一種針對(duì)馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)的無(wú)痕基因組改造方法

郭 超,陳勇毅,周峻崗,余 垚,呂 紅

(1. 復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 遺傳工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200438;2. 上海工業(yè)菌株工程技術(shù)研究中心,上海 200438)

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一種針對(duì)馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)的無(wú)痕基因組改造方法

郭 超1, 2,陳勇毅1, 2,周峻崗1, 2,余 垚1, 2,呂 紅1, 2

(1. 復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 遺傳工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200438;2. 上海工業(yè)菌株工程技術(shù)研究中心,上海 200438)

馬克斯克魯維酵母位于酵母科克魯維屬, 具有高分泌能力、高生長(zhǎng)速率、多底物利用以及耐高溫等特點(diǎn), 具有工業(yè)應(yīng)用前景. 因此, 建立馬克斯克魯維酵母的基因工程改造技術(shù)十分重要. 本文以馬克斯克魯維酵母URA3基因缺陷菌株為出發(fā)菌株, 依據(jù)同源重組原理, 選用KmURA3作為可循環(huán)使用的篩選標(biāo)簽基因, 建立了一種針對(duì)馬克斯克魯維酵母的無(wú)殘留多基因敲除技術(shù), 以滿足其遺傳工程改造的需求. 本研究利用這種技術(shù)成功構(gòu)建了Kmhis3Δ、Kmura3Δhis3Δ、Kmura3Δade2Δ、Kmura3Δhis3Δade2Δ、Kmhis3Δade2Δ等5株?duì)I養(yǎng)缺陷型菌株, 為馬克斯克魯維酵母的分子遺傳學(xué)研究以及工業(yè)應(yīng)用研究提供了遺傳材料.

馬克斯克魯維酵母； 多基因敲除；KmURA3基因；KmHIS3基因；KmADE2基因

馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus), 屬于酵母科克魯維屬, 像釀酒酵母一樣, 是食品安全級(jí)酵母, 并通過(guò)了美國(guó)GRAS(Generally Regarded as Safe)和歐洲QPS(Qualified Presumption of Safety)食品安全認(rèn)證[1]. 馬克斯克魯維酵母具有生長(zhǎng)快、耐高溫、可利用多種糖類(lèi)作為碳源等生理生化特點(diǎn)[2-3], 自身還能分泌產(chǎn)生多種蛋白酶, 如菊粉酶[4]、β-半乳糖苷酶[5]、羰基還原酶[6]、β-葡萄糖苷酶[7]、β-木糖苷酶[8]等水解酶類(lèi), 因此在利用菊粉[9]、乳清[10]、木質(zhì)纖維素[11-12]等廉價(jià)原料生產(chǎn)乙醇方面具有良好應(yīng)用前景. 此外, 利用基因工程技術(shù), 實(shí)現(xiàn)了多種異源蛋白在K.marxianus中的表達(dá), 如α-半乳糖苷酶[13]、乳糖脫氫酶[14]、耐熱纖維素酶[15]等. 因此,K.marxianus在乙醇發(fā)酵、外源蛋白表達(dá)等方面表現(xiàn)出很好的工業(yè)應(yīng)用潛力.

為了更好地開(kāi)展K.marxianus工業(yè)應(yīng)用研究, 需要建立適合K.marxianus的遺傳操作體系, 實(shí)現(xiàn)在酵母基因組上的遺傳操作. 2007年 Ribeiro等首次將Cre-LoxP系統(tǒng)應(yīng)用于K.marxianus, 并成功實(shí)現(xiàn)了K.marxianus基因組上的LAC4(β-半乳糖苷酶基因)雙拷貝基因的敲除[16]. 但利用Cre-LoxP敲除基因組上的DNA序列時(shí), 需要進(jìn)行兩次轉(zhuǎn)化, 操作較復(fù)雜, 同時(shí)還會(huì)在基因組上殘留外源DNA片段. 在K.marxianus基因組上進(jìn)行外源基因整合研究方面, Abdel-Banat等在K.marxianus中敲除了非同源末端連接途徑相關(guān)基因KU70, 提高了外源基因隨機(jī)插入基因組的效率[17]. 也有研究報(bào)道通過(guò)利用URA3作為篩選標(biāo)簽, 將外源基因非靶向性隨機(jī)插入K.marxianus基因組實(shí)現(xiàn)外源基因表達(dá)[14-15,18]. 上述這些研究主要以非靶向性隨機(jī)插入基因組為主.

本研究利用同源重組原理, 選擇KmURA3作為可循環(huán)使用的篩選標(biāo)簽, 在K.marxianus中建立了一種無(wú)痕基因組改造方法.URA3基因編碼的乳清苷5-磷酸脫羧酶, 能將5-FOA(5-氟乳清酸) 轉(zhuǎn)化成對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有害的物質(zhì), 因此含有URA3基因的酵母細(xì)胞無(wú)法在含有5-FOA的培養(yǎng)基上生長(zhǎng). 利用URA3作為營(yíng)養(yǎng)缺陷篩選標(biāo)記時(shí), 既可以實(shí)現(xiàn)對(duì)基因組目標(biāo)序列的敲除, 又可以通過(guò)同源重組和反篩的并用, 實(shí)現(xiàn)URA3篩選標(biāo)簽基因的脫落. 應(yīng)用這種方法敲除基因組基因時(shí), 不會(huì)殘留外源DNA片段, 同時(shí)又能實(shí)現(xiàn)標(biāo)簽基因的再利用. 應(yīng)用該方法, 我們成功構(gòu)建了Kmura3Δhis3Δ、Kmura3Δade2Δ、Kmura3Δhis3Δade2Δ、Kmhis3Δ、Kmhis3Δade2Δ等基因工程宿主菌株.

1 材料與方法

1.1 材料

K.marxianusFIMURA3基因缺陷菌株Kmura3Δ, 基因型：ura3Δ(190-352);K.marxianusFIM野生菌株; 大腸桿菌E.coliDH5α; 質(zhì)粒構(gòu)建載體pMD-18T均為本實(shí)驗(yàn)室保存.

PCR擴(kuò)增使用KOD酶試劑盒購(gòu)自TOYOBO. 多片段一步酶連法構(gòu)建質(zhì)粒[19]所用試劑盒(一步法克隆試劑盒)購(gòu)自美國(guó)Yeasen. 各種限制性?xún)?nèi)切酶、T4DNA連接酶等均購(gòu)自TaKaRa公司. PCR引物、DNA測(cè)序由上海杰李生物技術(shù)有限公司完成. Yeast Extract購(gòu)自德國(guó)Merk公司. Bacto-Agar, Yeast Nitrogen Base W/O Amino Acids(YNB)購(gòu)自美國(guó)DIFICO公司. 5-FOA為U.S.Biological 公司產(chǎn)品. 各種培養(yǎng)基氨基酸購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司. YPD培養(yǎng)基：1%酵母提取物, 2% 蛋白胨, 2% 葡萄糖. SC-Uracil培養(yǎng)基：0.67%YNB, 2%葡萄糖, 不含Uracil(尿嘧啶)的混合氨基酸. SC-Histidine培養(yǎng)基：0.67% YNB, 2%葡萄糖, 不含Histidine(組氨酸)的混合氨基酸. SC-Adenine培養(yǎng)基：0.67% YNB, 2%葡萄糖, 不含Adenine(腺嘌呤)的混合氨基酸. YPD+5-FOA培養(yǎng)基：YPD培養(yǎng)基, 0.5% 5-FOA.

1.2 方法

1.2.1K.marxianus基因組抽提

本研究中酵母基因組提取采用珠磨法[20]. 取3mL對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期酵母菌菌液, 離心收集菌體后分別加入250μL DNA裂解液, 250μL苯酚/氯仿/異戊醇混合液(體積比25∶24∶1), 0.3g玻璃珠(直徑0.3～0.5mm), 漩渦震蕩1min; 12000r/min離心3min, 取上清, 加入550μL氯仿/異戊醇混合液(體積比24∶1), 上下混勻后8000r/min 離心3min; 取上清, 加入兩倍體積無(wú)水乙醇, -20℃靜置30min; 8000r/min 離心5min, 沉淀物用70%乙醇洗兩次, 70℃烘干后溶于50μL TE, -20℃保存.

1.2.2 酵母DNA序列克隆與基因敲除盒的構(gòu)建

從K.marxianus基因組敲除的的基因有：KmHIS3、KmADE2. 依據(jù)NCBI已公布的K.marxianusDMKU3-1042 基因組信息(DBLINK-BioProject：PRJDA65233)設(shè)計(jì)引物(表1). 引物由上海杰李生物技術(shù)有限公司合成.

選用KmURA3為篩選標(biāo)簽基因, 以K.marxianus基因組為模板, PCR擴(kuò)增獲得KmURA3 ORF 1430bp 標(biāo)簽基因. 構(gòu)建KmHIS3基因中斷盒pMD-18This3Δ∶∶URA3-cas, 以K.marxianus基因組為模板PCR擴(kuò)增KmHIS3 ORF上下游片段, 分別命名：HIS3_up、HIS3_down1、HIS3_down2. HIS3_up為KmHIS3 ORF上游607bp DNA片段, HIS3_down1、HIS3_down2分別為KmHIS3 ORF下游 565bp 和604bp DNA片段, HIS3_down1和HIS3_down2為同源序列. 將上述HIS3_up、HIS3_down1、KmURA3、HIS3_down2 DNA片段和PstⅠ、SmaⅠ雙酶切獲得的pMD-18T線性化載體片段進(jìn)行多片段一步酶法[19]連接, 轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞, 抽提質(zhì)粒. 構(gòu)建獲得KmHIS3基因敲除中斷盒pMD-18This3Δ∶∶URA3-cas.

同樣的方法構(gòu)建KmADE2基因敲除中斷盒pMD-18Tade2Δ∶∶URA3-cas, PCR擴(kuò)增KmADE2 ORF上下游片段：ADE2_up、ADE2_down1、ADE2_down2. ADE2_up為KmADE2 ORF上游722bp DNA, ADE2_down1、ADE2_down2分別為KmADE2 ORF下游617bp和693bp DNA片段, 其中ADE2_down1和ADE2_down2為同源序列. 將上述ADE2_up、ADE2_down1、KmURA3、ADE2_down2 DNA片段和PstⅠ、SmaⅠ雙酶切獲得的pMD-18T線性化載體片段進(jìn)行多片段一步酶法[19]連接,轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞, 抽提質(zhì)粒, 構(gòu)建獲得KmADE2基因敲除中斷盒pMD-18Tade2Δ∶∶URA3-cas.

構(gòu)建獲得的pMD-18This3Δ∶∶URA3-cas、pMD-18Tade2Δ∶∶URA3-cas質(zhì)粒送上海杰李生物技術(shù)有限公司, 使用通用引物M13F/M13R測(cè)序鑒定.

表1 本實(shí)驗(yàn)所用引物序列

注：下劃線“__” 標(biāo)記部分為根據(jù)多片段一步酶連法[19]在引物5’端設(shè)計(jì)的同源序列.

1.2.3 酵母電轉(zhuǎn)化

敲除目的基因線性化DNA片段是通過(guò)電轉(zhuǎn)化方法來(lái)轉(zhuǎn)化K.marxianus出發(fā)菌株[14,21]. 平板挑單克隆于50mL YPD培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)至OD600為1.2, 8000r/min離心10min收集菌體; 2mL 2mol/L HEPES、2mL 1mol/L山梨醇(Sorbitol)和0.5mL 1mol/L DTT混合懸浮菌體, 30℃水浴30min; 8000r/min 離心10min, 去上清; 20mL去離子水漂洗兩次, 20mL 1mol/L山梨醇漂洗兩次; 8000r/min 離心10min, 去上清; 10mL 1mol/L山梨醇懸浮菌體, 取160μL菌液和1～2μg線性化DNA片段混合后置于電轉(zhuǎn)杯電擊; 電擊條件：1.5kV, 25μF, 500 Ω; 電擊后隨即30℃孵育4h, 涂布于培養(yǎng)基平板. 以上電轉(zhuǎn)化所有操作在冰上進(jìn)行.

1.2.4 酵母基因組基因的敲除

KmHIS3基因中斷盒pMD-18This3Δ∶∶URA3-cas用BamHⅠ和KpnⅠ雙酶切, 獲得his3Δ∶∶URA3 cassette線性化DNA, 電轉(zhuǎn)化Kmura3Δ菌株, 涂布SC-Uracil平板, 30℃培養(yǎng)48h, 在Uracil缺陷培養(yǎng)基平板上生長(zhǎng)正常的單克隆, 即為可能的陽(yáng)性克隆.

挑選可能的陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)接SC-Histidine平板, 30℃培養(yǎng)12h后, 若無(wú)克隆生長(zhǎng), 則提示測(cè)試的克隆子中, 線性化片段中的HIS3_up、HIS3_down2和基因組KmHIS3基因同源部分發(fā)生同源重組,KmURA3插入到KmHIS3基因座, 獲得敲除KmHIS3的工程菌株ura3Δhis3Δ∶∶URA3.

類(lèi)似地, 用SphⅠ和KpnⅠ雙酶切KmADE2中斷盒pMD-18Tade2Δ∶∶URA3-cas, 獲得ade2Δ∶∶URA3 cassette線性化DNA, 分別電轉(zhuǎn)化Kmura3Δ菌株和Kmura3Δhis3Δ菌株, 在SC-Uracil篩選, 分別獲得KmADE2基因敲除工程菌株Kmura3Δade2Δ∶∶URA3和Kmura3Δhis3Δade2Δ∶∶URA3.

1.2.5 標(biāo)簽基因的循環(huán)利用

Kmura3Δhis3Δ∶∶URA3工程菌株在SC-Uracil液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(OD600為0.6～1.0), 取100μL菌液涂布于YPD+5-FOA平板, 30℃培養(yǎng)12h, 正常生長(zhǎng)的單菌落應(yīng)為ura3Δhis3Δ工程菌株. 在其基因組KmHIS3基因座上插入的his3Δ∶∶URA3中HIS3_down1和HIS3_down2發(fā)生內(nèi)源性同源重組,KmURA3篩選標(biāo)簽基因脫落, 可以實(shí)現(xiàn)KmURA3的循環(huán)再使用, 同時(shí)在敲除KmHIS3位置無(wú)外源DNA片段殘留.

用同樣的方法, 將包含篩選標(biāo)簽基因KmURA3的Kmura3Δhis3Δade2Δ∶∶URA3、Kmura3Δade2Δ∶∶URA3菌株涂布YPD+5-FOA平板, 30℃培養(yǎng)12h, 獲得正常生長(zhǎng)的單菌落, 即KmURA3篩選標(biāo)簽基因脫落, 構(gòu)建獲得無(wú)外源DNA片段殘留的KmADE2敲除菌株Kmura3Δhis3Δade2Δ和Kmhis3Δade2Δ .

2 結(jié)果與分析

2.1KmHIS3、KmADE2基因敲除中斷盒的構(gòu)建

為了構(gòu)建KmHIS3中斷盒(圖1(a)), 使用KmURA3作為篩選標(biāo)記, 在Kmura3Δ菌株中敲除KmHIS3(圖2(a)).以酵母基因組為模板, PCR擴(kuò)增獲得HIS3_up、HIS3_down1、KmURA3、HIS3_down2片段(圖1(a), 圖2(a)), 凝膠DNA回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物, 與PstⅠ、SmaⅠ雙酶切獲得的pMD-18T線性化載體片段進(jìn)行多片段一步酶法連接[19]. 構(gòu)建獲得KmHIS3基因中斷盒pMD-18This3Δ∶∶URA3-cas(圖1(b)).BamHⅠ、KpnⅠ雙酶切pMD-18This3Δ∶∶URA3-cas, 獲得his3Δ∶∶URA3 cassette線性化DNA(圖1(a)). 同樣方法, PCR擴(kuò)增獲得ADE2_up、ADE2_down1、KmURA3、ADE2_down2(圖1(c)), 將上述凝膠DNA回收后和PstⅠ、SmaⅠ雙酶切獲得的pMD-18T線性化載體片段進(jìn)行多片段一步酶法[19]連接. 獲得KmADE2基因敲除中斷盒pMD-18Tade2Δ∶∶URA3-cas(圖1(d)).SphⅠ、KpnⅠ雙酶切pMD-18Tade2Δ∶∶URA3-cas, 獲得ade2Δ∶∶URA3 cassette線性化DNA(圖1(c)).

2.2 宿主菌Kmura3Δhis3Δ的構(gòu)建與鑒定

his3Δ∶∶URA3 cassette線性化DNA轉(zhuǎn)化Kmura3Δ菌株后, 涂布于SC-Uracil平板, 30℃培養(yǎng)48h.如圖2(b)上所示, 轉(zhuǎn)化子在SC-Uracil培養(yǎng)基上可以生長(zhǎng), 而在SC-Histidine的培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng), 說(shuō)明his3Δ∶∶URA3 cassette線性化片段同源重組插入到Kmura3Δ基因組的KmHIS3基因座上, 構(gòu)建獲得了Kmura3Δhis3Δ∶∶URA3菌株(圖2(a)).

為了丟掉篩選標(biāo)記KmURA3, 實(shí)現(xiàn)KmURA3的循環(huán)利用, 將Kmura3Δhis3Δ∶∶URA3菌株涂布于YPD+5-FOA平板, 30℃培養(yǎng)過(guò)夜(圖2(b)中). 在YPD+5-FOA能正常生長(zhǎng)的單菌落, 說(shuō)明在Kmura3Δhis3Δ∶∶URA3菌株中, HIS3_down1和HIS3_down2發(fā)生內(nèi)源性同源重組,KmURA3標(biāo)簽基因脫落(圖2(a)). 將在YPD+5-FOA生長(zhǎng)的單克隆分別接種SC-Uracil和SC-Histidine培養(yǎng)基, 均不能生長(zhǎng)(圖2(b)下), 提示構(gòu)建獲得無(wú)外源DNA殘留的Kmura3Δhis3Δ雙基因缺失菌株.

進(jìn)一步, 利用PCR方法對(duì)Kmura3Δhis3Δ雙基因缺失菌株進(jìn)行驗(yàn)證. 在KmHIS3基因敲除區(qū)域上下游設(shè)計(jì)引物F1：CGTGCACATGAGAATATTTCTTCTTAAACC,R2：TTACATCAAAACTCCT-TTGGTAGATGGAAC,如圖2(a)所示, 用F1/R1引物進(jìn)行擴(kuò)增, 獲得951bp片段(圖3), 與預(yù)測(cè)片段大小一致. 對(duì)凝膠電泳目的條帶進(jìn)行DNA回收并送測(cè)序, 測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì),Kmura3Δhis3Δ菌株的his3基因在其CDS 234～483區(qū)域缺失250bp(圖4), 成功構(gòu)建獲得Kmura3Δhis3Δ雙基因缺失菌株.

2.3 宿主菌Kmura3Δhis3Δade2Δ、Kmura3Δade2Δ的構(gòu)建與鑒定

SphⅠ、KpnⅠ雙酶切KmADE2中斷盒pMD-18Tade2Δ∶∶URA3-cas獲得的ade2Δ∶∶URA3 cassette線性化DNA, 分別電轉(zhuǎn)化缺陷菌株Kmura3Δhis3Δ和Kmura3Δ, 分別涂布SC-Uracil培養(yǎng)基. 轉(zhuǎn)化子在SC-Uracil 培養(yǎng)基上可以生長(zhǎng), 而在SC-Adenine培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng), 則獲得Kmura3Δhis3Δade2Δ∶∶URA3和Kmura3Δade2Δ∶∶URA3菌株.

為了實(shí)現(xiàn)KmURA3標(biāo)簽基因的掉落和循環(huán)使用, 將Kmura3Δhis3Δade2Δ∶∶URA3和Kmura3Δade2Δ∶∶URA3菌株分別涂布YPD+5-FOA培養(yǎng)平板, 正常生長(zhǎng)的單菌落提示KmURA3標(biāo)簽基因掉落. 隨后, 將5-FOA平板上生長(zhǎng)的單克隆分別接種在 SC-Uracil、SC-Histidine、SC-Adenine培養(yǎng)基上, 均不能生長(zhǎng)的克隆(圖5(a)，見(jiàn)第582頁(yè)), 可能是無(wú)外源DNA殘留的三基因缺失菌株Kmura3Δhis3Δade2Δ. 在SC-Uracil、SC-Adenine培養(yǎng)基上均不能生長(zhǎng)的克隆(圖6(a)，見(jiàn)第582頁(yè)), 可能是無(wú)外源DNA殘留的雙基因缺失菌株Kmura3Δade2Δ.

進(jìn)一步使用PCR方法對(duì)Kmura3Δhis3Δade2Δ、Kmura3Δade2Δ菌株進(jìn)行驗(yàn)證, 在KmADE2基因同源序列ADE2_up上游和ADE2_down2下游設(shè)計(jì)引物F2：ATGGACCAAGAACTGTTGGTATTT-TAGG,R2：TTATTTCCTCAAATATTCTTGGTATCCG.使用引物F2/R2擴(kuò)增獲得大小1601bp片段, 和預(yù)測(cè)片段大小一致(圖5(b), 圖6(b)). 對(duì)凝膠電泳目的條帶進(jìn)行DNA回收并送測(cè)序, 測(cè)序結(jié)果與野生菌株KmADE2序列進(jìn)行比對(duì),Kmura3Δhis3Δade2Δ、Kmura3Δade2Δ菌株的ade2基因序列在其CDS 774～893區(qū)域缺失120bp(圖7，見(jiàn)第582頁(yè)), 成功構(gòu)建獲得無(wú)外源DNA殘留的三基因缺失菌株Kmura3Δhis3Δade2Δ和雙基因缺失菌株Kmura3Δade2Δ.

2.4 宿主菌Kmhis3Δ 、Kmhis3Δade2Δ的構(gòu)建與鑒定

在Kmura3Δhis3Δ、Kmura3Δhis3Δade2Δ的基礎(chǔ)上, 為了獲得Kmhis3Δ、Kmhis3Δade2Δ工程菌株, 我們用同源重組的方法在KmURA3基因座上進(jìn)行了KmURA3基因的回補(bǔ).

本研究在KmURA3 ORF上下游設(shè)計(jì)引物(表1), PCR擴(kuò)增獲得包含KmURA3 ORF的1430bp回補(bǔ)DNA(Chromosome1：1542629～1544057, 1430bp). 將上述KmURA3回補(bǔ)DNA電轉(zhuǎn)化Kmura3Δhis3Δ菌株, 30℃培養(yǎng)48h后, 轉(zhuǎn)化子在SC-Uracil培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng), 而在SC-Histidine培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)(圖8(a)), 提示構(gòu)建獲得無(wú)外源DNA殘留的單基因敲除菌株Kmhis3Δ.

進(jìn)一步通過(guò)PCR方法驗(yàn)證Kmhis3Δ菌株, 在KmURA3回補(bǔ)片段上下游設(shè)計(jì)引物, F3：TTGGGACTCCAAAACTTATATTTTGAACG, R3：TCCGAGTACACACGAACCTCTTGTTCTCGG. 使用引物F3/R3擴(kuò)增獲得1630bp片段, 和預(yù)測(cè)片段大小一致(圖8(b)). 成功構(gòu)建獲得單基因缺失菌株Kmhis3Δ.

同樣的方法構(gòu)建Kmhis3Δade2Δ.KmURA3回補(bǔ)DNA電轉(zhuǎn)化Kmura3Δhis3Δade2Δ后, 轉(zhuǎn)化子在SC-Uracil培養(yǎng)基上生長(zhǎng), 而在SC-Histidine、SC-Adenine培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)(圖9(a)), 提示構(gòu)建獲得Kmhis3Δade2Δ. 進(jìn)一步PCR方法驗(yàn)證Kmhis3Δade2Δ, 使用F3/R3引物擴(kuò)增獲得1630bp片段, 與K.marxianusFIM野生菌株基因組為模板對(duì)照組相比, 片段大小一致(圖9(b)). 成功構(gòu)建獲得無(wú)外源DNA殘留的雙基因缺失菌株Kmhis3Δade2Δ.

2.5 無(wú)殘留多基因敲除方法的效率

根據(jù)本研究實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果, 無(wú)殘留多基因敲除方法構(gòu)建K.marxianus多基因缺失菌株時(shí), 電轉(zhuǎn)化靶基因中斷盒線性化 DNA片段的轉(zhuǎn)化率維持在每μg DNA 52～72個(gè)轉(zhuǎn)化子(表2).

表2 K.marxianus FIM多基因敲除菌株構(gòu)建效果

注：基因靶向敲除平均效率：36.112%;KmURA3回補(bǔ)平均效率：100%.

由于K.marxianus菌株非同源重組的高活性[14, 17], 在以KmURA3為篩選標(biāo)簽敲除目的基因時(shí), 比較電轉(zhuǎn)化后SC-Uracil篩選數(shù)據(jù)和敲除靶基因相應(yīng)營(yíng)養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基篩選數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)靶基因中斷盒線性化 DNA準(zhǔn)確插入基因組靶基因位置的平均準(zhǔn)確率為36.112%(表2). 這說(shuō)明靶基因中斷盒線性化 DNA在一定程度上也會(huì)以非同源末端連接的機(jī)體修復(fù)機(jī)制隨機(jī)插入基因組, 從而使菌株獲得標(biāo)簽基因的同時(shí)目的基因不發(fā)生缺失突變.

而5-FOA藥物篩選無(wú)痕靶基因敲除菌株時(shí), 在5-FOA篩選平板上隨機(jī)選取16個(gè)單克隆進(jìn)行后續(xù)相應(yīng)營(yíng)養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基鑒定和PCR驗(yàn)證, 發(fā)現(xiàn)內(nèi)源同源重組實(shí)現(xiàn)KmURA3標(biāo)簽基因掉落的菌株篩選準(zhǔn)確率高達(dá)100%.

有趣的是, 根據(jù)本研究統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)來(lái)看KmURA3靶向回補(bǔ)多基因缺失菌株基因組的SC-Uracil準(zhǔn)確率很高, 并沒(méi)有明顯的非同源隨機(jī)插入基因組現(xiàn)象. 這可能和KmURA3回補(bǔ)DNA片段的基因功能區(qū)完整性以及同源區(qū)序列較長(zhǎng)有關(guān).

3 討 論

雖然K.marxianus工業(yè)化應(yīng)用潛力巨大, 但是目前適用于K.marxianus的分子遺傳學(xué)操作方法并不多,K.marxianus遺傳分子機(jī)制研究和遺傳工程改造研究也遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于其他常規(guī)酵母. 目前關(guān)于K.marxianus分子遺傳學(xué)操作的報(bào)道包括Cre-LoxP系統(tǒng)和URA3篩選標(biāo)簽[2], 而Cre-LoxP系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)操作較復(fù)雜且實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)[16],URA3篩選標(biāo)簽也多用于外源基因非同源隨機(jī)插入整合基因組方面的研究[14-15,18].

本研究利用URA3的反向篩選特點(diǎn)[22], 選用KmURA3作為篩選標(biāo)簽基因, 根據(jù)同源重組原理建立了可用于K.marxianus的多基因敲除技術(shù). 通過(guò)一次轉(zhuǎn)化, SC-Uracil和5-FOA藥物兩次篩選即可獲得在基因組上無(wú)外源DNA殘留、同時(shí)敲除靶基因的菌株, 相比Cre-LoxP系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)操作更加方便. 本研究也引入了多片段一步酶法[19]構(gòu)建靶基因敲除盒, 大大縮短了構(gòu)建多基因敲除菌株的周期. 使用該方法進(jìn)行K.marxianus基因敲除時(shí), 關(guān)鍵在于敲除靶基因同源DNA序列GENE_up、GENE_down1和GENE_down2的設(shè)計(jì). 原則上, GENE_up、GENE_down1和GENE_down2的設(shè)計(jì)主要以考慮靶基因敲除區(qū)域?yàn)橹? 其中GENE_up為靶基因敲除區(qū)域上游的同源序列, 而GENE_down1和GENE_down2都是靶基因敲除區(qū)域下游的同源序列. 為了實(shí)現(xiàn)篩選標(biāo)簽基因KmURA3的循環(huán)使用, 在設(shè)計(jì)時(shí), GENE_down1和GENE_down2需要是同源序列, 這樣才可以實(shí)現(xiàn)在5-FOA反向篩選時(shí)能通過(guò)二次內(nèi)源性同源重組實(shí)現(xiàn)篩選標(biāo)簽基因KmURA3的掉落. 另外, 為了提高第一次同源重組的效率和準(zhǔn)確性, GENE_down2可以在GENE_down1同源區(qū)域下游延長(zhǎng)50～200bp. 除此之外, 需要盡可能確保GENE_down1、GENE_down2和靶基因同源區(qū)域起始序列是一致的, 這樣最終敲除區(qū)域的位置就和該起始序列位置一致.

本研究中, 通過(guò)這種方法構(gòu)建的Kmhis3Δ、Kmura3Δhis3Δ、Kmura3Δade2Δ、Kmura3Δhis3Δade2Δ、Kmhis3Δade2Δ等5株?duì)I養(yǎng)基因缺陷型宿主菌可作為K.marxianus分子遺傳學(xué)研究和遺傳工程應(yīng)用研究的實(shí)驗(yàn)材料. 同時(shí), 本研究所建立的K.marxianus無(wú)殘留多基因敲除方法不僅可以用于K.marxianus多基因靶向敲除, 也可用于外源基因在K.marxianus基因組上的靶向整合.

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A New Method for Genomic Non-Trace Molecular Manipulation Suitable forKluyveromycesmarxianus

GUO Chao1, 2, CHEN Yongyi1, 2, ZHOU Jungang1, 2, YU Yao1, 2, Lü Hong1, 2

(1. State Key Laboratory of Genetic Engineering, School of Life Sciences, Fudan University, Shanghai 200438, China；2.ShanghaiEngineeringResearchCenterofIndustrialMicroorganisms,Shanghai200438,China)

Kluyveromycesmarxianusbelongs to the genusKluyveromycesof the family Saccharomycetaceae, which has great potential for industrial application, with its traits including high secretory capacity, faster growth rate, the capacity to utilize a wide range of substrates, thermotolerance, etc. So a suitable technology for the genetic engineering onKluyveromycesmarxianusis necessary. WithKmura3Δ as the original strain, this paper proposed a new method suitable forKluyveromycesmarxianusto construct non-trace multiple gene disruption mutant strain via homologous recombination withKmURA3 as selective marker which can be reused. In this study, this method was successfully used to construct five nutritional gene-deficient host strains：Kmhis3Δ,Kmura3Δhis3Δ,Kmura3Δade2Δ,Kmura3Δhis3Δade2Δ, andKmhis3Δade2Δ. These mutant strains can be used for further research on the industrial application and molecular genetics ofKluyveromycesmarxianus.

Kluyveromycesmarxianus; multiple gene knockout;KmURA3;KmHIS3;KmADE2

0427-7104(2016)05-0576-11

2016-03-21

國(guó)家高新技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(2014AA021301, 2013AA102803B, 2012AA021501)；上?？莆亟ㄔO(shè)項(xiàng)目(13DZ2252000)

郭 超(1990—),男,碩士研究生;呂 紅,女,教授,通訊聯(lián)系人,E-mail：honglv@fudan.edu.cn.

Q 93-31

A