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行了免疫共沉淀實(shí)驗(yàn).結(jié)果顯示利用Anti-Myc抗體能夠共沉淀Flag-UBC9，使其可被Anti-Flag抗體檢測(cè)(圖2(c)).以上這些結(jié)果均證實(shí)了ClpX與UBC9蛋白之間存在直接的物理相互作用，ClpX也因此有可能通過(guò)UBC9調(diào)控人類細(xì)胞.

2.3 ClpX下調(diào)內(nèi)源性UBC9蛋白表達(dá)

我們?cè)谶M(jìn)行上述Co-IP實(shí)驗(yàn)中意外發(fā)現(xiàn)，相較于單獨(dú)過(guò)表達(dá)UBC9，同時(shí)過(guò)表達(dá)ClpX和UBC9時(shí)，UBC9過(guò)表達(dá)水平顯著下調(diào)(圖3).結(jié)合ClpX編碼蛋白水解酶這一信息，我們推測(cè)ClpX能夠通過(guò)物理結(jié)合UBC9并下調(diào)其蛋白表達(dá).為了驗(yàn)證這一假設(shè)，我們分別在轉(zhuǎn)染了pCMV-Myc-ClpX(過(guò)表達(dá)ClpX)和pCMV-Myc空載體(空白對(duì)照)的HEK293T細(xì)胞中，使用Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)源性UBC9的表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示：過(guò)表達(dá)ClpX后，細(xì)胞內(nèi)源性UBC9表達(dá)量顯著下調(diào)，從而驗(yàn)證了我們的推測(cè).

2.4 ClpX通過(guò)UBC9調(diào)控細(xì)胞增殖

作為細(xì)胞中唯一參與SUMO化(SUMOylation)的泛素接合酶E2，UBC9在SUMO化修飾介導(dǎo)的細(xì)胞通路中行使重要功能，參與調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)，腫瘤發(fā)生等生物過(guò)程.為了檢測(cè)ClpX是否也能通過(guò)下調(diào)UBC9的蛋白表達(dá)抑制細(xì)胞增殖，我們使用人工合成的shRNA沉默細(xì)胞內(nèi)源性UBC9的蛋白.在HEK293T細(xì)胞中，sh205，sh317兩條識(shí)別不同靶序列的shRNA被證明能夠有效地下調(diào)內(nèi)源性UBC9的表達(dá)(圖4(a)，見(jiàn)第592頁(yè)).且我們發(fā)現(xiàn)沉默UBC9和過(guò)表達(dá)ClpX的HEK293T細(xì)胞表現(xiàn)相同，細(xì)胞增殖被顯著抑制，并表現(xiàn)出明顯的G2期阻滯(圖4(b)～(d)).此外，在過(guò)表達(dá)ClpX的HEK293T細(xì)胞中，如果同時(shí)過(guò)表達(dá)UBC9能夠顯著逆轉(zhuǎn)因ClpX過(guò)表達(dá)引起的細(xì)胞增殖抑制現(xiàn)象(圖4(e)).這些結(jié)果均提示ClpX調(diào)控細(xì)胞增殖依賴與UBC9的相互作用.

2.5 過(guò)表達(dá)結(jié)核桿菌ClpX增強(qiáng)NF-κB轉(zhuǎn)錄因子活性

結(jié)核桿菌感染能夠激活宿主的免疫系統(tǒng)，Toll樣受體(TLRs)介導(dǎo)最初的細(xì)胞免疫激活反應(yīng)，發(fā)揮殺傷最初侵入的結(jié)核桿菌的功能.TLRs能夠激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，因此調(diào)控細(xì)胞內(nèi)免疫反應(yīng)依賴的一系列免疫調(diào)節(jié)因子(如IL8、IL-1β、TNF-α、Bcl-2等)的表達(dá)，最終殺滅侵入體內(nèi)的結(jié)核桿菌[2，12-13].在以上工作中我們發(fā)現(xiàn)了ClpX與UBC9在細(xì)胞內(nèi)存在特異性相互作用，并且ClpX可抑制宿主細(xì)胞UBC9的表達(dá)，并因此抑制宿主細(xì)胞的增殖.已知UBC9作為SUMO化修飾的關(guān)鍵酶之一，能通過(guò)參與SUMO化過(guò)程而可逆的調(diào)節(jié)多種轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)出細(xì)胞核的行為及轉(zhuǎn)錄活性.為探究結(jié)核桿菌ClpX蛋白進(jìn)入細(xì)胞后宿主的NF-κB轉(zhuǎn)錄因子能否響應(yīng)，我們采用雙螢光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)了過(guò)表達(dá)ClpX后HEK293T細(xì)胞中內(nèi)源性NF-κB轉(zhuǎn)錄因子的活性.結(jié)果顯示，相較于轉(zhuǎn)染了pCMV-Myc空載體的對(duì)照組細(xì)胞，轉(zhuǎn)染了pCMV-Myc-ClpX(過(guò)表達(dá)ClpX)的實(shí)驗(yàn)組中NF-κB轉(zhuǎn)錄因子活性顯著增強(qiáng)(圖5).

3 討 論

病原微生物與宿主細(xì)胞間復(fù)雜的相互作用是感染性疾病發(fā)生的基礎(chǔ).感染發(fā)生后，微生物及宿主細(xì)胞的多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑以及基因表達(dá)譜常會(huì)發(fā)生巨大變異，從而激活細(xì)胞內(nèi)的一系列免疫應(yīng)答反應(yīng)，引起細(xì)胞增殖、分化、炎癥、凋亡等生物過(guò)程的異常，進(jìn)而引發(fā)疾病[13].而病原微生物的分泌蛋白及細(xì)胞表面組分在這一過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用.質(zhì)譜分析顯示，結(jié)核桿菌H37Rv的ClpX蛋白存在于膜蛋白碎片和全細(xì)胞裂解液[9-11]，這提示，作為結(jié)核桿菌細(xì)胞膜組分的ClpX可能在侵染宿主細(xì)胞、與宿主的免疫互作以及在宿主細(xì)胞中長(zhǎng)期潛伏和持留的過(guò)程中產(chǎn)生影響.

ClpX在原核生物中高度保守，除經(jīng)典的模式生物大腸桿菌(Escherichiacoli)外，傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphi)、霍亂弧菌(Vibriocholera)、痢疾桿菌(Shigelladysenteriae)、腦膜炎奈瑟氏菌(Neisseriameningitides)等致病菌中均存在高度保守的ClpX(identity>60%).尤其在約151～225位的氨基酸殘基，AAA+(ATPases Associated with a wide variety of cellular Activities)功能結(jié)構(gòu)域所處的位置，一致性超過(guò)75%(圖6)，蛋白結(jié)構(gòu)的高度相似性暗示結(jié)核桿菌與近源種間的ClpX分子功能具有保守性.研究表明，在大腸桿菌中過(guò)量表達(dá)結(jié)核桿菌的ClpX會(huì)抑制宿主菌的生長(zhǎng)速度[3]，此外，在結(jié)核桿菌自身體內(nèi)過(guò)量表達(dá)ClpX也會(huì)延遲菌體的生長(zhǎng)和分裂[8].本文的研究發(fā)現(xiàn)了ClpX能夠直接結(jié)合人源UBC9進(jìn)而下調(diào)其蛋白表達(dá)水平，這直接阻滯了宿主的細(xì)胞周期并表現(xiàn)為細(xì)胞增殖緩慢.

UBC9是細(xì)胞內(nèi)介導(dǎo)蛋白質(zhì)泛素化降解的接合酶(E2)之一，可通過(guò)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的降解而調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的多種生物學(xué)過(guò)程.UBC9也是至今發(fā)現(xiàn)的唯一一個(gè)能參與SUMO化修飾的E2，因此在SUMO化修飾介導(dǎo)的細(xì)胞通路中行使著重要功能.大量研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞中UBC9表達(dá)量升高，如果人為抑制UBC9的表達(dá)就能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[14-15].SUMO化修飾能可逆的調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)出細(xì)胞核的行為及轉(zhuǎn)錄活性，全局調(diào)控細(xì)胞蛋白質(zhì)組，從而控制細(xì)胞周期、基因表達(dá)及DNA合成等最基礎(chǔ)的生命活動(dòng)[16].因此，我們推測(cè)結(jié)核桿菌ClpX下調(diào)UBC9對(duì)宿主細(xì)胞的影響并不僅限于抑制細(xì)胞增殖，還應(yīng)調(diào)控其他基礎(chǔ)的細(xì)胞功能，影響多種細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路.NF-κB轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的信號(hào)通路在宿主對(duì)多種病原微生物感染所激發(fā)的免疫應(yīng)答反應(yīng)(包括先天性免疫和獲得性免疫)中都具有重要作用[13].PARP1、PIAS-gamma和UBC9共同參與的SUMO化修飾可以調(diào)節(jié)NEMO亞基(IKKγ， NF-κB必需的調(diào)節(jié)亞基)的進(jìn)出核反應(yīng)[17]，因此UBC9表達(dá)量的變化勢(shì)必會(huì)影響到NF-κB轉(zhuǎn)錄因子的活性及其所調(diào)控的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的進(jìn)程.

本研究證實(shí)了結(jié)核桿菌ClpX可與人源UBC9蛋白發(fā)生直接的物理相互作用，激活NF-κB轉(zhuǎn)錄因子的活性.由于被激活的NF-κB轉(zhuǎn)錄因子可上調(diào)下游編碼基因的表達(dá)量，包括一系列趨化因子(Chemokine)、細(xì)胞因子(cytokines， CK)、粘附分子(Adhesion Molecules， AMs)、促進(jìn)炎癥反應(yīng)(inflammatory)的酶類、凋亡抑制因子(inhibitors of apoptosis)等，因此這些成分可以促進(jìn)宿主被病原體感染的部位產(chǎn)生炎癥，使吞噬細(xì)胞呈遞至感染部位，對(duì)病原體進(jìn)行吞噬[13]，同時(shí)，NF-κB的激活在多種細(xì)胞中都可以阻斷TNF誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[18-19].病原體在最初入侵宿主細(xì)胞時(shí)對(duì)宿主細(xì)胞產(chǎn)生的先天性免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)在建立早期的感染、長(zhǎng)期的持留和潛伏中都起重要作用[20].因此，結(jié)核桿菌ClpX可能是一種保守的毒力因子，通過(guò)與UBC9的蛋白相互作用，調(diào)控SUMO化修飾所參與的相關(guān)信號(hào)通路.其中包括激活宿主NF-κB轉(zhuǎn)錄因子活性從而激發(fā)宿主的先天性免疫應(yīng)答反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)宿主的侵染以及在巨噬細(xì)胞中的持留.本文對(duì)于結(jié)核桿菌ClpX所引起的宿主表型與功能的變異，以及宿主響應(yīng)ClpX表達(dá)的相關(guān)信號(hào)通路的研究結(jié)果，為進(jìn)一步深入研究結(jié)核桿菌及其近源的病原微生物與宿主之間相互作用的機(jī)理提供了新的線索.

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Mycobacterium tuberculosis ClpX Interacts with Human UBC9 and Inhibits the Proliferation of Host Cell

WANG Yaqian， SHI Chao， HUO Keke

(State Key Laboratory of Genetic Engineering， School of Life Sciences， Fudan University， Shanghai 200438， China)

ClpXP serine protease is well conserved in prokaryotes， consists of ClpX and ClpP. ClpX with ATP binding and hydrolysis activity， involved in regulation of cell cycle and the stress response， is essential for the pathogenicity in a variety of microorganisms includingMycobacteriumtuberculosis. However， little was known about the underlying molecular basis. In order to reveal the mechanisms of howMycobacteriumtuberculosisworking in the infected host cells through ClpX， we performed a yeast two hybrid screening from human lymphocytes cDNA library to explore new proteins interacting with ClpX. An ubiquitin ligase E2 protein， UBC9 was identified and its specific protein interaction with ClpX was confirmed by GST pull-down and co-IP assay. We next demonstrated that cell proliferation was inhibited in HEK293T cells with overexpressed ClpX protein or silenced UBC9 protein， whilst an overexpressed UBC9 could eliminate the negative regulation of cell proliferation.

Mycobacteriumtuberculosis； ClpX； UBC9； protein interaction； cell proliferation

0427-7104(2016)05-0587-09

2016-02-29

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(2013CB531603)；國(guó)家科技重大專項(xiàng)(62008ZX10003-006)

王亞倩(1985—)，女，碩士研究生；霍克克，男，教授，通訊聯(lián)系人，E-mail：kkhuo@fudan.edu.cn

Q 752

A