飲水砷的遺傳毒理學(xué)研究

趙書婷，曲 琳，尹幸念，錢毅春，張曉麗，白國輝，王素華，王海玲

(1.包頭醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭 014060；2.包頭醫(yī)學(xué)院2013級碩士研究生；3.內(nèi)蒙古疾病預(yù)防控制中心衛(wèi)生毒理所)

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飲水砷的遺傳毒理學(xué)研究

趙書婷1，2，曲 琳3，尹幸念3，錢毅春3，張曉麗1，白國輝1，王素華1，王海玲3

(1.包頭醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭 014060；2.包頭醫(yī)學(xué)院2013級碩士研究生；3.內(nèi)蒙古疾病預(yù)防控制中心衛(wèi)生毒理所)

目的：探討飲水砷的遺傳毒理作用，為飲水型砷中毒的防治與監(jiān)測提供科學(xué)的理論依據(jù)。方法：采用經(jīng)典的Ames(鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變)試驗、小鼠骨髓細胞微核試驗和小鼠精子畸形試驗。結(jié)果：Ames試驗的結(jié)果為陰性；小鼠骨髓細胞微核試驗中，0.09 μg/kg劑量組的雌、雄鼠和0.03 μg/kg劑量組的雌鼠微核率分別為4.60 ‰、5.40 ‰、6.60 ‰，與陰性對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；小鼠精子畸形試驗中，3個劑量組劑量分別為0.09 μg/kg、0.03 μg/kg、0.01 μg/kg的精子畸形率與陰性對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論：飲水砷對原核細胞未顯示致突變作用，在真核細胞體內(nèi)顯示對染色體具有損傷作用并對生殖細胞產(chǎn)生遺傳毒性。

飲水砷；遺傳毒性；Ames試驗；小鼠骨髓細胞微核試驗；小鼠精子畸形試驗

砷是廣泛分布于自然界中的非金屬元素，環(huán)境中的砷主要通過水體轉(zhuǎn)運進入人體。地方性砷中毒是一種典型的因長期飲用高砷水(國家標(biāo)準(zhǔn)<0.05 mg/L)造成的中毒性疾病。水砷是人群暴露的主要途徑，飲水砷主要以無機砷的形式存在，無機砷進入機體后的代謝過程十分復(fù)雜，經(jīng)過二次氧化甲基化和二次還原過程[1]，被催化生成五價二甲基砷(DMA5+)[2]，最終代謝物對機體產(chǎn)生損傷作用。流行病學(xué)研究表明，慢性飲水型高砷暴露與心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)疾病，糖尿病以及多組織器官惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[3]。我國飲水型高砷暴露地區(qū)主要分布在內(nèi)蒙古、山西、新疆等地[4]。目前大部分研究主要涉及地方性砷中毒監(jiān)測、砷在頭發(fā)、血液、尿液等樣品含量的測定，慢性砷暴露可誘發(fā)惡性腫瘤、肺癌等相關(guān)研究也有個別報導(dǎo)，但飲水砷暴露對機體遺傳損傷毒性作用研究較少見。本研究通過Ames試驗、小鼠骨髓細胞微核試驗和小鼠精子畸形試驗研究飲水砷的遺傳毒性，了解其發(fā)生原因與作用機制，為飲水型砷中毒的防治與監(jiān)控提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株、動物 鼠傷寒沙門氏菌株TA97、TA98、TA100、TA102為實驗室凍存菌株。本實驗室對菌株特性進行鑒定，符合Ames試驗標(biāo)準(zhǔn)。SPF級健康昆明種小鼠購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,動物合格證號：SCXK(京)2012-0001；飼料來源于北京科澳協(xié)力飼料有限公司，飼料合格證號：SCXK(京)2009-0012；動物房屏障系統(tǒng)使用許可號：SYXK(蒙)2010-0001。

1.1.2 受試物和主要試驗試劑

1.1.2.1 受試物 準(zhǔn)確吸取一定量的砷標(biāo)準(zhǔn)溶液，用無菌蒸餾水定容到450 μg/L，依次稀釋成不同濃度。

1.1.2.2 主要試驗 2，4，7-三硝基-9-芴酮和疊氮鈉(Fluka公司)、MMS(Merck公司)、2-AF和1，8-二羥基蒽醌(上海試劑廠)、氧化型輔酶Ⅱ、6-磷酸葡萄糖鈉鹽、L-組氨酸(Sigma公司)、生物素(Sigma公司)、S9(本實驗室按Ames方法制備，液氮保存，批號20130713)、胎牛血清、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、甲醇、環(huán)磷酰胺、Giemsa染液。

1.2 方法

1.2.1 Ames試驗 采用鼠傷寒沙門氏菌TA97、TA98、TA100、TA102 4種菌株，體外活化系統(tǒng)為多氯聯(lián)苯誘導(dǎo)的大鼠肝均漿制備的S9混合液。選用菌株TA100進行預(yù)試驗，計數(shù)每個平皿中的回變菌落數(shù)。將無菌蒸餾水定容到450 μg/L的砷標(biāo)準(zhǔn)溶液作為受試樣品，用無菌蒸餾水稀釋到不同濃度，檢測劑量分別設(shè)定為0.0450 μg/皿、0.0150 μg/皿、0.0050 μg/皿、0.0017 μg/皿、0.0006 μg/皿。設(shè)空白對照、溶劑對照和陽性對照，不同菌株使用不同的陽性致畸物。溶劑對照為100 μL/皿的無菌蒸餾水，在加和不加S9的試驗條件下進行平板滲入法試驗；每組設(shè)3個平行樣品，實驗重復(fù)1次。

1.2.2 小鼠骨髓細胞微核試驗 選用SPF級健康昆明種小鼠50只，體重25～30 g、平均體重26.02 g，按體重隨機分為5組，每組10只，雌、雄各半。受試物組劑量分別為0.09 μg/kg、0.03 μg/kg、0.01 μg/kg，陰性對照組給蒸餾水，陽性對照組經(jīng)口給予環(huán)磷酰胺40 mg/kg，灌胃量為0.2 mL/10 g。采用30 h給受試物法，兩次給受試物間隔24 h，于第2次灌胃6 h后頸椎脫臼處死小鼠，取胸骨骨髓涂片、固定、染色、鏡檢。每鼠計數(shù)1 000個嗜多染紅細胞(PCE)的微核細胞數(shù)，觀察200個PCE，計數(shù)同時觀察到的正染紅細胞(NCE)數(shù)目，計算PCE/NCE比值。

1.2.3 小鼠精子畸形試驗 選用雄性昆明種小鼠25只，體重25～35 g、平均體重30.58 g，按體重隨機分為5組，每組5只，設(shè)3個劑量組，劑量分別為0.09 μg/kg、0.03 μg/kg、0.01 μg/kg，另設(shè)溶劑(蒸餾水)對照組和環(huán)磷酰胺陽性對照組(40 mg/kg)。經(jīng)口灌胃1次/d，灌胃量均為0.2 mL/10 g，連續(xù)灌胃5 d，于首次給受試物后第35 d脫頸椎處死動物，取雙側(cè)副睪制片，按《食品安全性毒理學(xué)評價程序和方法》GB15193.7-2003中的規(guī)定，經(jīng)甲醇固定、1 %伊紅染液染色后，于高倍鏡下對每只小鼠計數(shù)1 000條完整精子，記錄精子畸形數(shù)、畸形類型，計算精子畸形發(fā)生率。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 試驗數(shù)據(jù)使用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 受試物對鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型回變菌落數(shù)的影響 計數(shù)每個平皿中的回變菌落數(shù)，在加或不加體外代謝活化系統(tǒng)S9時，受檢樣品飲水砷誘發(fā)鼠傷寒沙門氏菌株TA97、TA98、TA100、TA102回變菌落數(shù)均未超過自發(fā)回變菌落數(shù)的2倍，無劑量反應(yīng)關(guān)系，可判定結(jié)果為陰性。見表1、表2。

表1 受試物對鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型回變菌落數(shù)的影響

a為2，4，7-三硝基-9-芴酮，0.2 μg/皿；b為2-氨基芴(2-AF)，50.0 μg/皿；c為疊氮鈉，2.0 μg/皿；d為甲基磺酸甲酯(MMS)，3.0 μL原液；e為1，8-二羥基蒽醌，50.0 μg/皿

表2 受試物對鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型回變菌落數(shù)的影響

a為2，4，7-三硝基-9-芴酮，0.2 (g/皿；b為2-氨基芴(2-AF)50.0 (g/皿；c為疊氮鈉，2.0 (g/皿；d為甲基磺酸甲酯(MMS)，3.0 (L原液；e為1，8-二羥基蒽醌，50.0 (g/皿

2.2 受試物對小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核率的影響 受試物3個劑量組的微核率與陰性對照組比較，雌、雄鼠的高劑量組及雌鼠的中劑量組微核率差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，雌、雄鼠的低劑量組及雄鼠的中劑量組與陰性對照組的微核率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 受試物對小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核率的影響

a為與陰性對照組比較P<0.05

2.3 受試物對小鼠精子畸變率的影響 受試物3個劑量組及陽性對照組的精子畸形率與陰性對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表4。

表4 受試物對小鼠精子畸形率的影響

a為與陰性對照組相比P<0.01

3 討論

Ames試驗結(jié)果顯示，受試物未增加鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型菌株的回復(fù)突變數(shù)，與以往文獻報道結(jié)果相同。Ames試驗是一種有效檢測受試物能否引起鼠傷寒沙門氏菌基因組堿基置換或移碼突變的方法。在本次飲水砷Ames試驗中，砷未能引起堿基置換、移碼或缺失。其它研究表明，雖然砷和腐植酸共同作用有微弱的致突變性，但砷在Ames試驗中單獨作用沒有致突變性。沙門氏菌屬具有很強的抵抗有毒重金屬砷的能力，所以該實驗劑量未觀察到對菌株的影響。

在本研究中，小鼠骨髓細胞微核試驗高劑量組結(jié)果為陽性。砷具有較強的染色體損傷作用，可擾亂紡錘體結(jié)構(gòu)，影響正常的有絲分裂過程，使染色質(zhì)無法正常進入細胞核，誘導(dǎo)微核的形成，導(dǎo)致微核率的增加[5]。砷是一種有絲分裂毒物，使體內(nèi)產(chǎn)生姐妹染色單體交換(sister chromatid exchange,SCE)的機率增加，染色體畸形(chromosome abnormalities,CA)和微核(micronucleus,MN)的數(shù)量增加，且中毒越嚴重遺傳損傷也越嚴重，最終影響細胞的有絲分裂。有報道，砷可誘發(fā)染色體損傷，與本實驗結(jié)果相符。本研究的小鼠精子畸形試驗結(jié)果為陽性，表明砷可引起精子畸形，主要畸形類型包括胖頭、無定形、無鉤等，對機體有明顯的生殖細胞損傷作用，與眾多的研究得出相似的結(jié)論[6]，其機制可能與砷使生殖細胞的基因發(fā)生突變或干擾基因的表達過程有關(guān)[5]。精子形態(tài)的改變反映了雄性生殖細胞的遺傳損傷。

綜上所述，通過體外試驗和動物體內(nèi)試驗表明，飲水砷對原核細胞未顯示致突變作用，對真核細胞染色體有損傷作用并對生殖細胞產(chǎn)生遺傳毒性。提示應(yīng)嚴格控制飲用水中砷的含量，降低飲水砷引起的遺傳損傷程度。

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Study on genetic toxicology of arsenic in drinking water

ZHAO Shuting1, QU Lin2, YIN Xingnian2, QIAN Yichun2,ZHANG Xiaoli1, BAI Guohui1,WANG Suhua1,WANG Hailing2

(1.PublicHealthSchoolofBaotouMedicalCollege,Baotou014040,China2.Postgraduate2013 ,BaotouMedicalCollege3.InstituteforToxicologyofInnerMongoliaCenterforDiseasesControlandPrevention)

Objective:To explore the genotoxicity of arsenic in drinking water and provide scientific basis for the prevention and treatment of arseniasis in drinking water. Methods：Ames test, bone marrow cell micronucleus test and mice sperm abnormality test were adopted. Results：Ames test results were negative; In bone marrow cell micronucleus test, the micronucleus rate of the male and female mice in the 0.09 μg/kg dose group and the female mice in the 0.03 μg/kg dose group was 4.60 ‰, 5.40 ‰ and 6.60 ‰ respectively. Compared with that of the negative control group, the difference was of significance (P<0.05); Mice sperm abnormality test results were positive; the sperm deformity rate of the three groups was 0.09 μg/kg, 0.03 μg/kg, and 0.01 μg/kg respectively; compared with that of the negative control group, the difference was significant (P<0.01). Conclusion：Arsenic in drinking water has no mutagenic effect in prokaryotic cells, but it will damage the chromosomes of eukaryotic cells and has genotoxic effect on germ cells.

Arsenic in drinking water; Genotoxicity; Ames test; Bone marrow cell micronucleus test; Mice sperm abnormality test

王素華，王海玲

2016-02-23)