番茄DNA復(fù)制因子RFC1在減數(shù)分裂重組中的功能研究

劉 靜，王 英，王宏寬，倪迪安，馬 紅，王應(yīng)祥

(1. 復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 植物科學(xué)研究所，上海 200433； 2. 上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院生態(tài)技術(shù)與工程學(xué)院，上海 201418)

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番茄DNA復(fù)制因子RFC1在減數(shù)分裂重組中的功能研究

劉 靜1，#，王 英1，#，王宏寬1，倪迪安2，馬 紅1，王應(yīng)祥1

(1. 復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 植物科學(xué)研究所，上海 200433； 2. 上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院生態(tài)技術(shù)與工程學(xué)院，上海 201418)

減數(shù)分裂是真核生物有性生殖所必需，前期研究表明擬南芥DNA復(fù)制因子RFC1在減數(shù)分裂重組中具有重要作用，但其同源基因在其他物種中的減數(shù)分裂或其他功能還未有報(bào)道.為了檢驗(yàn)番茄RFC1在減數(shù)分裂中的功能，我們建立了減數(shù)分裂特異RFC1RNAi轉(zhuǎn)基因番茄，發(fā)現(xiàn)其花粉活性顯著降低，而且減數(shù)分裂異常.利用DAPI染色觀察染色體形態(tài)，發(fā)現(xiàn)RFC1RNAi減數(shù)分裂細(xì)胞在終變期和中期Ⅰ形成多價(jià)體，表明重組異常.DNA雙鏈斷裂指示蛋白γH2AX在RFC1RNAi粗線期染色體上分布的保留滯后，進(jìn)一步支持RFC1RNAi中的重組異常.擬南芥和番茄分別屬于真雙子葉植物中的兩個(gè)不同大支，薔薇類和菊類，因此本文的結(jié)果也表明DNA合成基因RFC1在進(jìn)化距離很遠(yuǎn)的不同植物物種中的功能相對(duì)保守.

減數(shù)分裂； DNA復(fù)制因子； 番茄； 減數(shù)分裂特異性RNA干擾

減數(shù)分裂(meiosis)是有性生殖生物產(chǎn)生生殖細(xì)胞時(shí)，進(jìn)行的染色體數(shù)目減半的細(xì)胞分裂活動(dòng)，包括減數(shù)分裂 Ⅰ 和減數(shù)分裂 Ⅱ.減數(shù)分裂 Ⅱ 類似于有絲分裂，而減數(shù)分裂 Ⅰ 是減數(shù)分裂特異的方面，涉及到同源染色體之間的相互作用，包括配對(duì)、聯(lián)會(huì)、重組和分離[1-2].相對(duì)于其他幾個(gè)事件，重組是減數(shù)分裂過(guò)程中同源染色體相互作用中研究相對(duì)較多的.重組不僅保證了同源染色體之間的物理連接，對(duì)同源染色體后期的正確分離起到重要作用，還導(dǎo)致了父母染色體之間產(chǎn)生不同等位基因的新組合，從而大大提高了后代的遺傳多樣性.

減數(shù)分裂重組包括DNA的雙鏈斷裂、加工、合成和連接.迄今為止，以模式植物擬南芥為材料，運(yùn)用正向和反向遺傳學(xué)方法已經(jīng)克隆并分析了近90個(gè)具有減數(shù)分裂重要功能的基因[2]，但是DNA合成環(huán)節(jié)的基因還鮮有報(bào)道.通過(guò)對(duì)擬南芥雄性減數(shù)分裂細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)減數(shù)分裂細(xì)胞表達(dá)一批DNA復(fù)制相關(guān)的基因[1，3].已有的研究表明，減數(shù)分裂重組中的DNA合成類似于有絲分裂的DNA復(fù)制，其過(guò)程高度保守[4-5].酵母有絲分裂DNA復(fù)制主要需要3種DNA聚合酶(Polα、Polε和Polδ)和3個(gè)相關(guān)復(fù)制因子(RFC、RPA和PCNA)[4].其中Polε主要負(fù)責(zé)前導(dǎo)鏈的合成；Polα則和Primase主要在后滯鏈啟動(dòng)時(shí)負(fù)責(zé)合成短RNA-DNA片段，然后Polδ完成這些片段的延伸，形成Okazaki片段.最后再經(jīng)過(guò)進(jìn)一步對(duì)這些片段加工、切割和連接完成DNA復(fù)制.減數(shù)分裂重組中的DNA合成被假設(shè)是通過(guò)類似的過(guò)程而實(shí)現(xiàn)的，但相關(guān)基因功能的研究則較少.通過(guò)遺傳篩選酵母中減數(shù)分裂重組有缺陷的突變體，鑒定到一個(gè)Polδ缺失C末端4個(gè)氨基酸的特異突變體，該突變體有絲分裂正常，只影響了減數(shù)分裂重組[6].擬南芥和水稻中的RPA1也參與了減數(shù)分裂重組[7-8].最近的研究表明擬南芥POL2A(酵母Polε的同源基因)和RFC1都是減數(shù)分裂重組主要通路所必需[9-10].綜上所述，DNA復(fù)制相關(guān)基因在減數(shù)分裂重組中具有功能，但是這些基因在其他物種減數(shù)分裂中的功能還未有報(bào)道.

被子植物中約3/4為真雙子葉植物，而真雙子葉植物中最大的兩個(gè)分支是薔薇類和菊類.擬南芥是屬于薔薇類的十字花科成員；為了檢驗(yàn)同源基因在進(jìn)化上與擬南芥距離較遠(yuǎn)的植物中的功能，本研究以菊類的茄科成員番茄(Solanumlycopersicum)為材料，采用減數(shù)分裂特異的基因沉默技術(shù)，分析番茄DNA復(fù)制因子RFC1在減數(shù)分裂中的功能.

1 材料和方法

1.1 材料

大腸桿菌EscherichiacoliDH5α，根瘤農(nóng)桿菌AgrobacteriumtumefaciensGV3101和pMeioDMC1載體(將35S啟動(dòng)子由SlDMC1的啟動(dòng)子替換后構(gòu)建的RNAi載體)均為本實(shí)驗(yàn)室保存；國(guó)內(nèi)栽培種“黃頂紅”番茄由上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院提供；PCR引物合成和測(cè)序由生工生物工程上海(股份)有限公司提供；植物總RNA提取試劑盒購(gòu)于QIAGEN公司；PCR產(chǎn)物回收試劑盒、DNA片段割膠回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)于AXYGEN公司；高保真酶購(gòu)于東洋紡公司；限制性內(nèi)切酶，T4DNA連接酶，聚核苷酸激酶和SYBR試劑購(gòu)于TaKaRa公司；胰蛋白胨，酵母提取物，牛肉提取物等購(gòu)于Sigma公司；染色液4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(4′，6-diamidino-2-phenylindole， DAPI)購(gòu)于Vector Laboratories；ZYP1和γH2AX抗體見(jiàn)文獻(xiàn)[9-10].

植物培養(yǎng)土配方：黑土40%，蛭石40%，珍珠巖20%；植物1/2MS培養(yǎng)基配方：MS粉2.2g/L，蔗糖10g/L，KOH調(diào)pH至5.8，加0.7%瓊脂粉，滅菌條件121℃，15min，降溫到約60℃時(shí)加抗生素25μg/mL；大腸桿菌LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化鈉10g/L，固體培養(yǎng)基加15g/L 瓊脂粉，滅菌條件121℃，15min，降溫到約60℃時(shí)倒板，選擇培養(yǎng)基含100μg/mL氨芐青霉素或50μg/mL 卡那霉素；農(nóng)桿菌YEB培養(yǎng)基配方：牛肉提取物5g/L，酵母提取物1g/L，蛋白胨5g/L，蔗糖5g/L，MgSO42mol/L，KOH調(diào)pH至7.4，選擇培養(yǎng)基含25μg/mL利福平，50μg/mL卡那霉素.

1.2 方法

1.2.1 系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)構(gòu)建

使用MEAG 5中的muscle序列比對(duì)軟件對(duì)蛋白序列進(jìn)行序列比對(duì).接著使用FastTree軟件的極大似然(Maximum Likelihood)方法對(duì)比對(duì)好的序列構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，參數(shù)使用默認(rèn).進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建好之后，使用MEGA 5打開(kāi)和調(diào)整.

1.2.2 番茄RFC1干涉載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)基因植物的獲取

設(shè)計(jì)減數(shù)分裂特異基因DMC1啟動(dòng)子的番茄擴(kuò)增引物(表1)，用番茄DMC1基因的啟動(dòng)子替代RNAi載體上的35S啟動(dòng)子[9-10].選取番茄RFC1基因cDNA保守區(qū)域，獲得插入有番茄RFC1基因cDNA片段的pMeioDMC1質(zhì)粒.番茄轉(zhuǎn)基因植物采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的子葉節(jié)轉(zhuǎn)化方法獲得[11].

1.2.3 番茄RNA提取及實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

用植物總RNA提取試劑盒分別提取野生型番茄和轉(zhuǎn)基因番茄的葉片和不同時(shí)期花藥總RNA，在檢測(cè)完總RNA的完整性、純度和濃度后，按照Promega反轉(zhuǎn)錄試劑盒方法獲得番茄的cDNA.之后，使用ABI實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀器做熒光定量PCR分析，將獲得的番茄cDNA樣品每個(gè)重復(fù)3次，相對(duì)表達(dá)水平通過(guò)2-ΔΔCT方法分析[12]，使用標(biāo)準(zhǔn)方差計(jì)算3次重復(fù)的波動(dòng)性，使用的內(nèi)參為番茄EF1-alpha基因.另外實(shí)驗(yàn)過(guò)程使用的引物是按照番茄RFC1基因的cDNA序列設(shè)計(jì)的前后兩對(duì)引物，內(nèi)參引物按照番茄EF1-alpha基因的cDNA序列保守區(qū)域設(shè)計(jì)的，引物序列見(jiàn)表1.

表1 基因水平檢測(cè)引物

1.2.4 花粉活性的亞歷山大紅染色觀察

剪取番茄的花序，在室溫條件下用卡諾固定液(V冰醋酸∶V無(wú)水乙醇=1∶3)固定過(guò)夜[13].在解剖鏡下，用解剖針將花序中已經(jīng)開(kāi)裂的花剝?nèi)?，留取花藥發(fā)黃且尚未開(kāi)裂的花苞.將其浸入含有亞歷山大紅染液的離心管內(nèi)[13]，在室溫下染色4h.用解剖針將花藥剖開(kāi)，除去雜質(zhì)后加入少量的亞歷山大紅染液，蓋上蓋玻片，輕輕用指尖壓片后，在白光下鏡檢拍照.用指甲油封玻片(-20℃預(yù)冷).

1.2.5 展片法觀察花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂染色體形態(tài)

實(shí)驗(yàn)采用的展片法主要參考文獻(xiàn)[13]，稍作改動(dòng)如下：剪取番茄的花序，在室溫條件下用卡諾固定液固定過(guò)夜.在解剖鏡下，用解剖針將花序中已經(jīng)開(kāi)裂的花和發(fā)黃的花藥去掉，將剩余的花序用酶解液(0.3% cellulase+0.3% pectinase+0.5% cytohelicase)在37℃下酶解30min.用鑷子將花苞從酶解液中取出，用0.01mol/L檸檬酸緩沖液清洗花苞3次，將盛有花苞的離心管放入冰盒里.將離心管內(nèi)的花苞用鑷子取出，解剖針將番茄的6個(gè)花藥剖出后，除去雜質(zhì)，用尖頭鑷子夾碎花藥，從而將花粉母細(xì)胞釋放到水中.將載玻片置于45℃的熱臺(tái)上，待載玻片上只剩下一層水膜時(shí)，在水膜區(qū)滴加20 μL 60%冰醋酸，并使得減數(shù)分裂期細(xì)胞在載玻片上分布均勻.等待30s后，在溶液的正上方用移液器滴加100μL卡諾固定液(-20℃預(yù)冷)，在熱臺(tái)上等待載玻片上液體晾干.每張載玻片用移液槍頭滴加1滴DAPI染色液，蓋上蓋玻片，避光染色10min后，在顯微鏡下觀察并拍照.

1.2.6 卡寶品紅染色觀察四分體

剪取番茄花序，在室溫下用卡諾固定液固定過(guò)夜.將番茄花序用雙蒸水沖洗2～3次后，剝?nèi)ズS色花藥的花，取番茄花序最外圍的1～2個(gè)花苞到載玻片上.在解剖鏡下用解剖針剝出花藥后，除去雜質(zhì)，向載玻片上滴加10μL雙蒸水，用解剖針的針尖將花粉母細(xì)胞從藥室中擠出，并涂布在載玻片上.自然風(fēng)干載玻片后，用20μL移液槍頭向載玻片滴加一滴卡寶品紅溶液(原液A：3g堿性品紅溶于100mL 70%酒精中；原液B：取原液A 10mL加入到90mL 5%石炭酸水溶液中；原液C：取原液B 55mL，加入6mL冰醋酸和6mL 福爾馬林：38%的甲醛.取C液10～20mL加45%冰醋酸80～90mL，再加山梨醇1.8g，配成10%～20%濃度的石炭酸品紅液).染色2～3min后，加上蓋玻片，在顯微鏡下觀察并拍照.

1.2.7 免疫熒光

實(shí)驗(yàn)采用的展片法主要參考文獻(xiàn)[13]，稍作改動(dòng)如下：取處于減數(shù)分裂時(shí)期的番茄花序于加有1mL 2%多聚甲醛的離心管中，在-0.1MPa，室溫固定15min，當(dāng)觀察花序完全沉到管底后，用0.01mol/L檸檬酸緩沖液將固定好的花序清洗3次，每次3min.然后除去帶發(fā)黃花藥的花，將一個(gè)處于減數(shù)分裂時(shí)期的番茄花藥轉(zhuǎn)移到載玻片上，滴加10μL雙蒸水于花藥上.用解剖針的針尖將花粉母細(xì)胞從藥室中擠出，除去雜質(zhì)后，用尖頭鑷子將剩余混合物質(zhì)夾碎，蓋上蓋玻片，玻棒輕輕敲打蓋玻片.將敲打后的玻片放入液氮中冷凍1min，取出玻片用雙面刀片迅速將蓋玻片挑開(kāi)，自然風(fēng)干.將載玻片分別用以下溶液處理：Wash buffer Ⅰ溶液(由1×PBS+1% Triton X-100配置成，在室溫條件下浸泡60min)、Block buffer(由1×PBS+5% BSA+0.1% Tween20+1mmol/L EDTA配置成，在37℃條件下孵育30min)、一抗(Block buffer稀釋一抗后，每張載玻片滴加200μL后用封口膜封片，4℃過(guò)夜，其中ZYP1稀釋比例為1∶200，H2Ax稀釋比例為1∶100)、Wash buffer Ⅱ(由1×PBS+0.1% Tween20配置成，在室溫下清洗3次，每次15min)、Block buffer(在室溫下孵育60min)、二抗(Block buffer稀釋二抗后，每張載玻片滴加200μL后用封口膜封片，在37℃下孵育60min，二抗稀釋比例為1∶400)、Wash buffer Ⅱ(在室溫下清洗3次，每次15min).用吸水紙吸干多余的水，在每張載玻片上滴加1滴DAPI染色液，避光染色10min，在顯微鏡(Zeiss Axio Imager A2)下觀察并拍照.

2 結(jié)果與分析

2.1 RFC1的生物信息學(xué)分析

為了分析番茄RFC1基因在進(jìn)化過(guò)程中的保守性，使用MEGA v5.0軟件的ML方法，構(gòu)建了不同物種RFC1的進(jìn)化樹(shù)(圖1，見(jiàn)第626頁(yè)).從中可以看出，除了經(jīng)過(guò)近期基因組重復(fù)的物種(如大豆Glycinemax，猴面花Mimulus； 高粱Sorghum)，大多數(shù)物種中RFC1為單拷貝基因，暗示了RFC1基因功能比較保守.其中番茄與擬南芥RFC1基因都屬于真雙子葉植物，而代表單子葉植物的禾本科則比較遠(yuǎn).這個(gè)模式表明RFC1基因在真核生物的進(jìn)化歷史中基本保持單拷貝，暗示其功能是高度保守的.序列比對(duì)表明番茄和擬南芥RFC1氨基酸序列一致性和相似性分別為62%和74%.運(yùn)用MUSCLE v3.6軟件對(duì)選取不同物種的RFC1蛋白序列比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)植物中RFC1蛋白都具有BRCT結(jié)構(gòu)域(BRCA1 C Terminus(BRCT) domain)、ATPase結(jié)構(gòu)域和RFC結(jié)構(gòu)域(圖2，見(jiàn)第626頁(yè)).BRCT結(jié)構(gòu)域在植物體內(nèi)可解除DNA分子交聯(lián)，推測(cè)具有內(nèi)切酶活性[14]；ATPase結(jié)構(gòu)域是超基因家族含有的ATPase單元[15]，在細(xì)胞內(nèi)途徑中的蛋白重構(gòu)中起作用，通過(guò)水解ATP從而改變分子構(gòu)象；而RFC結(jié)構(gòu)域在體內(nèi)對(duì)RFC1的功能很重要[16].此外，RFC1蛋白的C端有一個(gè)相對(duì)保守區(qū)域，擬南芥中研究表明該結(jié)構(gòu)域可能與其在減數(shù)分裂中的功能有關(guān)[9].

2.2 番茄RFC1在花藥不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)模式分析

基因的表達(dá)模式和功能有一定的相關(guān)性，為了研究SlRFC1的功能，本研究首先分析了SlRFC1的表達(dá)模式.提取野生型番茄六期早期花藥、六期花藥、七期花藥和葉子4個(gè)組織RNA，在番茄RFC1基因前端和末端設(shè)計(jì)引物，利用定量PCR的方法檢測(cè)RFC1在不同組織內(nèi)的表達(dá)量.如圖3所示，SlRFC1基因在檢測(cè)的4個(gè)組織中均有表達(dá)，表明該基因可能是一個(gè)組成型表達(dá)的基因，與擬南芥中的報(bào)道相似[9].此外，SlRFC1在花藥中表達(dá)明顯高于葉子中的表達(dá)量，且在第六期的花藥中表達(dá)最高，該時(shí)期花藥中包含正在進(jìn)行減數(shù)分裂的花粉母細(xì)胞.

2.3 番茄RFC1RNAi載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)基因植株獲得

小鼠和植物中的研究表明RFC1是一個(gè)有絲分裂周期必需的基因，功能缺失突變致死[4，9，17-18]，在擬南芥中有研究利用弱突變體和減數(shù)分裂特異的基因沉默技術(shù)分析了RFC1在減數(shù)分裂重組中的重要功能[9].擬南芥中采用的是編碼減數(shù)分裂特異重組酶DMC1基因的啟動(dòng)子，該基因在真核生物中相對(duì)保守[19]，本研究克隆了番茄的DMC1基因的啟動(dòng)子，并構(gòu)建了含RFC1的RNAi載體.利用農(nóng)桿菌侵染番茄愈傷組織方法，將該載體轉(zhuǎn)入番茄并獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株.并利用定量PCR技術(shù)分析了RFC1在陽(yáng)性植株RFC1RNAi-1、RFC1RNAi-2和RFC1RNAi-3花藥中的表達(dá)量.如圖4所示，在檢測(cè)的3個(gè)不同發(fā)育時(shí)期的花藥中，SlRFC1基因在3個(gè)不同的轉(zhuǎn)基因株系中的表達(dá)量顯著低于對(duì)照(P<0.01).說(shuō)明轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株中目的基因的表達(dá)量確實(shí)得到降低.

2.4 番茄RFC1RNAi陽(yáng)性植株的形態(tài)表型分析

本研究選擇了兩個(gè)代表性的RFC1RNAi-1和RFC1RNAi-3株系進(jìn)行了詳細(xì)分析.觀察RFC1RNAi陽(yáng)性番茄的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，發(fā)現(xiàn)RFC1RNAi-1和RFC1RNAi-3植株的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)與野生型類似(圖5(a)，見(jiàn)第628頁(yè))，具有健康的葉子、莖和旺盛的長(zhǎng)勢(shì)，與擬南芥中的結(jié)果類似[9].這說(shuō)明RFC1RNAi轉(zhuǎn)基因并沒(méi)有影響到體細(xì)胞中的DNA復(fù)制和其他過(guò)程，同時(shí)也暗示番茄的DMC1基因可能也是減數(shù)分裂細(xì)胞特異表達(dá)的基因.為了進(jìn)一步研究RFC1RNAi植株的育性是否正常，運(yùn)用亞歷山大紅染色檢測(cè)了對(duì)照和轉(zhuǎn)基因植物的花粉活性.如圖5(b)所示，野生型花粉粒大小均勻，均能染成紅色，表明花粉均有活力.相對(duì)之下，RFC1RNAi-1和RFC1RNAi-3只有少量的花粉可以染成紅色，大部分染成藍(lán)色，表明只有少量有活力的花粉(圖5(b)).為了進(jìn)一步調(diào)查花粉育性下降的原因，本實(shí)驗(yàn)首先運(yùn)用卡寶品紅溶液染色減數(shù)分裂的直接產(chǎn)物四分體，發(fā)現(xiàn)野生型中能夠觀察到4個(gè)均勻的小孢子(圖5(c))，而轉(zhuǎn)基因植株中觀察到有多分體(多于4個(gè)小孢子)現(xiàn)象，且產(chǎn)生了極小的異常小孢子(圖5(c))，表明轉(zhuǎn)基因植物中的減數(shù)分裂過(guò)程存在異常.

2.5 番茄RFC1RNAi植株花粉母細(xì)胞的減數(shù)分裂染色體形態(tài)觀察

為了研究RFC1RNAi植株減數(shù)分裂在哪個(gè)時(shí)期出現(xiàn)異常，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)染色體展片并用DAPI染色觀察減數(shù)分裂過(guò)程中的染色體形態(tài).如圖6所示，野生型和RFC1RNAi植株的染色體形態(tài)從細(xì)線期到雙線期觀察不到明顯的異常.終變期野生型番茄中可以形成12個(gè)二價(jià)體，而RFC1RNAi植株中不能形成典型的二價(jià)體，有多于兩條染色體相互纏繞的現(xiàn)象(圖6(a))，該表型類似于擬南芥rfc1突變體中觀察到的多價(jià)體[9].中期Ⅰ時(shí)，野生型番茄中二價(jià)體在紡錘體的牽引下，并列排列在細(xì)胞的赤道板上(圖6(b))；而在RFC1RNAi減數(shù)分裂細(xì)胞中，部分染色體看似正常二價(jià)體，在紡錘體的牽引下排列在赤道板上(圖6(b))，但是其他染色體為多價(jià)體，則不能很好地排列在赤道板上，彼此間相互牽連；另外，RFC1RNAi減數(shù)分裂細(xì)胞中有單價(jià)體現(xiàn)象.這些結(jié)果表明番茄RFC1是正常同源二價(jià)體形成所必需.

2.6 番茄RFC1RNAi-3植株中聯(lián)會(huì)復(fù)合體中央元件ZYP1定位分析

擬南芥的研究表明，rfc1-2突變體中聯(lián)會(huì)局部異常，主要表現(xiàn)粗線期染色體局部觀察不到聯(lián)會(huì)中央元件ZYP1的信號(hào)[9].本研究運(yùn)用ZYP1的抗體進(jìn)行免疫熒光實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示野生型同源染色體在粗線期完全聯(lián)會(huì)，ZYP1的信號(hào)與染色體的完全重合(圖7).與野生型相比，RFC1RNAi-3植株該時(shí)期染色體上的ZYP1蛋白定位觀察不到明顯的異常(圖7)，表明番茄RFC1的功能降低可能沒(méi)有影響到同源染色體之間的聯(lián)會(huì).由于RFC1RNAi植物中仍有部分RFC1蛋白的存在，也許剩余RFC1仍能提供維護(hù)聯(lián)會(huì)的功能.

2.7 番茄RFC1RNAi植株中γH2AX蛋白質(zhì)的定位分析

番茄RFC1RNAi植株中多價(jià)體現(xiàn)象暗示著重組異常，擬南芥的研究表明RFC1突變影響了正常重組的修復(fù)進(jìn)程[9，18].減數(shù)分裂重組起始于DNA雙鏈的斷裂(Double Strand Break， DSB)[20]，磷酸化的組蛋白變體γH2AX可以用來(lái)指示斷裂的DSB[21]，而且該蛋白高度保守，不同植物間的同源蛋白具有相通的抗原性.本實(shí)驗(yàn)室前期研究制備了可以檢驗(yàn)擬南芥γH2AX的多克隆抗體.本實(shí)驗(yàn)利用免疫熒光技術(shù)觀察了γH2AX蛋白質(zhì)在野生型和RFC1RNAi-3植株染色體上的分布情況.已有的研究表明，DSB一般在細(xì)線期或偶線期過(guò)渡時(shí)期形成，粗線期基本完全修復(fù).如圖8(見(jiàn)第630頁(yè))所示，偶線期時(shí)，野生型和RFC1RNAi-3中該蛋白的定位沒(méi)有顯著差異，說(shuō)明RFC1RNAi-3中能夠形成正常的DSB，暗示了重組沒(méi)有受到明顯影響.粗線期時(shí)，由于DSB基本完全修復(fù)，野生型中γH2AX信號(hào)顯著降低(圖8)，而RFC1RNAi-3植株γH2AX信號(hào)繼續(xù)存在，其降低明顯滯后，暗示DSB的修復(fù)進(jìn)程延遲了.

3 討 論

RFC1基因在多數(shù)真核生物中為單拷貝，序列也高度保守，但它在絕大部分物種中的功能還沒(méi)有被研究過(guò).因?yàn)槠湓谟薪z分裂DNA復(fù)制中具有重要功能.酵母、植物和動(dòng)物中，RFC復(fù)合體的亞基突變，經(jīng)常會(huì)導(dǎo)致有絲分裂時(shí)期的細(xì)胞死亡，阻礙了研究這些基因在減數(shù)分裂中的功能[4，9，17-18，22].前期通過(guò)尋找弱突變材料，并結(jié)合減數(shù)分裂特異的基因沉默技術(shù)，在擬南芥中研究了RFC1和另外一個(gè)DNA聚合酶POL2A在減數(shù)分裂重組中的重要功能[9，15，20].番茄是茄科植物，和十字花科的擬南芥分別屬于真雙子葉兩個(gè)最大的分支，因此，分析RFC1在番茄減數(shù)分裂中的功能可以拓展對(duì)其功能保守性的認(rèn)識(shí).本研究利用和擬南芥一樣的減數(shù)分裂特異基因沉默技術(shù)，分析了番茄RFC1同源基因在減數(shù)分裂的功能.結(jié)果表明降低RFC1的表達(dá)，會(huì)影響植物的育性、產(chǎn)生多價(jià)體，及延遲了DSB的修復(fù)等，與擬南芥中rfc1突變體的表型相似，說(shuō)明番茄和擬南芥RFC1基因在減數(shù)分裂中的功能相對(duì)保守.

但是，擬南芥中的研究表明突變體在粗線期有局部不能聯(lián)會(huì)的現(xiàn)象，其原因可能是由于有些干涉敏感性的交換途徑形成受阻.番茄中的ZYP1免疫熒光結(jié)果沒(méi)有看到類似的情況，其原因其一可能是該轉(zhuǎn)基因植物還保留了部分RFC1功能，定量PCR結(jié)果也證明轉(zhuǎn)基因植物中仍然有少量RFC1的轉(zhuǎn)錄.另外一個(gè)原因可能是番茄和擬南芥在本身染色體結(jié)構(gòu)上有差異.番茄的減數(shù)分裂研究很少，目前存在很多疑問(wèn)；比如，還不清楚番茄減數(shù)分裂細(xì)胞一次能夠形成多少個(gè)DSB，有多少個(gè)DSB最終形成了交換，番茄和擬南芥聯(lián)會(huì)的機(jī)制是否有異同等.最近研究表明，與擬南芥相比，模式單子葉植物水稻有其特異的聯(lián)會(huì)復(fù)合體元件，有些元件的功能有分化，如水稻的聯(lián)會(huì)復(fù)合體中央元件ZEP1的突變反而增加重組頻率[23].總之，本研究首次分析了番茄RFC1基因在減數(shù)分裂中的重要功能，進(jìn)而表明該基因的功能在進(jìn)化距離較遠(yuǎn)的不同物種中依然非常保守.

致謝: 感謝福建農(nóng)林大學(xué)張亮生教授在進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建上給予的幫助.

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LIU Jing1，#， WANG Ying1，#， WANG Hongkuan1， NI’Di’an2， MA Hong1， WANG Yingxiang1

(1. Institute of Plant Biology， School of Life Sciences， Fudan University， Shanghai 200438， China；2.TheEcologicalTechniqueandEngineeringCollege，ShanghaiInstituteofTechnology，Shanghai201418，China)

Meiosis is essential for eukaryotic sexual reproduction. Previous study showed thatArabidopsisRFC1 is required for normal meiotic recombination， but the role of its homologs in other species has not been reported. To study the tomato RFC1 homologue in meiosis， theinvivofunction ofSlRFC1 was investigated by silencing theSlRFC1 gene using a meiosis-specific DMC1 promoter in transgenic RFC1RNAiplants. Phenotypic analysis found that RFC1RNAiplants have obviously reduce pollen viability and fertility， and are abnormal in meiosis. Comparison of chromosome morphology of WT and RFC1RNAimeiocytes using chromosome spread with DAPI staining showed that， unlike wild type diakinesis and metaphaseⅠmeiocytes with 12 bivalents(pairs of associated homologous chromosomes)， the RFC1RNAimeiocytes formed multivalents at similar stages， indicating non-homologous association. Immunolocalization of DNA double stranded break(DSB) marker γH2AX showed persistent signals in RFC1RNAipachytene chromosomes compared with WT， providing further evidence for abnormal recombination in RFC1RNAi. In conclusion， this is the first time that the tomato DNA replication factor RFC1 is shown to be required for meiotic recombination， using meiosis-specific gene silencing. SinceArabidopsisand tomato belong to two difference clades of Rosids and Asterids among eudicots， respectively， our results also reveal the RFC1 function in meiotic recombination is conserved in meiosis among evolutionarily different angiosperm species.

meiosis； DNA replication factor；Solanumlycopersicum； meiotic specific RNAi

0427-7104(2016)05-0623-09

2016-01-30

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(31570314)；荷蘭Rijk Zwaan種業(yè)公司項(xiàng)目

劉 靜(1989—)，女，碩士研究生；#：同等貢獻(xiàn)；王應(yīng)祥，男，研究員，通訊聯(lián)系人，E-mail：yx_wang@fudan.edu.cn.

Q 5

A