Nrf2通路在天麻素抑制油酸誘導(dǎo)的HL-7702細(xì)胞氧化應(yīng)激中的作用

曲麗麗 于濱 孔維佳

1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所，北京100050；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所，北京100050

Nrf2通路在天麻素抑制油酸誘導(dǎo)的HL-7702細(xì)胞氧化應(yīng)激中的作用

曲麗麗1于濱2孔維佳2

1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所，北京100050；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所，北京100050

目的研究核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）在天麻素（GSTD）抑制油酸（OA）誘導(dǎo)的肝細(xì)胞氧化應(yīng)激中的作用。方法體外培養(yǎng)HL-7702細(xì)胞，以Nrf2特異性的小干擾RNA（siRNA）轉(zhuǎn)染細(xì)胞以沉默其表達(dá)，以濃度為100μg/mL的GSTD處理細(xì)胞24 h后提取細(xì)胞總蛋白以及核、質(zhì)蛋白，以免疫印跡法檢測(cè)Nrf2和血紅素加氧酶-1（HO-1）的表達(dá)水平。在抗氧化實(shí)驗(yàn)中，Nrf2 siRNA轉(zhuǎn)染后以濃度為0.6 mmol/L的OA與GSTD共同處理細(xì)胞24 h，以試劑盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）的活性以及活性氧簇（ROS）和丙二醛（MDA）的含量。結(jié)果與對(duì)照組細(xì)胞比較，Nrf2 siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后Nrf2總蛋白、細(xì)胞核內(nèi)Nrf2蛋白和HO-1蛋白的基礎(chǔ)表達(dá)水平均顯著下降（P< 0.01）。與對(duì)照組細(xì)胞比較，GSTD使細(xì)胞核內(nèi)Nrf2蛋白和HO-1蛋白的表達(dá)水平分別平均增加約90.2%和80.3%（P<0.01）。與單用GSTD處理的細(xì)胞比較，GSTD促進(jìn)Nrf2蛋白細(xì)胞核轉(zhuǎn)位和上調(diào)HO-1表達(dá)的作用能被Nrf2 siRNA完全阻斷（P<0.001）。與對(duì)照組細(xì)胞比較，OA處理后可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激（P<0.01）；與單加OA的細(xì)胞比較，GSTD與OA共同處理細(xì)胞后能使SOD的活力顯著增加，ROS和MDA的水平顯著下降（P<0.01）；與OA+GSTD組細(xì)胞比較，GSTD的抗氧化作用能被Nrf2 siRNA完全阻斷（P<0.001）。結(jié)論Nrf2通路在GSTD抑制OA誘導(dǎo)的HL-7702細(xì)胞氧化應(yīng)激的活性中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

天麻素；核因子E2相關(guān)因子2；基因沉默；油酸；氧化應(yīng)激

天麻素（gastrodin，GSTD）是中藥天麻（Gastrodia elata Bi.）的主要有效成分之一，目前在臨床上主要用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病如癲癇、頭痛等的治療[1]。筆者實(shí)驗(yàn)室前期的研究工作發(fā)現(xiàn)天麻和GSTD具有降血脂、降血糖和改善肝臟脂肪變性的藥理學(xué)作用[2-9]。肝細(xì)胞的脂肪變性是非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）的最主要病理學(xué)特點(diǎn)。在NAFLD的發(fā)生和發(fā)展過程中，氧化應(yīng)激起著非常關(guān)鍵的作用[10]。筆者實(shí)驗(yàn)室近期研究發(fā)現(xiàn)，GSTD在NAFLD的體內(nèi)外模型中均可顯著抑制氧化應(yīng)激[11]。GSTD可通過腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）依賴的方式來激活肝細(xì)胞中的核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）通路，促進(jìn)Nrf2的細(xì)胞核轉(zhuǎn)位[11]。Nrf2是一種抗氧化轉(zhuǎn)錄因子，被激活后能進(jìn)入細(xì)胞核，促進(jìn)其靶基因如血紅素加氧酶-1（HO-1）的表達(dá)，從而發(fā)揮抗氧化作用[12-13]。筆者實(shí)驗(yàn)室上述的研究工作闡明了AMPK在GSTD的抗氧化活性中所發(fā)揮的關(guān)鍵作用，但Nrf2的作用仍需進(jìn)一步確證。本研究以Nrf2特異性的小干擾RNA（siRNA）來沉默其表達(dá)，并觀察對(duì)GSTD抗氧化藥效的影響。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

GSTD購(gòu)自浙江誠(chéng)意藥業(yè)有限公司，批號(hào)20120509，純度逸98%。油酸（OA）和牛血清白蛋白（BSA）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。胎牛血清（FBS）、DMEM培養(yǎng)基、非必需氨基酸、1%雙抗（青霉素與鏈霉素）購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司。人源的Nrf2 siRNA購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；X-treme Gene siRNA Transfection Reagent購(gòu)自美國(guó)R&D公司；Opti-MEMR培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Invetrogen公司。M-PERRMammalian蛋白裂解液、HaltR蛋白酶&磷酸酶雙重抑制劑、細(xì)胞核質(zhì)蛋白分離提取試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司。Nrf2、HO-1、茁-肌動(dòng)蛋白（ACTB）、組蛋白H3（histone H3）的單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司。PVDF膜購(gòu)自美國(guó)Millipore公司。總超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測(cè)試劑盒、丙二醛（MDA）檢測(cè)試劑盒和活性氧（ROS）檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)HL-7702細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10% FBS、1%非必需氨基酸和雙抗（100 U/mL青霉素+ 100 U/m L鏈霉素）的DMEM培養(yǎng)基中，在37毅C含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每次實(shí)驗(yàn)前將細(xì)胞按2伊105個(gè)/孔接種至6孔板，待長(zhǎng)至70%~80%滿時(shí)，換成無血清培養(yǎng)基，饑餓24 h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 si RNA沉默實(shí)驗(yàn)用X-treme Gene siRNA Transfection Reagent按照試劑盒說明，將Nrf2 siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染6 h后，棄去原培養(yǎng)基，換為含10% FBS的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，細(xì)胞饑餓后進(jìn)行相應(yīng)處理。

1.2.3 藥物處理GSTD以滅菌生理鹽水溶解，濃度為10mg/mL，以DMEM培養(yǎng)基稀釋100倍后（100μg/mL）處理細(xì)胞，時(shí)間為24 h。OA以滅菌磷酸緩沖鹽溶液（PBS）+5%BSA溶解，制備成濃度為6 mmol/L的儲(chǔ)備液，分裝后-20益保存。在GSTD的抗氧化實(shí)驗(yàn)中，OA以DMEM培養(yǎng)基稀釋10倍（0.6 mmol/L）后與GSTD共同處理細(xì)胞24 h。實(shí)驗(yàn)中每個(gè)處理孔重復(fù)3~4次。

1.2.4 免疫印跡實(shí)驗(yàn)使用相應(yīng)試劑盒按照說明書要求提取細(xì)胞總蛋白或分離細(xì)胞核質(zhì)蛋白；蛋白定量后，使用含30μg蛋白的樣品以10%分離膠進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳。參考文獻(xiàn)[11]，依次轉(zhuǎn)膜、封閉、與一抗孵育、洗膜后再與二抗孵育并顯色、定量。細(xì)胞總蛋白及細(xì)胞質(zhì)蛋白中目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平以ACTB為內(nèi)參，細(xì)胞核中目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平以histone H3為內(nèi)參，校正后以對(duì)照組細(xì)胞的倍數(shù)表示。

1.2.5 細(xì)胞內(nèi)SOD、ROS、MDA含量檢測(cè)分別使用相應(yīng)試劑盒，按照說明書并參考文獻(xiàn)[12]測(cè)定細(xì)胞內(nèi)的SOD活力、ROS水平以及MDA含量。上述指標(biāo)以樣品中的蛋白濃度為參照進(jìn)行校正后以對(duì)照組細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)（%）表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)依標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Newman-Keuls檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Nrf2 siRNA阻斷GSTD對(duì)Nrf2通路的激活作用

本研究以特異性siRNA沉默Nrf2表達(dá)，觀察其對(duì)GSTD激活Nrf2通路的影響。結(jié)果如圖1所示，與對(duì)照組細(xì)胞比較，Nrf2 siRNA轉(zhuǎn)染HL-7702細(xì)胞后Nrf2總蛋白的基礎(chǔ)表達(dá)水平顯著降低（P<0.01）；相應(yīng)地，其靶基因HO-1的基礎(chǔ)表達(dá)水平也被顯著抑制（P<0.01），證明Nrf2 siRNA有效地沉默了Nrf2基因的表達(dá)。

與對(duì)照組細(xì)胞比較，Nrf2 siRNA沉默Nrf2的表達(dá)后，使細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中Nrf2蛋白的基礎(chǔ)水平顯著下降（P<0.01）。見圖2。單用GSTD處理細(xì)胞不影響Nrf2總蛋白的水平（圖1），但可顯著增加其細(xì)胞核轉(zhuǎn)位平均約90.2%，從而使其在細(xì)胞質(zhì)中的濃度下降平均約55.0%，與對(duì)照細(xì)胞組比較差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見圖2。重要的是，本研究發(fā)現(xiàn)GSTD增加Nrf2蛋白細(xì)胞核轉(zhuǎn)位的作用能夠被Nrf2 siRNA所完全阻斷，與單加GSTD處理的細(xì)胞比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），見圖2。相應(yīng)地，GSTD上調(diào)HO-1蛋白表達(dá)（平均約80.3%）的作用也被Nrf2 siRNA完全阻斷，與單加GSTD處理的細(xì)胞比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），見圖1。

圖1 Nrf2 siRNA對(duì)HL-7702細(xì)胞Nrf2/HO-1表達(dá)及GSTD上調(diào)HO-1作用的影響

圖2 Nrf2 siRNA對(duì)Nrf2蛋白細(xì)胞核轉(zhuǎn)位的影響

2.2 Nrf2 siRNA阻斷GSTD抑制OA誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激作用

結(jié)果如圖3所示，OA處理后可誘導(dǎo)HL-7702細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激，表現(xiàn)為SOD活力的顯著下降，ROS和MDA水平的顯著增加，與對(duì)照組細(xì)胞比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。Nrf2 siRNA轉(zhuǎn)染后導(dǎo)致OA誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激進(jìn)一步惡化，表現(xiàn)為SOD活力的進(jìn)一步下降，MDA和ROS水平進(jìn)一步增加，與單加OA的細(xì)胞比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這些結(jié)果與Nrf2 siRNA減少Nrf2和HO-1的基礎(chǔ)表達(dá)水平的作用相一致。

與筆者之前的報(bào)道相一致[11]，GSTD顯著抑制OA誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，使細(xì)胞中SOD的活力恢復(fù)到接近正常，而ROS和MDA的水平顯著下降，與單加OA的細(xì)胞比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。重要的是，GSTD的抗氧化活性被Nrf2 siRNA轉(zhuǎn)染所完全阻斷，與OA+GSTD組細(xì)胞比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。見圖3。表明siRNA的沉默結(jié)果證明Nrf2通路在GSTD的抗氧化活性中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

圖3 Nrf2 siRNA對(duì)GSTD抗氧化活性的影響

3 討論

Nrf2是細(xì)胞中重要的抗氧化分子，目前認(rèn)為，其也是治療代謝性疾病如糖尿病、NAFLD、肥胖癥等的重要潛在靶點(diǎn)[12-13]。本研究發(fā)現(xiàn)其在GSTD的抗氧化活性中發(fā)揮關(guān)鍵作用。本研究使用了基因沉默的方法，結(jié)果首次發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞中Nrf2的表達(dá)被抑制以后阻斷了GSTD刺激其蛋白細(xì)胞核轉(zhuǎn)位的作用以及對(duì)其靶基因HO-1的上調(diào)作用，進(jìn)而抑制了GSTD的抗氧化活性。

筆者之前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GSTD處理HL-7702細(xì)胞后不增加Nrf2總蛋白的表達(dá)水平，但能夠顯著促進(jìn)其細(xì)胞核轉(zhuǎn)位[11]，本文的結(jié)果再次證明了這一點(diǎn)。與本文的結(jié)果相對(duì)照，有研究報(bào)道GSTD在神經(jīng)細(xì)胞中能顯著上調(diào)Nrf2 mRNA和蛋白的表達(dá)水平從而發(fā)揮抗氧化作用[14]。此發(fā)現(xiàn)從一個(gè)側(cè)面支持了本文的結(jié)論，并提示GSTD在不同的組織中對(duì)Nrf2有不同的調(diào)控作用。在下一步的實(shí)驗(yàn)中，將使用Nrf2的表達(dá)載體對(duì)其在肝細(xì)胞中進(jìn)行過表達(dá)，觀察對(duì)GSTD的抗氧化活性是否有促進(jìn)作用，以進(jìn)一步確認(rèn)該分子在GSTD藥理活性中的關(guān)鍵作用。

除了抗氧化活性，Nrf2還具有細(xì)胞保護(hù)和抗纖維化的作用[15]。文獻(xiàn)報(bào)道GSTD對(duì)神經(jīng)細(xì)胞和肝細(xì)胞都有保護(hù)作用[16-18]，還能顯著抑制飲食誘導(dǎo)[11]或膽管結(jié)扎[19-20]誘發(fā)的大鼠肝纖維化。GSTD的肝保護(hù)和抑制肝纖維化的作用是否也與Nrf2通路的激活有關(guān)值得深入研究。

綜上所述，本文的研究結(jié)果證明，植物來源的天然產(chǎn)物GSTD通過激活肝細(xì)胞中的Nrf2通路來抑制OA誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。結(jié)合筆者實(shí)驗(yàn)室之前的研究結(jié)果[11]，提示GSTD未來可開發(fā)用于治療NAFLD以抑制氧化應(yīng)激，延緩NAFLD的病情進(jìn)展。

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Effects of Nrf2 pathway in the activity of gastrodin in suppressing oleic acid-induced oxidative stress in HL-7702 cells

QU Lili1YU Bin2KONGWeijia2
1.Institute of Materia Medica,Chinese Academy of Medical Sciences,Beijing 100050,China;2.Institute of Medicinal Biotechnology,Chinese Academy of Medical Sciences,Beijing 100050,China

Objective To investigate the role of nuclear factor erythroid-2-related factor-2(Nrf2)in the activity of gas-trodin(GSTD)in suppressing oleic acid-(OA-)induced oxidative stress in hepatocytes.Methods HL-7702 cells were cultured in vitro,small interfering RNA(siRNA)specific for Nrf2 was used to transfect the cells in order to silence its expression.GSTD at a concentration of 100μg/mL was used to treat the cells for 24 h;cell total proteins,nuclear and cytoplasmic proteins were extracted for Western blot analysis of the expression levels of Nrf2 and heme oxygenase-1 (HO-1).In the antioxidant experiments,cells were treated with 0.6 mmol/L of OA together with GSTD for 24 h after Nrf2 siRNA transfection.Intracellular superoxide dismutase(SOD)activity,reactive oxygen species(ROS)andmalondi-aldehyde(MDA)levelswere determined by kits.Results Compared with the control cells,after the transfection of Nrf2 siRNA,the cellular baseline expression levels of total Nrf2,nuclear Nrf2 and HO-1 proteins declined greatly(P< 0.01).Compared with the control cells,GSTD increased the nuclear Nrf2 protein and HO-1 protein levels averagely by 90.2%and 80.3%,respectively(P<0.01).Compared with cells treated with GSTD alone,the stimulating activities of GSTD on the nuclear translocation of Nrf2 protein and the expression of HO-1 were totally blocked by Nrf2 siRNA (P<0.001).Compared with the control cells,the cells developed oxidative stress after the administration of OA(P< 0.01).Compared with cells treated with OA alone,when GSTD was co-administered with OA,the SOD activity in-creased but the levels of ROS and MDA decreased greatly in HL-7702 cells(P<0.01).Compared with cells treated with OA+GSTD,the antioxidant activity of GSTD could be blocked by Nrf2 siRNA completely(P<0.001).Conclusion The Nrf2 pathway plays a critical role for the activity of GSTD in suppressing OA-induced oxidative stress in HL-7702 cells.

Gastrodin;Nuclear factor erythroid-2-related factor-2;Gene silencing;Oleic acid;Oxida-tive stress

R965

A

1673-7210（2016）07（a）-0010-04

院2016-04-02本文編輯院程銘）

曲麗麗（1985.7-），女，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院2012級(jí)藥理學(xué)專業(yè)在讀博士研究生；研究方向院代謝性藥物分子藥理學(xué)。

孔維佳（1972.12-），男，博士，研究員；研究方向院分子醫(yī)學(xué)與藥物研究。