VX2移植性兔直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型的建立及其生物學(xué)特性

孫軼群，童 彤，毛 健，鐘芳芳，顧雅佳

VX2移植性兔直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型的建立及其生物學(xué)特性

孫軼群1，童 彤1，毛 健1，鐘芳芳2，顧雅佳1

1.復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院放射診斷科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032；

2.復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032

背景與目的：直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型是研究腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及抗腫瘤治療的工具，但較大型動(dòng)物模型鮮見報(bào)道。該研究旨在建立可行性強(qiáng)、重復(fù)率高的VX2移植性兔直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型。方法：采用原位移植方法，將切好的小瘤塊置入穿刺針內(nèi)，并使用穿刺針將小瘤塊推入到新西蘭大白兔的直腸壁內(nèi)。共制作模型20只。每周使用MR掃描2只實(shí)驗(yàn)兔，MR上觀察腫瘤生長(zhǎng)情況及腸周淋巴結(jié)個(gè)數(shù)，使用MR后處理軟件測(cè)量實(shí)驗(yàn)兔的直腸壁腫瘤體積，掃描完成后進(jìn)行詳細(xì)解剖，切除直腸壁上腫瘤及腸周淋巴結(jié)，進(jìn)行標(biāo)本固定及HE染色，并探討腫瘤體積與生長(zhǎng)時(shí)間及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)個(gè)數(shù)的關(guān)系。結(jié)果：成功制作模型13只，成功率為65%。于第4周開始在MR上可觀察到局限于直腸壁腫塊。隨著時(shí)間增長(zhǎng)，腫瘤體積不斷增大，且不同時(shí)期（生長(zhǎng)周數(shù)）腫瘤體積差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=52.865，P＜0.05）；進(jìn)一步分析得出，腫瘤的平均體積與生長(zhǎng)周數(shù)呈正線性相關(guān)（r=0.910），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。當(dāng)腫瘤體積大于9 cm3時(shí)，實(shí)驗(yàn)兔開始出現(xiàn)轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)，第9周開始轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)個(gè)數(shù)明顯增多。統(tǒng)計(jì)分析得出腫瘤體積越大，轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)個(gè)數(shù)就越多（F=92.531，P＜0.05），且兩者呈線性相關(guān)（r=0.945），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）。結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)將組織學(xué)完整的VX2移植瘤組織塊原位種植到新西蘭大白兔直腸內(nèi)，成功建立了VX2移植性兔直腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型。本模型對(duì)于研究直腸癌的局部生長(zhǎng)、浸潤(rùn)機(jī)制、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶及生物學(xué)特性均有一定價(jià)值。

模型；直腸癌；轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)

我國(guó)直腸癌發(fā)病率以每年2%的速度上升，在消化系統(tǒng)腫瘤中位于第3位。直腸癌術(shù)前分期對(duì)于患者治療方法的選擇有很大的關(guān)系，即使接受根治性手術(shù)的患者中仍有40%～50%死于術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移［1］，其中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是常見的轉(zhuǎn)移方式，且淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移又可以進(jìn)一步成為血行轉(zhuǎn)移的橋頭堡［2］。由于缺乏原位直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型，故對(duì)影像學(xué)轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的檢出及研究難以深入進(jìn)行。迄今為止，關(guān)于直腸癌動(dòng)物模型以裸鼠皮下移植瘤及原位種植瘤較多見［3-4］，但相關(guān)研究多采用較小的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，而且成模后的進(jìn)一步影像評(píng)估和治療干預(yù)也存在困難。目前鮮見國(guó)內(nèi)有關(guān)于較大型原位直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型制作的報(bào)道，所以本實(shí)驗(yàn)旨在為直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的檢出、治療的研究提供可行性強(qiáng)、重復(fù)率高的較大型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。

1　材料和方法

1.1 材料

1.1.1VX2荷瘤種兔

由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，體質(zhì)量3～4 kg，后腿肌肉內(nèi)見局部隆起的軟組織腫塊，腫塊質(zhì)韌，大小約2.5 cm× 2.5 cm×2.5 cm。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)健康新西蘭大白兔20只，由復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供，體質(zhì)量2.5～3.0 kg，雌雄各半，4～6個(gè)月齡。

1.2 方法

1.2.1模型制作前準(zhǔn)備及傳代

剝?nèi)X2荷瘤兔后腿肌肉內(nèi)的瘤塊，取瘤塊邊緣生長(zhǎng)旺盛的魚肉樣組織，剔除筋膜和壞死組織，使用眼科剪將選取好的組織剪切成體積約為2 mm×2 mm×2 mm的瘤塊，浸入0.9%NaCl溶液備用，使用20號(hào)骨穿針將切好的小瘤塊移植于健康兔后腿外側(cè)肌肉內(nèi)，4周左右進(jìn)行1次保種傳代。

1.2.2模型制作

實(shí)驗(yàn)兔前1 d禁食，隨機(jī)選取。磁共振掃描前5 min對(duì)新西蘭大白兔采用氯胺酮與地西泮混合液（2 mL氯胺酮和 2 mL地西泮）進(jìn)行肌內(nèi)注射麻醉，用量為 0.20～0.25 mL/kg。待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物麻醉后仰臥位四肢固定，并消毒兔子肛門周圍。將切好的小瘤塊置入穿刺針內(nèi)待用。助手利用卵圓鉗將實(shí)驗(yàn)兔肛緣提起以張開肛門及直腸下段，然后將載有瘤塊的穿刺針沿直腸壁進(jìn)針2～3 cm深度，借助無(wú)影燈觀察針尖是否穿入腸壁，若針尖停留位置在直腸壁內(nèi)，借助注射器針頭將小瘤塊推入到直腸壁內(nèi)，沿腸壁輕輕退出穿刺針，并用生物OB膠（醫(yī)用粘連劑，購(gòu)自廣州白云醫(yī)用膠有限公司）封閉進(jìn)針口，術(shù)畢。若針尖穿透直腸，則換位置繼續(xù)進(jìn)針。實(shí)驗(yàn)兔一般1 h內(nèi)蘇醒，蘇醒后即可恢復(fù)其正常飲食。

1.2.3MR監(jiān)測(cè)腫瘤生長(zhǎng)狀況

從第1周開始，每周對(duì)其中2只實(shí)驗(yàn)兔進(jìn)行MR掃描，觀察移植腫瘤生長(zhǎng)情況。并利用MR后處理系統(tǒng)3D-MIP中的Segment功能測(cè)量腫瘤體積大小，使用其中的quick paint工具，在橫斷位T2WI圖上對(duì)腫瘤信號(hào)區(qū)域感興趣區(qū)（region of interest，ROI）進(jìn)行勾畫，將每個(gè)層面的腫瘤信號(hào)畫入，最后點(diǎn)擊measure volume即可計(jì)算出勾畫的腫瘤體積VROI。由于橫斷位T2WI掃描為有間隔的掃描，間隔為1 mm，使用quick paint未能將間隔畫入ROI，間隔區(qū)體積的測(cè)量使用粗略算法:用上下兩層ROI面積的平均值乘以間隔厚度，即V間隔=1×（An+An+1）/2（n≥1）（V=volume；A=area）。V總=VROI+V間隔。

1.2.4MR檢查

所有實(shí)驗(yàn)兔檢查前不需要腸道準(zhǔn)備，未服用腸道解痙藥物。檢查時(shí)受檢實(shí)驗(yàn)兔取仰臥位。采用3.0 T（Signa Horizon，GE Medical Systems）MR掃描儀，使用柔軟體線圈發(fā)射并接收信號(hào)。掃描參數(shù):冠狀位T1WI: TR=620 ms，TE=7 100 ms，Matrix=352×192，層厚=3 mm，層間距=0.5 mm，F(xiàn)OV=200 mm。冠狀位T2WI: TR=2 500 ms，TE=106 ms，Matrix=320×224，層厚=3 mm，層間距=1 mm，F(xiàn)OV=200 mm。矢狀位T2WI:TR=3 220 ms，TE=103 ms，Matrix=320×224，層厚=3 mm，層間距=0.5 mm，F(xiàn)OV=200 mm。橫斷位T2WI: TR=3 900 ms，TE=93 ms，Matrix=256×256，層厚=4 mm，層間距=1 mm，F(xiàn)OV=120 mm。

1.2.5MR判斷轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的標(biāo)準(zhǔn)

判斷轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)的標(biāo)準(zhǔn):淋巴結(jié)短經(jīng)大于3 mm，或在T2WI圖像上顯示混雜信號(hào)并且邊緣不規(guī)整的淋巴結(jié)視為轉(zhuǎn)移。

1.2.6觀察直腸周圍淋巴結(jié)生長(zhǎng)情況

每周掃描2只實(shí)驗(yàn)兔。MR掃描完成后，觀察腸周淋巴結(jié)生長(zhǎng)情況，并立即處死已完成掃描的2只實(shí)驗(yàn)兔，對(duì)直腸及周圍鄰近器官進(jìn)行詳細(xì)的解剖學(xué)檢查。肉眼觀察移植瘤生長(zhǎng)部位、質(zhì)地、活動(dòng)度及移植瘤周圍的淋巴結(jié)位置、個(gè)數(shù)；并將移植瘤及淋巴結(jié)完整切除。移植腫瘤及淋巴結(jié)使用4%甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片，經(jīng)蘇木精-伊紅染色，在光鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。統(tǒng)計(jì)方法采用方差分析與直線回歸分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1 移植瘤生長(zhǎng)情況

成功制作VX2移植性兔直腸癌模型13只，成功率65%（13/20，表1，圖1～6）。造模后前3周MR上未見明顯異常腫塊。在第4周，MR上觀察到局限于直腸壁的腫塊，其邊界清楚，T2WI信號(hào)均勻，未見明顯壞死灶。解剖見腫瘤在直腸壁內(nèi)呈圓形，腫瘤結(jié)節(jié)呈灰白色，魚肉樣，質(zhì)硬，其內(nèi)見豐富的供瘤血管。第5周行MR掃描及解剖，腫瘤情況均如第4周所見。第6、7周時(shí)MR上腫瘤邊界不清，T2WI信號(hào)不均勻，腫瘤內(nèi)部出現(xiàn)少許壞死灶。解剖后見腸壁內(nèi)腫塊，內(nèi)部中央見少許液化壞死區(qū)，實(shí)性區(qū)仍見豐富的供瘤血管。第8～10周，MR上見腫瘤體積增大明顯，并與盆腔壁黏連，T2WI信號(hào)更不均勻，腫瘤下端突出肛門向外生長(zhǎng)，另有腸膨脹表現(xiàn)。解剖時(shí)腫瘤與盆壁不易分離，腫瘤內(nèi)部壞死范圍愈加明顯。其中1只實(shí)驗(yàn)兔，于第9周時(shí)死于衰竭。利用MR后處理軟件測(cè)得不同時(shí)期腫瘤體積，由表1可見:4～10周內(nèi)，隨著時(shí)間增長(zhǎng)，腫瘤體積不斷增大，且不同時(shí)期（生長(zhǎng)周數(shù)）腫瘤體積差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=52.865，P＜0.05）。進(jìn)一步分析得出，腫瘤平均體積與生長(zhǎng)周數(shù)呈正線性相關(guān)（r=0.910），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表2，圖7）。

表 1 實(shí)驗(yàn)兔生長(zhǎng)情況Tab. 1 General introduction of the experimental rabbits

圖 1 移植瘤接種后第3周MR圖像Fig. 1 MR images 3 weeks after building model

圖 2 移植瘤接種后第4周MR圖像Fig. 2 MR images 4 weeks after building model

圖 3 移植瘤接種后第7周MR圖像Fig. 3 MR images 7 weeks after building model

圖 4 移植瘤接種后第8周MR圖像Fig. 4 MR images 8 weeks after building model

圖 5 移植瘤接種后第9周MR圖像Fig. 5 MR images 9 weeks after building model

圖 6 移植瘤接種后第10周MR圖Fig.6 MR images 10 weeks after building model

2.2 腸周淋巴結(jié)生長(zhǎng)情況

MR圖像上觀察腸周淋巴結(jié)（表1，圖1～6）。實(shí)驗(yàn)兔前5周（圖1～2）腸周未見明顯腫大淋巴結(jié)，解剖后對(duì)直腸及盆腔進(jìn)行詳細(xì)檢查，也未見明顯腫大淋巴結(jié)。第6周時(shí)，MR掃描見1只實(shí)驗(yàn)兔腸周出現(xiàn)1枚類圓形的腫大淋巴結(jié)，邊緣較清晰，解剖后摘除此枚淋巴結(jié)后病理證實(shí)為轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)。第7周MR掃描（圖3），2只實(shí)驗(yàn)兔分別可見1枚明顯腫大淋巴結(jié)，術(shù)后病理均證實(shí)為轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)。第8周MR掃描（圖4），2只實(shí)驗(yàn)兔分別見2枚腫大淋巴結(jié)，形態(tài)欠規(guī)則，T2WI信號(hào)不均勻，摘除后病理證實(shí)均為轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)。第9周MR掃描2只實(shí)驗(yàn)兔，其中腫瘤體積較小的1只實(shí)驗(yàn)兔腸周見3枚腫大淋巴結(jié)（圖5），T2WI信號(hào)不均勻，有壞死部分，病理證實(shí)3枚均為轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)；另1只腫瘤體積較大的實(shí)驗(yàn)兔腸系膜周見9枚異常強(qiáng)化淋巴結(jié)，沿腸系膜呈串珠樣分布，部分相互融合，T2信號(hào)不均勻，病理證實(shí)為8枚轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)及1枚癌結(jié)節(jié)。其中1只實(shí)驗(yàn)兔于第9周的第3天衰竭而死亡，第10周MR掃描時(shí)僅剩1只實(shí)驗(yàn)兔，MR上見10枚呈串樣分布的異常腫大淋巴結(jié)（圖6），T2WI信號(hào)亦不均勻，病理證實(shí)為8枚轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)及2枚癌結(jié)節(jié)。第9周開始，實(shí)驗(yàn)兔腸周轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)個(gè)數(shù)開始明顯增多。

2.3 淋巴結(jié)個(gè)數(shù)與腫瘤體積的關(guān)系

當(dāng)腫瘤體積小于等于9 cm3時(shí)，5只實(shí)驗(yàn)兔均未出現(xiàn)轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)，腫瘤體積超過9 cm3但不足30 cm3時(shí)，3只實(shí)驗(yàn)兔出現(xiàn)1枚轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)，腫瘤體積大于等于30 cm3但不足53 cm3時(shí)，3只實(shí)驗(yàn)兔有2或3枚轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)。當(dāng)腫瘤體積大于等于70 cm3時(shí)，轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)個(gè)數(shù)明顯增多，多達(dá)8枚（表1）。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，腫瘤體積越大，轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)個(gè)數(shù)越多（F=92.531，P＜0.05），且兩者呈線性相關(guān)（r=0.945，P＜0.05，表3，圖8）。

2.4 直腸癌模型組織學(xué)特征

腫瘤組織活檢并行HE染色（圖9）。低倍鏡下可見浸潤(rùn)性癌巢，無(wú)明顯邊界，間質(zhì)分界不清，結(jié)締組織較少，癌巢邊緣分布著被浸潤(rùn)的腸壁結(jié)構(gòu)。腫瘤細(xì)胞彌散排列，可見纖維間隔，新生毛細(xì)血管豐富。高倍鏡下見瘤細(xì)胞體積大，形態(tài)不規(guī)則，呈不規(guī)則排列；細(xì)胞質(zhì)豐富，淡紅染色；核肥大，其大小及形態(tài)各異，染色深淺不均，核分裂象多見。

2.5 轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)組織學(xué)特征

腸周淋巴結(jié)組織活檢并行HE染色（圖10）。低倍鏡下見正常淋巴結(jié)結(jié)構(gòu)被破壞，出現(xiàn)轉(zhuǎn)移性腫瘤組織，高倍鏡下見腫瘤組織成巢狀結(jié)構(gòu)排列。腫瘤細(xì)胞體積增大，邊界欠清，核漿比增大，細(xì)胞質(zhì)豐富粉染，細(xì)胞核增大深染，可見病理性核分裂象。

表 2 腫瘤體積與生長(zhǎng)周數(shù)關(guān)系Tab. 2 The relationship between tumor volume and growing number of weeks

表 3 淋巴結(jié)個(gè)數(shù)與腫瘤體積關(guān)系Tab. 3 The relationship between the tumor volume and lymph node number

2.6 癌結(jié)節(jié)組織學(xué)特征

腸周癌結(jié)節(jié)組織活檢并行HE染色（圖11）。低倍鏡下腫瘤組織邊界不清，腫瘤細(xì)胞成實(shí)性片狀分布，部分區(qū)呈乳頭狀分布。高倍鏡下腫瘤細(xì)胞呈圓形或橢圓形，細(xì)胞較一致，核仁明顯，染色質(zhì)粗顆粒狀，分布不均，淡紅染色；核肥大，見病理性核分裂象。

圖 7 生長(zhǎng)周數(shù)與腫瘤體積關(guān)系Fig. 7 The relationship between growing number of weeks and volume of tumor

圖 8 淋巴結(jié)個(gè)數(shù)與腫瘤體積關(guān)系Fig. 8 The relationship between number of lymph nodes and volume of tumor

圖 9 移植瘤病理HE染色Fig. 9 Tissue section with HE staining of VX2 tumor

圖 10 轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)病理HE染色Fig. 10 Tissue section with HE staining of metastatic lymphnodes

圖 11 癌結(jié)節(jié)病理HE染色Fig. 11 Tissue section with HE staining of extranodal tumordeposits

3　討　論

腫瘤已成為人類死亡的主要原因之一［5-6］，其中結(jié)直腸癌是常見的惡性腫瘤之一［7］，直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型是研究腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及抗腫瘤治療的工具［8-10］。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，主要有以下幾種方式。化學(xué)誘發(fā)模型，即使用化學(xué)致癌物通過灌腸和口服等使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物發(fā)生結(jié)直腸癌，但致癌物質(zhì)誘癌過程需時(shí)較長(zhǎng)［11-12］，腫瘤發(fā)生的潛伏期個(gè)體變異大，不易同時(shí)獲得腫瘤大小較均一的動(dòng)物模型［13］。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物腫瘤模型，是利用分子生物學(xué)手段，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物基因進(jìn)行改造或修飾，從而培育出相應(yīng)腫瘤的動(dòng)物模型［14］。但目前對(duì)于癌基因及抑癌基因還有待深入研究，所以這種建模方法目前并不實(shí)用，只能作為一種研究方向。還有一種就是移植性腫瘤模型，是目前應(yīng)用最多的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀Ｋ菍⑼庠葱阅[瘤的瘤塊或細(xì)胞移植到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)生長(zhǎng)，從而形成腫瘤，此方法因其成瘤率高而被廣泛使用。按照移植部位不同，又可分為原位移植、皮下移植［15］，這兩種移植方式也最為多見。為了盡可能模擬直腸癌自然生長(zhǎng)、局部浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移的過程，從而產(chǎn)生與人直腸癌類似的生物學(xué)特征，因此此次造模選擇了原位移植的方式。

原位移植根據(jù)移植方法的不同又可以分為細(xì)胞移植和組織塊移植。細(xì)胞移植是將一定濃度的體外培養(yǎng)的細(xì)胞懸液注射在動(dòng)物相應(yīng)部位，不少學(xué)者已使用此方法成功制作出直腸癌模型［16-17］。在前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)中，筆者也嘗試此種方法，亦成功制作出直腸癌模型，并出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，但是，由于使用針筒注射時(shí)往往因阻力不均及術(shù)者用力不均或手法不嫻熟，出現(xiàn)細(xì)胞懸液外漏的情況或注射入實(shí)驗(yàn)兔腸壁的細(xì)胞懸液差異較大，在相同的生長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)，腫瘤體積差異較大。

組織塊移植是以將瘤組織小塊接種的方法將腫瘤原位植入動(dòng)物體內(nèi)，通過原位移植的腫瘤組織細(xì)胞完整，且細(xì)胞間的協(xié)同性好，模型的生物學(xué)行為較為穩(wěn)定。文獻(xiàn)最常報(bào)道的是裸鼠的原位移植，眾所周知，裸鼠體積小，麻醉及手術(shù)對(duì)裸鼠造成的創(chuàng)傷大，術(shù)后可能發(fā)生腸梗阻［18］，進(jìn)行腫瘤原位移植時(shí)需要嫻熟而精準(zhǔn)的外科操作，對(duì)手術(shù)器械的選擇要求也高，手術(shù)時(shí)間不宜過長(zhǎng)，因此對(duì)于無(wú)外科基礎(chǔ)及初學(xué)者來講相對(duì)困難。此次筆者嘗試選用了體積較大、易進(jìn)行操作的新西蘭大白兔。

本實(shí)驗(yàn)選用的移植瘤為VX2腫瘤，VX2腫瘤細(xì)胞株起源于shope病毒誘發(fā)的兔乳頭狀瘤的鱗癌，經(jīng)過72次移植傳代后正式建立株，命名為VX2，由于兔缺乏針對(duì)該腫瘤的抗體，因此可作為穩(wěn)定可移植的腫瘤細(xì)胞株，具有生長(zhǎng)迅速、侵襲力強(qiáng)、血供豐富及早期即可發(fā)生轉(zhuǎn)移的優(yōu)勢(shì)；但此腫瘤為鱗癌，因此與人類直腸腺癌相比更易發(fā)生壞死。目前有移植到兔的腎臟、肝臟等部位制成的原位腫瘤動(dòng)物模型的報(bào)道。

本組成模率為65%，VX2腫瘤原位移植術(shù)后，我們通過觀察MR掃描后圖像判斷是否成瘤，CT掃描也可用于觀察，但是CT軟組織分辨率不高，腫瘤較小時(shí)觀察會(huì)有局限性；兔子肛門較小，超聲探頭難以進(jìn)入，故超聲也不作為觀察工具，目前尚無(wú)在接種后短期內(nèi)判斷是否成瘤的方式，如何盡早判斷成瘤，也是本課題組之后研究的重點(diǎn)。但是通過本實(shí)驗(yàn)小組的觀察，若第4、5周行MR檢查未在實(shí)驗(yàn)兔直腸上觀察到腫瘤，則說明造模失敗。此次造模部分未能成功，分析原因可能為:① 瘤塊自身活性低，移植后不易生長(zhǎng)；② 兔直腸壁薄，未能將瘤塊移植入實(shí)驗(yàn)兔腸壁；③ 將瘤塊植入直腸壁后，OB膠封閉不嚴(yán)。因此在以后的造模過程中，我們通過以下方式進(jìn)行改善:① 盡可能選取腫瘤邊緣生長(zhǎng)旺盛的部位，取其最質(zhì)韌部分；② 盡可能多地訓(xùn)練移植術(shù)，增加成功概率；③ 使用OB膠封閉穿刺口0.5 h后，進(jìn)行第2次涂抹，以防封閉不嚴(yán)。

在VX2腫瘤原位移植術(shù)后，無(wú)實(shí)驗(yàn)兔因手術(shù)創(chuàng)傷而死亡。惡性腫瘤的生長(zhǎng)速度快慢取決于細(xì)胞周期的長(zhǎng)短、增殖比例及其他因素等綜合作用，大多數(shù)惡性腫瘤的生長(zhǎng)速度不是恒定不變的，而是交錯(cuò)出現(xiàn)迅速生長(zhǎng)和相對(duì)的穩(wěn)定的狀態(tài)。本次建模過程中VX2移植瘤生長(zhǎng)速度較快，在相同的生長(zhǎng)周期內(nèi)，不同實(shí)驗(yàn)兔個(gè)體間腫瘤體積雖然存在差異，但總體上看來腫瘤體積隨著時(shí)間推移而不斷增大且呈正相關(guān)。移植瘤較易觀察，實(shí)驗(yàn)兔一般狀況尚可。第6周后腫瘤中心開始?jí)乃?，后期腫瘤浸潤(rùn)盆腔組織，出現(xiàn)相應(yīng)的并發(fā)癥，部分實(shí)驗(yàn)兔衰竭死亡。

此次建模最終目的是觀察VX2移植性兔直腸癌是否能發(fā)生腸周淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，在成功接種移植瘤的前5周內(nèi)未出現(xiàn)轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)，自第6周開始出現(xiàn)轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)，直至第10周，出現(xiàn)8枚以上轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)。轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)個(gè)數(shù)也與腫瘤體積呈正相關(guān)。第9周之前，MR上診斷為轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)的結(jié)節(jié)經(jīng)病理證實(shí)均為轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)。病理證實(shí)第9、10周亦出現(xiàn)癌結(jié)節(jié)，但在MR觀察時(shí)，此結(jié)節(jié)在T2WI上表現(xiàn)為不均勻高信號(hào)，形態(tài)飽滿，邊緣毛糙，誤認(rèn)為是轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)，出現(xiàn)假陽(yáng)性，但在MR上兩者較難鑒別。

本實(shí)驗(yàn)將組織學(xué)完整的VX2移植瘤組織塊原位種植到新西蘭大白兔直腸內(nèi)，成功地建立了VX2移植性兔直腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型。在移植后第4～7周，腫瘤生長(zhǎng)迅速，以腫瘤本身生長(zhǎng)為主，且質(zhì)地均勻，若僅僅是以研究直腸腫瘤本身而言，此時(shí)期為最佳研究時(shí)期。在移植后第6周直腸腫瘤周圍開始出現(xiàn)轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)，因此對(duì)研究直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移這一內(nèi)容而言，移植第6周后為最佳研究時(shí)期。直腸癌周圍轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)，自移植后第7周開始T2信號(hào)不均勻。綜上所述，此模型對(duì)于研究直腸癌的局部生長(zhǎng)、浸潤(rùn)機(jī)制、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶及生物學(xué)特性均有一定價(jià)值。學(xué)者們可以根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)要求（觀察腫瘤本身還是轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)），選擇移植后不同生長(zhǎng)時(shí)期的實(shí)驗(yàn)兔進(jìn)行研究。

理想的直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型應(yīng)具備以下幾個(gè)特點(diǎn):① 盡可能模擬人類直腸癌生長(zhǎng)、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移過程；② 造模成功率高，動(dòng)物模型一般情況好且存活時(shí)間較長(zhǎng)；③ 模型的建立不僅可行而且具有可重復(fù)性的特點(diǎn)。雖然，此次模型模擬了直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，但也不能滿足上述標(biāo)準(zhǔn)。各種建立模型的方法都有優(yōu)缺點(diǎn)，應(yīng)該根據(jù)自己的需要選擇適合的動(dòng)物模型。

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Lymph node metastatic models of VX2 tumor in New Zealand white rabbits and their biological

characteristics

SUN Yiqun1， TONG Tong1， MAO Jian1， ZHONG Fangfang2， GU Yajia1
（1.Department of Radiology， Fudan University Shanghai Cancer Center； Department of Oncology， Shanghai Medical College，F(xiàn)udan University， Shanghai 200032， China； 2.Department of Pathology， Fudan University Shanghai Cancer Center， Department of Oncology， Shanghai Medical College， Fudan University， Shanghai 200032， China）
Correspondence to: GU Yajia E-mail: cjr.guyajia@vip.163.com

Background and purpose: The lymph node metastatic model of rectal tumor is a useful tool for the research on tumor occurrence， development， metastasis and antineoplastic therapy. There are few reports about establishment of larger animal model. This study aimed to establish feasible and reproducible lymph node metastatic models of VX2 tumor in rabbits. Methods: The VX2 tumor tissue was put into the puncture needle. The VX2 tumor tissue in the needle was orthotopically transplanted into the rectal wall of the New Zealand white rabbits successfully. Twenty New Zealand white rabbits were transplanted. Two experimental rabbits were scanned by MR weekly. Tumor growth curve and lymph node numbers were observed on MR. Experimental rabbit tumor volumes were measured by MR post-processing software. The rectal tumor and surrounding lymph nodes were resected， and the specimens were fixed. The sections were stained with HE. We explored the relationship between tumor volume and growth time，the number of metastatic lymph nodes and tumor volume， respectively. Results: Thirteen models were successfully established with a rate of 65%. Tumors limited in the rectal wall were observed on the fourth week. Tumor sizeincreased over time. There was significant difference in the tumor volume between different periods （growth cycle number） （F=52.865， P＜0.05）. There was a significantly positive correlation between tumor volume and the growth cycle number （r=0.910， P＜0.05）. The metastatic lymph nodes could be observed when VT＞9 cm3. The number of metastatic lymph node increased obviously from the ninth week. The more tumor volume， the greater the number of metastatic lymph nodes was observed （F=92.531， P＜0.05）. There was a significantly positive correlation between the number of metastatic lymph nodes and the tumor volume （r=0.945， P＜0.05）. Conclusion: Metastatic lymph node models of VX2 tumor in New Zealand white rabbits were established successfully. This model has some value in the research on local growth， invasion mechanism， lymph node metastasis and biological characteristics of rectal cancer.

Model； Rectal cancer； Metastatic lymph node

10.19401/j.cnki.1007-3639.2016.10.006

R735.3

A

1007-3639（2016）10-0840-08

顧雅佳 E-mail: cjr.guyajia@vip.163.com

（2015-07-14

2015-11-19）