ER陽(yáng)性乳腺癌中Efp和Plk3蛋白表達(dá)相關(guān)性探討

段佳君，鄒天寧，張 季，劉德權(quán)

云南省腫瘤醫(yī)院/昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院乳腺外一科，云南 昆明 650118

ER陽(yáng)性乳腺癌中Efp和Plk3蛋白表達(dá)相關(guān)性探討

段佳君，鄒天寧，張 季，劉德權(quán)

云南省腫瘤醫(yī)院/昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院乳腺外一科，云南 昆明 650118

背景與目的：長(zhǎng)期以來(lái)，雌激素受體（estrogen receptor，ER）陽(yáng)性乳腺癌患者對(duì)內(nèi)分泌治療耐藥是臨床上棘手的難題。目前研究表明，雌激素效應(yīng)環(huán)指蛋白（estrogen-responsive finger protein，Efp）和polo樣激酶3（polo-like kinase 3，Plk3）的表達(dá)與乳腺癌發(fā)展具有密切關(guān)系。該研究旨在探討ER陽(yáng)性乳腺癌中Efp和Plk3蛋白表達(dá)相關(guān)性，了解Efp和Plk3表達(dá)變化在耐藥中的作用。方法：應(yīng)用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)74例ER陽(yáng)性乳腺癌組織中Efp和Plk3蛋白表達(dá)情況，結(jié)合臨床資料進(jìn)行分析。并采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）及蛋白［質(zhì)］印跡法（Western blot）檢測(cè)ER陽(yáng)性乳腺癌MCF-7細(xì)胞中Efp和Plk3的基因和蛋白表達(dá)變化。結(jié)果：74例ER陽(yáng)性乳腺癌組織中Efp和Plk3蛋白表達(dá)與患者的臨床病理特征未見任何關(guān)系（P＞0.05），其中有51例（68.9%）患者Efp表達(dá)陽(yáng)性和23例（31.1%）患者Plk3表達(dá)陽(yáng)性，χ2檢驗(yàn)分析結(jié)果顯示，ER陽(yáng)性乳腺癌組織中Efp和Plk3具有顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系（χ2=8.837，P＜0.05）。RTFQ-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，MCF-7細(xì)胞經(jīng)雌激素刺激后Efp mRNA的表達(dá)顯著增加，而Plk3 mRNA的表達(dá)無(wú)明顯變化。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，MCF-7細(xì)胞經(jīng)雌激素和MG132刺激后，Efp的蛋白表達(dá)較MG132組顯著增加，而Plk3蛋白表達(dá)明顯下降。結(jié)論：在ER陽(yáng)性乳腺癌患者中Efp和Plk3的蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，Efp高表達(dá)可促進(jìn)Plk3的蛋白降解，對(duì)內(nèi)分泌耐藥過(guò)程的形成可能產(chǎn)生一定影響。

乳腺癌；雌激素受體；雌激素效應(yīng)環(huán)指蛋白；Polo樣激酶3；耐藥

近年來(lái)，隨著對(duì)乳腺癌發(fā)病機(jī)制和治療研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)大部分對(duì)內(nèi)分泌治療耐藥的乳腺癌患者中雌激素受體（estrogen receptor，ER）呈陽(yáng)性，其生長(zhǎng)具有雌激素依賴性［1-2］。雌激素效應(yīng)環(huán)指蛋白（estrogenresponsive finger protein，Efp）基因作為ERα的靶基因，在依賴雌激素的乳腺癌細(xì)胞增殖和功能的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，有研究證實(shí)，當(dāng)雌激素與ER結(jié)合時(shí)可誘導(dǎo)Efp高表達(dá)，后者可通過(guò)泛素途徑降解細(xì)胞內(nèi)多種與乳腺癌增殖相關(guān)的蛋白，導(dǎo)致疾病進(jìn)一步惡化，甚至使機(jī)體產(chǎn)生耐藥［3-4］。Polo樣激酶3（polo-like kinase 3，Plk3）是Plk家族成員之一，最新研究顯示，其過(guò)表達(dá)能抑制ER陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞的增殖［5］?；诖耍疚臄M探討ER陽(yáng)性乳腺癌中Efp和Plk3蛋白表達(dá)相關(guān)性，旨在了解Efp和Plk3表達(dá)的變化在ER陽(yáng)性乳腺癌內(nèi)分泌治療耐藥中的作用，為臨床治療乳腺癌提供新的思路。

1　材料和方法

1.1 臨床資料

選取2010年3月—2010年9月于云南省腫瘤醫(yī)院/昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院乳腺外一科行乳腺癌切除術(shù)并且ER陽(yáng)性的乳腺癌患者74例，均為女性，中位年齡為51（33～71）歲。患者術(shù)前未行放療、化療和內(nèi)分泌治療，術(shù)中在乳腺癌組織離體后立即切取約0.2 g標(biāo)本及癌旁正常組織，并迅速置于液氮中保存?zhèn)溆谩Ｉ鲜鼋M織標(biāo)本均經(jīng)過(guò)病理診斷為ER陽(yáng)性乳腺癌。所有患者均簽署了知情同意書，實(shí)驗(yàn)過(guò)程嚴(yán)格按照國(guó)家倫理學(xué)審查機(jī)構(gòu)和協(xié)議進(jìn)行。

1.2 主要試劑

RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)HyClone公司，胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，PBS干粉購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，胰蛋白酶-EDTA購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司，TransScript?Two-Step實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQPCR）SuperMix試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，免疫組化鼠抗人Efp單抗、鼠抗人Plk3單抗購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，蛋白酶體抑制劑MG-132、雌二醇E2購(gòu)自美國(guó)Gene Operation公司，ER陽(yáng)性MCF-7細(xì)胞株由云南省腫瘤醫(yī)院病理科提供，鼠抗人Efp單抗、鼠抗人的Plk3單抗和兔抗人的β-actin單抗均美國(guó)SantaCruz公司，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，倒置光學(xué)顯微鏡（奧林巴斯CKX-41）購(gòu)自日本奧林巴斯株式會(huì)社。

1.3 免疫組織化學(xué)SP法

采用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)ER陽(yáng)性乳腺癌組織中Efp和Plk3蛋白表達(dá)。方法如下:取患者的乳腺癌組織標(biāo)本，經(jīng)10%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，制成厚4 μm的連續(xù)病理切片，抗原修復(fù)采用EDTA（pH=9.0）抗原修復(fù)液高壓鍋熱修復(fù)。鼠抗人Efp單克隆抗體和鼠抗人Plk3單克隆抗體的工作濃度分別為1∶200和1∶200，置于4 ℃冰箱溫育過(guò)夜。PBS沖洗2次，滴加二抗后室溫溫育30 min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水、透明、封固。

1.4 陽(yáng)性結(jié)果判斷

Efp、Plk3陽(yáng)性表達(dá)判定:以細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)棕黃色及棕褐色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞，測(cè)定時(shí)采用雙盲法，由兩名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師在200倍光鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野進(jìn)行半定量計(jì)數(shù)［6］。根據(jù)染色強(qiáng)度，無(wú)色積分為0分，淺黃色積分為1分，棕黃色積分為2分，棕褐色積分為3分；根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜25%為陰性（-），25%～50%為低水平表達(dá)（+），50%～75%為中等水平表達(dá)（++），＞75%為較高水平表達(dá)（+++）。本研究以（-）～（+）為陰性組，以（++）～（+++）為陽(yáng)性組。

1.5 ER陽(yáng)性MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)

加入1640培養(yǎng)液（含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素）重懸ER陽(yáng)性MCF-7細(xì)胞后，調(diào)整細(xì)胞密度為1×104個(gè)/mL，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，置37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞用0.05%胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代。

1.6 RTFQ-PCR實(shí)驗(yàn)

取細(xì)胞培養(yǎng)收集的ER陽(yáng)性MCF-7細(xì)胞，將細(xì)胞密度調(diào)整為2×106個(gè)/mL，按每孔100 μL接種于96孔板中，分為溶劑對(duì)照組（無(wú)水乙醇）和E2組（E2濃度為1×10-7mol/L）。每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，參照試劑盒說(shuō)明書分別提取各組細(xì)胞總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以β-actin為內(nèi)對(duì)照進(jìn)行PCR擴(kuò)增。目的基因和內(nèi)參的引物設(shè)計(jì)是根據(jù)GenBank提供Efp、Plk3和β-actin的mRNA序列（表1）。

表 1 目的基因的引物設(shè)計(jì)Tab. 1 Primer designing of target gene

1.7 蛋白［質(zhì)］印跡法（Western blot）實(shí)驗(yàn)

取收集的ER陽(yáng)性MCF-7細(xì)胞，將細(xì)胞密度調(diào)整為2×106個(gè)/mL，按每孔100 μL接種于96孔板中，分為溶劑對(duì)照組（無(wú)水乙醇）、E2組（E2濃度為1×10-7mol/L）、MG-132組（MG-132濃度為5×10-6mol/L）和E2+MG-132組（E2濃度為1× 10-7mol/L，MG-132濃度為5×10-6mol/L）。每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，置于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞用PBS洗滌2次，加入1×SDS上樣緩沖液300 μL，冰上放置30 min，超聲裂解細(xì)胞，4 ℃，12 000×g條件下離心10 min，收集上清液為細(xì)胞裂解液。用BCA法進(jìn)行蛋白定量，10%SDA-PAGE垂直電泳分離，上樣量為30 μg/孔，轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)到聚乙烯二氟膜上，5%脫脂奶粉4 ℃封閉過(guò)夜，1∶1 000倍稀釋的鼠抗人Efp單抗、1∶1 000倍稀釋的鼠抗人Plk3單抗和1∶4 000倍稀釋的兔抗人β-actin單抗室溫溫育1 h，膜洗3次，加入1∶3 000倍稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗鼠或抗兔的二抗室溫溫育1 h，膜洗3次，用ECL發(fā)光系統(tǒng)進(jìn)行顯影，對(duì)條帶進(jìn)行定性分析，以β-actin作為內(nèi)參照。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。Efp和Plk3的表達(dá)相關(guān)性研究采用χ2檢驗(yàn)或連續(xù)校正的χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)ER陽(yáng)性乳腺癌組織中Efp和Plk3的蛋白表達(dá)

免疫組織化學(xué)法檢測(cè)結(jié)果顯示，Efp和Plk3主要表達(dá)于漿細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞質(zhì)染色多且呈棕黃色顆?；驁F(tuán)塊狀（圖1、2）。

圖 1 ER陽(yáng)性乳腺癌組織中Efp表達(dá)Fig. 1 The expression of Efp in ER positive breast cancer

圖 2 ER陽(yáng)性乳腺癌組織中Plk3表達(dá)Fig. 2 The expression of Plk3 in ER positive breast cancer

2.2 ER陽(yáng)性乳腺癌患者Efp和Plk3蛋白表達(dá)與患者臨床的關(guān)系

74例ER陽(yáng)性乳腺癌患者組織中，Efp和Plk3蛋白表達(dá)與臨床病理特征無(wú)明顯的相關(guān)性（P＞0.05，表2）。

2.3 ER陽(yáng)性乳腺癌組織中Efp和Plk3蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析

在74例ER陽(yáng)性乳腺癌患者中，有51例患者Efp表達(dá)陽(yáng)性，陽(yáng)性率為68.9%；有23例患者Plk3表達(dá)陽(yáng)性，陽(yáng)性率為31.1%。在51例Efp表達(dá)陽(yáng)性患者中，有11例Plk3表達(dá)陽(yáng)性，23例Efp表達(dá)陰性患者中有13例Plk3表達(dá)陽(yáng)性。經(jīng)χ2檢驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，ER陽(yáng)性乳腺癌組織中Efp和Plk3具有顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系（χ2=8.837，P=0.003）。

2.4 雌激素對(duì)ER陽(yáng)性乳腺癌MCF-7細(xì)胞的Efp mRNA和Plk3 mRNA基因表達(dá)的影響

采用RTFQ-PCR檢測(cè)ER陽(yáng)性乳腺癌MCF-7細(xì)胞的Efp mRNA和Plk3 mRNA基因表達(dá)情況，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，E2組中MCF-7細(xì)胞經(jīng)雌激素刺激后Efp mRNA的表達(dá)顯著增加，而Plk3 mRNA的表達(dá)則無(wú)明顯變化（圖3）。

表 2 Efp、Plk3蛋白表達(dá)在ER陽(yáng)性乳腺癌組織中的表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系Tab. 2 The Relationship between expressions of Efp and Plk3 and clinical characteristics in ER positive breast cancer

圖 3 雌激素對(duì)ER陽(yáng)性乳腺癌MCF-7細(xì)胞的Efp和Plk3基因表達(dá)的影響Fig. 3 Expression of Efp mRNA and Plk3 mRNA in ER positive MCF-7 cells induced by estrogen

2.5 雌激素和蛋白酶體抑制劑對(duì)ER陽(yáng)性乳腺癌MCF-7細(xì)胞的Efp和Plk3蛋白表達(dá)的影響

采用Western blot檢測(cè)ER陽(yáng)性乳腺癌MCF-7細(xì)胞的Efp和Plk3蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示:E2組細(xì)胞經(jīng)雌激素刺激后Efp的蛋白表達(dá)較對(duì)照組顯著增加而Plk3蛋白明顯下降；MG132組細(xì)胞經(jīng)蛋白酶體抑制劑刺激后Plk3蛋白較對(duì)照組顯著增加；E2+MG132組細(xì)胞經(jīng)雌激素和MG132刺激后，Efp的蛋白表達(dá)較MG132組顯著增加，而Plk3蛋白表達(dá)明顯下降（圖4）。

圖 4 雌激素和蛋白酶體抑制劑對(duì)ER陽(yáng)性乳腺癌MCF-7細(xì)胞的Efp和Plk3蛋白表達(dá)的影響Fig. 4 Expression of Efp and Plk3 protein in ER positive MCF-7 cells induced by estrogen and MG132

3　討　論

ER陽(yáng)性乳腺癌患者對(duì)內(nèi)分泌治療耐藥一直是臨床上的難題。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期雌激素刺激能引起ER下游靶基因上的雌激素反應(yīng)元件調(diào)控基因表達(dá)能力增強(qiáng)，它是導(dǎo)致乳腺癌耐藥過(guò)程形成的重要因素［7-8］。Efp主要表達(dá)于雌激素靶向性的組織和細(xì)胞中，如乳腺和子宮等上皮細(xì)胞。既往研究證實(shí)，Efp高表達(dá)可導(dǎo)致雌激素依賴性癌細(xì)胞的增殖和惡化，Zhao等［9］研究發(fā)現(xiàn)，雌激素誘導(dǎo)ER陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞中Efp高表達(dá)，導(dǎo)致抑癌因子KLF5降解。Efp在ER陽(yáng)性乳腺癌中也存在高表達(dá)現(xiàn)象，Ueyama等［10］通過(guò)沉默MCF-7乳腺癌細(xì)胞中Efp的表達(dá)，導(dǎo)致MCF-7的體外增殖受到顯著抑制。因此，Efp可能是參與乳腺癌耐藥過(guò)程的一個(gè)重要指標(biāo)。高表達(dá)的Efp作為一種泛素連接酶，可通過(guò)泛素途徑降解細(xì)胞內(nèi)多種與乳腺癌增殖相關(guān)的蛋白，如Plk3蛋白。Plk3作為Plk家族的成員之一，是有絲分裂、胞質(zhì)分裂和DNA損傷反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑。Naik等［11］發(fā)現(xiàn)抑制乳腺癌細(xì)胞中Plk3的活性，可導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞異常增殖。Yan等［12］的調(diào)查顯示，大部分乳腺癌患者的癌組織中Plk3蛋白表達(dá)減少。因此，推測(cè)Efp和Plk3可能參與了ER陽(yáng)性乳腺癌患者的內(nèi)分泌治療耐藥過(guò)程。

本研究探討ER陽(yáng)性乳腺癌中Efp和Plk3蛋白表達(dá)相關(guān)性，在74例ER陽(yáng)性乳腺癌組織中Efp和Plk3蛋白表達(dá)與患者的臨床病理特征未見明顯關(guān)聯(lián)（P＞0.05），而χ2檢驗(yàn)分析結(jié)果顯示，ER陽(yáng)性乳腺癌組織中Efp和Plk3具有顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系（χ2=8.837，P＜0.05）；此外，免疫組織化學(xué)檢測(cè)顯示，在同一個(gè)乳腺癌患者的乳腺癌組織標(biāo)本中，Efp的高表達(dá)往往同時(shí)存在Plk3的低表達(dá)，提示Efp高表達(dá)可促進(jìn)Plk3的蛋白降解。進(jìn)一步觀察外源性雌激素和蛋白酶抑制劑MG132反應(yīng)性指蛋白Efp對(duì)Plk3表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，MCF-7細(xì)胞經(jīng)雌激素刺激后Efp mRNA的表達(dá)顯著增加，而Plk3 mRNA的表達(dá)無(wú)明顯變化，說(shuō)明雌激素能顯著促進(jìn)Efp高表達(dá)，而對(duì)Plk3的表達(dá)不產(chǎn)生影響。隨后我們通過(guò)Western blot檢測(cè)不同刺激對(duì)MCF-7細(xì)胞Efp和Plk3蛋白的影響，結(jié)果顯示，MCF-7細(xì)胞經(jīng)雌激素刺激后，Efp的蛋白表達(dá)較對(duì)照組顯著增加，而Plk3蛋白明顯下降。Plk3在細(xì)胞中可被蛋白酶抑制劑MG132穩(wěn)定［13］，當(dāng)MCF-7細(xì)胞經(jīng)MG132刺激后，Plk3蛋白較對(duì)照組顯著增加。MCF-7細(xì)胞經(jīng)雌激素和MG132同時(shí)刺激后，Efp的蛋白表達(dá)較MG132組顯著增加，而Plk3蛋白表達(dá)明顯下降。上述結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了Efp高表達(dá)可促進(jìn)Plk3的蛋白降解。

綜上所述，在ER陽(yáng)性乳腺癌中，雌激素能促進(jìn)Efp高表達(dá)，加速Plk3的蛋白降解，從而更有利于具有雌激素依賴性的ER陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞的增殖。因此，Efp和Plk3表達(dá)的變化可能對(duì)內(nèi)分泌耐藥過(guò)程的形成產(chǎn)生一定影響。

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Expression correlation between Efp and Plk3 in estrogen receptor-positive breast cancer

DUAN Jiajun， ZOU Tianyu， ZHANG Ji， LIU Dequan
（Department of Mammary Surgery， Yunnan Cancer Hospital，Third Affiliated Hospital of Kunming Medical University， Kunming 650118， Yunnan Province， China）
Correspondence to: DUAN Jiajun E-mail: zhuomiansohuji@163.com

Background and purpose: Estrogen receptor （ER）-positive breast cancer always presents a dilemma for resistance to endocrine therapy in a long time. The recent studies showed that the expression of estrogenresponsive finger protein （Efp） and polo-like kinase 3 （Plk3） had a close relationship with breast cancer development. This study was to explore the expression correlation between Efp and Plk3 in ER-positive breast cancer in order to understand the influence of Efp and Plk3 on the drug resistance. Methods: The expression of Efp and Plk3 in 74 cases of ER-positive breast cancer was detected by SP immunohistochemistry. The clinical significance was then analyzed. Real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction （RTFQ-PCR） and Western blot were used to detect the expression of Efp and Plk3 in ER-positive MCF-7 cells. Results: No significant relationship was found between Efp and Plk3 expression and the clinicopathological features of 74 cases of ER-positive breast cancer （P＞0.05）. The number of cases whose Efp showed positive expression was 51 （68.9%）， while the number of cases whose Plk3 showed positive expression was 23 （31.1%）. Chi-square test analysis showed the expression of Efp and Plk3 was negatively correlated in 74 cases of ER-positive breast cancer （χ2=8.837， P＜0.05）. The result of RTFQ-PCR showed that the expression of Efp mRNA in MCF-7 cells was up-regulated by estrogen stimulation， whereas Plk3 mRNA was not changed. The result of Western blot showed that the expression of Efp protein in MCF-7 cells was increased by estrogen and MG132 stimulation， whereas Plk3 protein was decreased. Conclusion: The expression of the Efp protein is negatively correlatedwith Plk3 protein in ER-positive breast cancer. High expression of Efp may be involved in the resistance to endocrine therapy.

Breast cancer； Estrogen receptor； Estrogen-responsive finger protein； Polo-like kinase 3； Drug resistance

10.19401/j.cnki.1007-3639.2016.10.007

R737.9

A

1007-3639（2016）10-0848-06

段佳君 E-mail:zhuomiansohuji@163.com

（2015-11-10

2016-02-10）