miR-196a2單核苷酸多態(tài)性與白血病發(fā)病風(fēng)險的初步研究

張文娟，田 喆，李有杰，商文靜，謝 寧，常 靖，肖 靜，鮑雪臨

1.煙臺山醫(yī)院血液內(nèi)科，山東 煙臺 264008；

2.濱州醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系，山東 煙臺 264003；

3.濱州醫(yī)學(xué)院高校腫瘤分子生物學(xué)重點實驗室，山東 煙臺 264003；

4.煙臺山醫(yī)院心胸外科，山東 煙臺 264008；

5.煙臺山醫(yī)院腎內(nèi)科，山東 煙臺 264008

miR-196a2單核苷酸多態(tài)性與白血病發(fā)病風(fēng)險的初步研究

張文娟1，田 喆2，李有杰3，商文靜3，謝 寧4，常 靖5，肖 靜1，鮑雪臨1

1.煙臺山醫(yī)院血液內(nèi)科，山東 煙臺 264008；

2.濱州醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系，山東 煙臺 264003；

3.濱州醫(yī)學(xué)院高校腫瘤分子生物學(xué)重點實驗室，山東 煙臺 264003；

4.煙臺山醫(yī)院心胸外科，山東 煙臺 264008；

5.煙臺山醫(yī)院腎內(nèi)科，山東 煙臺 264008

背景與目的：miR-196a2在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起類似于原癌基因的生物學(xué)功能。其表達升高會促進腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，有望成為重要的腫瘤標志物。該研究旨在探討miR-196a2基因多態(tài)性位點rs11614913與白血病發(fā)病風(fēng)險的關(guān)系。方法：采用病例-對照分析方法，收集2009年1月—2015年7月在煙臺山醫(yī)院檢查確診的210例白血病患者（病例組）及同期體格檢查健康的250名正常體檢者（對照組）的骨髓血或外周血，限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）檢測miR-196a2基因多態(tài)性位點rs11614913的基因型，應(yīng)用χ2檢驗比較各基因型頻率在病例組和對照組中的差異，采用Logistic回歸分析計算SNP的等位基因的比值比（odds ratio，OR）和95%CI表示各基因型發(fā)生白血病的風(fēng)險度。結(jié)果：病例組和對照組相比，miR-196a2 rs11614913的T/T、C/C、C/T基因型頻率的分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），攜帶突變型純合子C/C基因型的個體患白血病風(fēng)險是野生純合子T/T基因型個體的2.661倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：miR-196a2基因多態(tài)性位點rs11614913與白血病發(fā)病風(fēng)險有關(guān)，突變型純合子C/C或攜帶C等位基因可能是白血病發(fā)生的危險因素。

miR-196a2；rs11614913；單核苷酸多態(tài)性；限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)；白血病

白血病是我國高發(fā)病率的惡性腫瘤之一，患者生存期短，死亡率高，對人類健康構(gòu)成巨大威脅。明確白血病發(fā)病機制，提高治療效果，是當(dāng)前研究工作的重要目標。白血病是多種環(huán)境因素與遺傳因素互相作用的結(jié)果，國內(nèi)外學(xué)者對白血病相關(guān)基因多態(tài)性和發(fā)病風(fēng)險已有不少研究，其中在HLA基因多態(tài)性［1-2］、生物代謝酶基因多態(tài)性［3-4］等方面有重大發(fā)現(xiàn)。MicroRNA（miRNA）是大小約為21～25個堿基的單鏈小分子，是一類在生物進化過程中高度保守的非編碼小分子RNA。人類大約60%編碼蛋白基因受到miRNA的調(diào)控，在大多數(shù)的基因通路上調(diào)節(jié)多種生物學(xué)過程［5］。有研究顯示，人類基因組廣泛存在的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）被證明與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤、轉(zhuǎn)移、侵襲及增殖等過程相關(guān)［6-8］。miR-196a2的rsl1614913（T/C）是位于miRNA前體（pre-miRNA）區(qū)域的潛在功能SNP，該SNP基因位點與多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)［9］。目前國內(nèi)外少見對于miR-196a2中rs11614913多態(tài)性與白血病相關(guān)性研究的文獻報道。本研究通過病例-對照方法，利用限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）研究兩組人群中miR-196a2基因多態(tài)性，探討miR-196a2遺傳變異與白血病發(fā)病風(fēng)險的相關(guān)性，為明確白血病的發(fā)病機制提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料和方法

1.1 研究對象

樣本來源于2009年1月—2015年7月煙臺山醫(yī)院收治的白血病患者與同期體格檢查健康的正常體檢者（篩選程序符合倫理學(xué)標準，受試者知情且同意）。其中210例白血病患者（病例組）及250例年齡、性別相匹配的正常對照人群（對照組）的年齡范圍為4～88歲。兩組研究對象的年齡、性別等一般構(gòu)成情況差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，表1）。

表 1 病例組與對照組一般情況的比較Tab. 1 Comparison of general conditions between the case group and control group

1.2 實驗準備

1.2.1主要試劑

DNA抽提試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司，蛋白酶K購自生工生物工程（上海）股份有限公司，RNA酶購自寶生物工程（大連）有限公司，PCR試劑盒和限制性內(nèi)切酶Msp Ⅰ購自寶生物工程（大連）有限公司，引物由上海賽百盛基因技術(shù)有限公司合成，瓊脂糖購自寶生物工程（大連）有限公司，DNA Ladder Maker購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2.2實驗儀器

DYY-BC雙穩(wěn)定時電泳儀購自北京六一生物科技有限公司，6F-dox3-0818全自動數(shù)碼凝膠圖像處理系統(tǒng)購自上海天能科技有限公司，Eppendorf梯度PCR儀購自德國Eppendorf公司，DW-FL208超低溫冷凍儲存箱購自中科美菱低溫科技股份有限公司。

1.2.3引物設(shè)計

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中基因序列，設(shè)計出miR-196a2基因擴增引物。上游引物序列:5’-CCCCTTCCCTTCTCCTCCAGATA-3’；下游引物序列:5’-CGAAAACCGACTGA TGTAACTCCG-3’。

1.2.4限制性內(nèi)切酶選擇

通過Pubmed SNP和Hapmap SNP等數(shù)據(jù)庫，確定miR-196a2基因（pri-miRNA）中rs11614913多態(tài)的位置。運用軟件NEBcutter V2.0［10］將長度為149 bp的miR-196a2基因片段序列輸入后，篩選出識別覆蓋rs11614913多態(tài)位點的限制性內(nèi)切酶Msp I。根據(jù)酶切位點，miR-196a2基因多態(tài)性位點rs11614913基因型C/T產(chǎn)生149、125和24 bp 3個片段，C/C有125和24 bp 2個片段，T/T有149 bp 1個片段。

1.3 DNA提取及基因型鑒定

經(jīng)DNA抽提試劑盒推薦方法提取DNA，放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩CR反應(yīng)體系共25.0 μL，含上下游引物各1 μL、2×Buffer 12.5 μL、提取的DNA 0.1～0.2 μL、dNTP 2 μL、Taq DNA聚合酶 0.4 μL，加蒸餾水定容至25.0 μL。PCR反應(yīng)條件為:94 ℃ 10 min預(yù)變性；94 ℃變性30 s，56 ℃ 30 s退火，72 ℃ 20 s延伸，30個循環(huán)；最后再72 ℃充分延伸5 min。酶切反應(yīng)體系為20.0 μL，其中PCR產(chǎn)物3 μL，10×Buffer 2 μL，限制性內(nèi)切酶（Msp Ⅰ）0.5 μL，加蒸餾水定容至20 μL，37 ℃水浴30～60 min。酶切產(chǎn)物經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳，穩(wěn)壓80 V，電流200 mA，紫外成像。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

運用SPSS 17.0軟件包對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理。計數(shù)變量比較采用χ2檢驗，并用χ2檢驗分析病例與對照的基因型頻率是否符合哈迪-溫伯克（Hardy-Weinberg）平衡，同時采用二元回歸分析方法，分析miR-196a2基因多態(tài)性與白血病之間的關(guān)系。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1 210例白血病類型及其亞型統(tǒng)計結(jié)果

210例白血病類型及其亞型統(tǒng)計結(jié)果見表2。

表 2 210例白血病類型及其亞型統(tǒng)計Tab. 2 210 cases of leukemia and its subtypes

2.2 PCR-RFLP結(jié)果

miR-196a2基因PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖見圖1。經(jīng)限制性內(nèi)切酶Msp Ⅰ酶切后凝膠電泳圖見圖2。

2.3 miR-196a2（rs11614913）與白血病發(fā)病風(fēng)險的關(guān)系

病例組和對照組miR-196a2基因型頻率見表3。攜帶突變純合子C/C基因型的個體患白血病的風(fēng)險分別是野生純合子T/T基因型個體以及T基因的攜帶者（C/T+T/T）的2.661倍和2.218倍（P＜0.05），說明攜帶C/C基因型的個體其患白血病可能性較高；相對于T等位基因，攜帶C等位的基因型將可能是白血病發(fā)生的危險因素。

圖 1 PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of PCR amplified products M: 100 bp DNA ladder maker

圖 2 Msp Ⅰ 酶切后凝膠電泳Fig. 2 Msp Ⅰ gel electrophoresis figure after enzyme digestion M: 20 bp DNA ladder maker

2.4 miR-196a2基因（rs11614913）多態(tài)性與白血病的相關(guān)性

miR-196a2基因多態(tài)性位點rs11614913基因型（T/T、C/C、C/T）在病例組和對照組中的分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=11.665，P＜0.05，表4）。

表 3 miR-196a2基因（rs11614916）多態(tài)在病例組和對照組中分布對比Tab. 3 miR-196a2 gene polymorphism （rs11614913） distribution in the case group and the control group

表 4 miR-16a2基因（rs11614913）多態(tài)性與白血病相關(guān)性Tab. 4 miR-196a2 genetic polymorphism （rs11614913） associated with leukemia

3　討　論

白血病的發(fā)病存在著種族和地域差異。有研究顯示，油田、煤礦和生活污染區(qū)白血病發(fā)病率較高，而農(nóng)村較低。全國白血病發(fā)病呈分散式，南、北無明顯差異。1年中，第1季度發(fā)病較多，第4季度發(fā)病較少，其中ANLL和CML季節(jié)發(fā)病差異顯著。白血病的總體發(fā)病率呈緩慢增長的趨勢［11］。

miRNA基因不編碼蛋白質(zhì)，但是其產(chǎn)物可以借助堿基互補的原則調(diào)節(jié)下游多達數(shù)千種編碼蛋白質(zhì)功能基因的表達，對腫瘤的發(fā)生可能有重要意義［12］。近年來，miRNA的基因多態(tài)性的研究很受關(guān)注，尤其miR-196a2（rs11614913）是這兩年研究的熱點。miR-196a2基因定位于人類第12號染色體上，其表達產(chǎn)物（成熟miRNA）借助堿基互補與下游多種基因的3’-UTR區(qū)域結(jié)合，誘導(dǎo)靶基因mRNA沉默，在白血病的發(fā)病過程中可能起重要作用。在miR-196a2的成熟miRNA互補區(qū)中存在的SNP（rs11614913）與乳腺癌［13］、肺癌［14］、胃癌［15］和肝癌［16-17］的發(fā)生風(fēng)險呈正相關(guān)。Tian等［18］通過研究1 058例肺癌患者和1 035例非癌癥患者中miR-196a2 4種SNP（rs2910164、rs2292832、rs11614913和rs3746444）在前體miRNA和肺癌易感性之間的聯(lián)系后發(fā)現(xiàn)，miR-196a2（rs11614913）變異純合子C/C比野生純合子T/T和雜合子C/T患肺癌風(fēng)險高25%。

本研究表明，攜帶C/C基因型的個體其患白血病可能性較高；相對于攜帶T的基因型，攜帶C的基因型將可能是白血病發(fā)生的危險因素。Okubo等［19］研究發(fā)現(xiàn)，攜帶T等位基因的個體罹患胃癌、食管癌的發(fā)病風(fēng)險高于攜帶C等位基因的個體，說明miR-196a2基因中的rs11614913位點與腫瘤的易感性存在組織特異性。

miR-196a2作為一個腫瘤促進因子，未來可能成為腫瘤治療的一個新靶點。然而，目前miR-196a2的復(fù)雜關(guān)系網(wǎng)絡(luò)研究尚不成熟，其生物學(xué)功能和調(diào)控機制還需進一步研究；而且miR-196a2（rs11614913）與急、慢性白血病的關(guān)系的研究也需要進一步深入。

［1］ 劉 楠， 林曉娥， 袁 方， 等. HLA-A/B/C/DRB1/DQB1基因多態(tài)性與急性淋巴細胞白血病關(guān)聯(lián)分析［J］. 軍事醫(yī)學(xué)，2013， 37（8）: 574-577.

［2］ MACHULLA H K， MULLER L P， SCHAAF A， et al. Association of chronic lymphocytic leukemia with specific alleles of the HLA- DR4: DR53: DQ8 haplotype in German patients ［J］. Int J Cancer， 2001， 92（2）: 203-207.

［3］ AYDIN S M， HATIRNAZ O， ERENSOY N， et al. Role of CYP2D6， CYP1A1， CYP2E1， GSTT1 and GSTM1 genes in the susceptibility to acute leukemias［J］. Am J Hematol，2006， 81（3）: 162-170.

［4］ 任艷飛， 岳麗杰. 谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶P1基因多態(tài)性與兒童急性白血病易感性關(guān)系的研究進展［J］. 廣東醫(yī)學(xué)， 2014，35（17）: 2779-2781.

［5］ ESQUELA-KERSCHER A， SLACK F J. OncomirsmicroRNAs with a role in cancer［J］.Nat Rev Cancer， 2006，6（4）: 259-269.

［6］ WOJCICKA A， DE LA CHAPELLE A， JAZDZEWSKI K. MicroRNA-related sequence variation in human cancers［J］. Hum Genet， 2014， 133（4）: 463-469.

［7］ POSSEMATO R， MAKS K M， SHAUL Y D， et al. Functional genomies reveal that the serine synthesis pathway is essential in breast cancer ［J］. Nature， 2011， 476（7360）: 346-350.

［8］ DJURANOVIC S， NAHVI A， GREEN R. A parsimonious model for gene regulation by miRNAs ［J］. Science， 2011，331（6017）: 550-553.

［9］ WANG P， XIE S， CUI A， et al. miR-196a2 polymorphisms and suscetibility to cancer: A meta-analysis involving 24 697 subjects［J］. Exp Ther Med， 2012， 3（2）: 324-330.

［10］ New England Biolab Inc.NEBcutter V2.0［J/O］ http://tools. neb.com /NEBcutter2/.

［11］ 劉玉琴， 趙鳳菊， 陳萬青， 等. 中國2009年白血病發(fā)病和死亡資料分析［J］. 中國腫瘤， 2013， 22（7）: 528-534.

［12］ LEE K H， GOAN Y G， HSIAO M， et al. MicroRNA-373（miR-373） post-transcriptionally regulates large tumor suppressor， homolog 2（LATS2） and stimulates proliferation in human esophageal cancer［J］. Exp cell Res， 2009， 315（15）: 2529-2538.

［13］ HU Z， LIANG J， WANG Z， et al. Common genetic variants in pre-microRNAs were associated with increased risk of breast cancer in Chinese women［J］. Hum Mutat， 2009， 30（1）: 79-84.

［14］ KIM M J， YOO S S， CHOI Y Y， et al. A functional polymorphism in the pre-microRNA-196a2 and the risk of lung cancer in a Korean population［J］. Lung Cancer， 2010，69（1）: 127-129.

［15］ PENG S， KUANG Z， CHENG C， et al. Association of microRNA-196a-2 gene polym or phism with gastric cancer risk in a Chinese population［J］. Dig Dis Sci， 2010， 55（8）: 2288-2293.

［16］ QI P， DOU T H， GENG L， et al. Association of a variant in MIR 196A2 with susceptibility to hepatocellular carcinoma in male Chinese patients with chronic hepatitis B virus infection［J］. Hum Immunol， 2010， 71（6）: 621-626.

［17］ LI X D， LI Z G， SONG X X， et al. A variant in microRNA-196a2 is associated with susceptibility to hepatocellular carcinoma in Chinese patients with cirrhosis［J］. Pathology，2010， 42（7）: 669-673.

［18］ TIAN T， SHU Y， CHEN J， et al. A functional genetic variant in microRNA-196a2 is associated with increased susceptibility of lung cancer in Chinese［J］. Cancer Epidemiol Biomaekers Prev， 2009， 18（4）: 1183-1187.

［19］ OKUBO M， TAHARA T， SHIBATA T， et al. Association between common genetic variants in pre-microRNAs and gastric cancer risk in Japanese population［J］. Helicobacter，2010， 15（6）: 693-702.

A preliminary study on relationship between single nucleotide polymorphism of miR-196a2 and risk

of leukemia

ZHANG Wenjuan1， TIAN Zhe2， LI Youjie3， SHANG Wenjing3， XIE Ning4， CHANG Jing5，XIAO Jing1， BAO Xuelin1（1.Department of Hematology， Yantaishan Hospital， Yantai 264008， Shandong Province， China； 2.Department of Clinical Medicine， Binzhou Medical College， Yantai 264003， Shandong Province， China； 3.Key Laboratory of Tumor Molecular Biology， Binzhou Medical College， Yantai 264003，Shandong Province， China； 4.Department of Cardiothoracic Surgery， Yantaishan Hospital， Yantai 264008，Shandong Province， China； 5.Department of Nephrology， Yantaishan Hospital， Yantai 264008， Shandong Province， China）
Correspondence to: ZHANG Wenjuan E-mail: zhwjisq@163.com

Background and purpose: miR-196a2 functions as an oncogene during tumor initiation and progression. The up-regulation promotes tumor cell proliferation， invasion and metastasis. Therefore， it is promising to be an important tumor biomarker. The aim of this study was to investigate whether rs11614913， a gene polymorphic site of miR-196a2， is associated with the risk of leukemia. Methods: A case-control analysis was employed. Bone marrow or peripheral blood was collected from 210 leukemia patients diagnosed from Jan. 2009 to Jul. 2015 in Yantaishan Hospital （case group） as well as 250 healthy people who were physically examined during the same period （control group）. Polymerasechain reaction-restriction fragment length polymorphism （PCR-PFLP） was used to detect the genotype of rs11614913. Application test was used to compare the difference in the frequency of each genotype between case group and control group. The odds ratio （OR） of SNP allelic genes was calculated using logistic regression analysis and 95%CI represented the risk of leukemia for each genotype. Results: The distribution differences in the frequency of T/T， C/C， C/T genotype of miR-196a2 rs11614913 between case group and control group were statistically significant （P＜0.05）. The risk of leukemia for individuals who carried mutant homozygous C/C was 2.661-fold higher than those carried wild-type homozygous T/T，and the difference was statistically significant （P＜0.05）. Conclusion: The miR-196a2 gene polymorphic site rs11614913 was associated with the risk of leukemia. Mutant homozygous C/C or C allelic gene carrying was probably a risk factor for leukemia.

miR-196a2； rs11614913； Single nucleotide polymorphism； Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism； Leukemia

10.19401/j.cnki.1007-3639.2016.10.004

R733.7

A

1007-3639（2016）10-0826-05

山東省高等學(xué)?？萍加媱潱↗13LE11）；煙臺市科技發(fā)展計劃（2013ES236）。

張文娟 E-mail: zhwjisq@163.com

（2015-11-24

2016-03-19）