GM6001對(duì)糖皮質(zhì)激素性股骨頭壞死大鼠骨組織功能及骨代謝指標(biāo)的影響

蘆敏慧 李 鵬 徐治平

(武漢市普愛醫(yī)院，湖北 武漢 430034)

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GM6001對(duì)糖皮質(zhì)激素性股骨頭壞死大鼠骨組織功能及骨代謝指標(biāo)的影響

蘆敏慧 李 鵬 徐治平

(武漢市普愛醫(yī)院，湖北 武漢 430034)

目的 探討靜脈注射基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑GM6001對(duì)糖皮質(zhì)激素性股骨頭壞死(SINFH)大鼠骨組織功能及骨代謝指標(biāo)的影響。結(jié)果 采用健康SD大鼠臀肌注射甲基潑尼松龍制備SINFH模型，將72只模型大鼠隨機(jī)分為SINFH組，低劑量GM6001(GM6001-L)組和高劑量GM6001(GM6001-H)組。GM6001-L組和GM6001-H組在造模同時(shí)經(jīng)尾靜脈注射50、100 mg/kg，1次/w，連續(xù)8 w。另取24只正常SD大鼠于臀肌注射相同劑量生理鹽水作對(duì)照。分別于造模2、4、6、8 w檢測(cè)各組血清磷、血清鈣水平，檢測(cè)造模8 w的血清骨代謝指標(biāo)〔骨堿性磷酸酶(BALP)、骨鈣素(BGP)、破骨細(xì)胞型抗酒石酸酸性磷酸酶(StrACP)和降鈣素(CT)〕水平，采用雙能X線骨密度測(cè)定儀檢測(cè)造模8 w的股骨轉(zhuǎn)子及股骨頭的骨密度，通過股骨頭形態(tài)學(xué)觀察計(jì)數(shù)視野內(nèi)成骨細(xì)胞數(shù)與破骨細(xì)胞數(shù)。結(jié)果 與對(duì)照組相比，SINFH組的血清鈣磷、BGP、CT、股骨轉(zhuǎn)子和股骨頭的骨密度及股骨頭成骨細(xì)胞計(jì)數(shù)均降低，而BALP水平及StrACP活性均和破骨細(xì)胞均升高(P<0.05)；GM6001可升高SINFH大鼠的血清鈣磷、BGP、CT水平、股骨頭成骨細(xì)胞計(jì)數(shù)及股骨轉(zhuǎn)子和股骨頭的骨密度，降低BALP水平及StrACP活性均和破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)，與SINFH組和對(duì)照組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；GM6001-H組的以上指標(biāo)均優(yōu)于GM6001-L組(P<0.05)。結(jié)論 GM6001可改善SINFH大鼠的血清鈣磷和骨代謝指標(biāo)水平并升高股骨骨密度，抑制MMP活性在糖皮質(zhì)激素性所致股骨頭壞死中有較好的防治價(jià)值。

GM6001；糖皮質(zhì)激素性股骨頭壞死；骨組織功能；骨代謝指標(biāo)

隨著臨床上糖皮質(zhì)激素的廣泛應(yīng)用，糖皮質(zhì)激素性股骨頭壞死(SINFH)的發(fā)生率逐年升高，臨床上目前缺乏有效的治療手段〔1〕。SINFH不僅會(huì)造成患者疼痛及功能障礙，甚至?xí)?dǎo)致終生殘疾〔2〕?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是參與降解包括骨在內(nèi)的全身各種組織細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白酶家族〔3〕。目前已證實(shí)MMPs不僅參與了組織發(fā)育修復(fù)、炎癥反應(yīng)及腫瘤發(fā)生發(fā)展，而且與激素性骨壞死的發(fā)生有關(guān)〔4,5〕。多種藥物可通過抑制MMP活性發(fā)揮對(duì)SINFH的治療作用〔6,7〕，但直接采用MMP抑制劑治療SINFH的效果目前尚未報(bào)道。本研究擬探討MMP抑制劑GM6001對(duì)SINFH大鼠骨組織功能及骨代謝指標(biāo)的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 GM6001購(gòu)自美國(guó)Chemicon公司，甲基潑尼松龍購(gòu)自美國(guó)Pfizer公司，骨鈣素(BGP)酶免試劑盒、骨堿性磷酸酶(BALP)酶免試劑盒購(gòu)自美國(guó)ADL公司，降鈣素(CT)、抗酒石酸酸性磷酸酶(StrACP)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2 動(dòng)物與分組 采用2月齡雄性SD大鼠(體重280～320 g)臀肌注射甲基潑尼松龍注射液制備SINFH模型，20 mg/kg左右臀大肌交替注射，1次/w，共8 w。將72只模型大鼠隨機(jī)分為SINFH組，低劑量GM6001(GM6001-L)組和高劑量GM6001(GM6001-H)組(n=24)。GM6001-L組和GM6001-H組在造模同時(shí)經(jīng)尾靜脈注射50、100 mg/kg，1次/w，連續(xù)8 w。另取24只正常SD大鼠于臀肌注射相同劑量生理鹽水作對(duì)照。本實(shí)驗(yàn)所用大鼠均購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房中，濕度控制在60%～70%，室溫為(22±1)℃，照明晝夜明暗交替時(shí)間為12∶12。

1.3 血清鈣磷檢測(cè) 每組各選取6只大鼠，于造模后2、4、6、8 w清晨空腹?fàn)顟B(tài)下心臟采血，每只大鼠取血5 ml，3 000 r/min離心15 min，分離血清，-80℃保存?zhèn)溆?，采用全自?dòng)生化儀檢測(cè)以上血清樣本的鈣、磷水平。

1.4 血清骨代謝指標(biāo)檢測(cè) 每組各選取6只大鼠，血清采集和處理同1.3，采用酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)(BALP)、BGP和CT活性，采用比色法檢測(cè)StrACP活性，以上操作完全遵守試劑盒說明書。

1.5 骨密度檢測(cè) 每組各選取6只大鼠，處死后取雙側(cè)股骨頭備用，采用雙能X線骨密度測(cè)定儀檢測(cè)活體股骨頭及股骨轉(zhuǎn)子間骨密度。

1.6 股骨頭形態(tài)學(xué)觀察 每組各選取6只大鼠，取兔雙側(cè)股骨頭沿其冠狀面正中鋸開，4%中性甲醛固定24 h行脫鈣處理，脫水12 h后石蠟包埋切片，常規(guī)蘇木精-伊紅染色后光鏡下觀察。每張切片在400倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)視野內(nèi)成骨細(xì)胞數(shù)與破骨細(xì)胞數(shù)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件。兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用單因素分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血清鈣磷水平比較 與對(duì)照組相比，SINFH組大鼠造模2、4、6和8 w的血清鈣磷水平降低(P<0.05)；除低劑量GM6001治療2 w外，SINFH大鼠經(jīng)GM6001治療后以上時(shí)間點(diǎn)的血清鈣水平均升高，與SINFH組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；SINFH大鼠經(jīng)GM6001治療后以上時(shí)間點(diǎn)的血清磷水平均升高，與SINFH組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；GM6001-H組以上時(shí)間點(diǎn)的血清鈣磷水平均高于GM6001-L組(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血清鈣磷水平比較

與對(duì)照組比較：1)P<0.05；與SINFH組比較：2)P<0.05；與GM6001-L組比較：3)P<0.05；下表同

2.2 各組大鼠的血清骨代謝指標(biāo)水平比較 與對(duì)照組相比，SINFH組大鼠的BALP水平及StrACP活性均升高，BGP和CT水平均降低(P<0.05)；SINFH大鼠經(jīng)GM6001治療后的BALP水平及StrACP活性均降低，BGP和CT水平均升高，與SINFH組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；GM6001-H組的BALP、BGP、StrACP和CT水平均優(yōu)于GM6001-L組(P<0.05)。見表2。

2.3 各組大鼠的股骨骨密度及股骨頭細(xì)胞計(jì)數(shù)比較 與對(duì)照組相比，SINFH組大鼠股骨轉(zhuǎn)子及股骨頭的骨密度及股骨頭成骨細(xì)胞計(jì)數(shù)均降低，而破骨細(xì)胞升高(P<0.05)；SINFH大鼠經(jīng)GM6001治療后的股骨轉(zhuǎn)子及股骨頭的骨密度均升高，成骨細(xì)胞計(jì)數(shù)升高，而破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)降低與SINFH組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；GM6001-H組的股骨轉(zhuǎn)子及股骨頭的骨密度股骨頭成骨細(xì)胞計(jì)數(shù)和骨細(xì)胞計(jì)數(shù)均高于GM6001-L組(P<0.05)。見表2，表3。

表2 各組大鼠的血清骨代謝指標(biāo)及骨密度水平比較±s,n=24)

表3 各組大鼠骨細(xì)胞計(jì)數(shù)

3 討 論

SINFH是一種臨床常見的醫(yī)源性疾病，長(zhǎng)期大量糖皮質(zhì)激素可增加破骨細(xì)胞數(shù)量及活性，加重骨吸收，同時(shí)通過抑制成骨細(xì)胞功能減少膠原的合成〔8〕。SINFH目前已被人們廣泛關(guān)注，臨床治療不理想，而股骨頭修復(fù)過程緩慢增加了治療難度〔9〕。因此，采取有效手段促進(jìn)壞死區(qū)骨組織功能恢復(fù)正常是治療SINFH的關(guān)鍵。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)MMPs在SINFH發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，如MMPs不僅促進(jìn)了破骨細(xì)胞的活化，而且參與了被活化破骨細(xì)胞向礦化骨表面的遷移和貼附過程〔10〕。故采用MMP抑制劑GM6001治療SINFH有一定的可行性。

血中鈣磷水平受多個(gè)因子的調(diào)節(jié)，兩者水平變化與骨吸收及骨重建關(guān)系密切〔11〕。BALP被視為成骨細(xì)胞成熟的早期標(biāo)志，與骨礦化關(guān)系密切，可為機(jī)體提供充足的無(wú)機(jī)磷來(lái)合成骨鹽結(jié)晶，發(fā)揮骨的礦化作用〔12〕。血清中的BGP來(lái)源于成骨細(xì)胞，其水平升高利于骨形成，且BGP變化靈敏，因而可直接反映代表骨代謝瞬間變化〔13〕。StrACP主要來(lái)源于破骨細(xì)胞，從破骨細(xì)胞分泌入血，可作為反映骨吸收的一個(gè)指標(biāo)〔14〕。本研究結(jié)果顯示SINFH大鼠出現(xiàn)了嚴(yán)重骨功能異常及骨代謝紊亂，而經(jīng)GM6001治療后以上指標(biāo)獲改善，表明通過GM6001抑制MMP活性可起到改善SINFH伴有的骨功能異常及骨代謝紊亂。GM6001高劑量的改善效果優(yōu)于低劑量，表明GM6001的濃度對(duì)其改善SINFH的效果有一定影響。

此外，鈣磷為骨的主要成分，對(duì)于保持骨的力學(xué)強(qiáng)度有重要作用，同時(shí)可用于維持體內(nèi)礦物質(zhì)平衡〔12〕。而GM6001提高SINFH大鼠的血清鈣磷水平對(duì)于促進(jìn)新骨形成有一定作用。本研究觀察GM6001對(duì)SINFH大鼠股骨的骨密度影響發(fā)現(xiàn)，經(jīng)GM6001處理后SINFH大鼠降低的股骨骨密度獲得升高，為GM6001改善SINFH提供直接證據(jù)。成骨細(xì)胞凋亡和破骨細(xì)胞激活是SINFH的最早期病理變化〔15〕。本研究發(fā)現(xiàn)GM6001可促進(jìn)SINFH大鼠股骨細(xì)胞成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)并抑制破骨細(xì)胞的活化，這可能是其改善SINFH的基本方式之一。

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〔2015-11-17修回〕

(編輯 徐 杰)

蘆敏慧(1975-)，女，主管護(hù)師，主要從事骨科臨床研究。

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A

1005-9202(2016)19-4699-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.19.011