親水色譜柱對氨基酸及其美拉德反應(yīng)初始中間體的分離

曹長春，梁晶晶，王 蒙，侯 莉，謝建春，孫寶國

（北京工商大學(xué) 食品質(zhì)量與安全北京實驗室，北京市食品風(fēng)味化學(xué)重點實驗室，北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心，北京 100048）

親水色譜柱對氨基酸及其美拉德反應(yīng)初始中間體的分離

曹長春，梁晶晶，王 蒙，侯 莉，謝建春*，孫寶國

（北京工商大學(xué) 食品質(zhì)量與安全北京實驗室，北京市食品風(fēng)味化學(xué)重點實驗室，北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心，北京 100048）

采用Xbridge BEH Amide和Atlantis HILIC Silica兩親水色譜柱分離半胱氨酸、甘氨酸及其與木糖形成的美拉德反應(yīng)初始中間體2-木糖基噻唑烷-4-羧酸、甘氨酸-Amadori和半胱氨酸-Amadori 5 個化合物。通過研究流動相中有機(jī)相（乙腈）的比例、緩沖鹽濃度、pH值、柱溫、流速對容量因子和分離度的影響，分別找到較佳分離條件。在BEH Amide色譜柱上5 個化合物之間的分離度均達(dá)到2.28以上，對比可知，采用BEH Amide色譜柱更好。

親水色譜；半胱氨酸；2-木糖基噻唑烷-4-羧酸；甘氨酸；甘氨酸-Amadori；半胱氨酸-Amadori；分離

半胱氨酸與還原糖發(fā)生美拉德反應(yīng)是產(chǎn)生含硫肉香味物質(zhì)的重要途徑[1-4]。在同時含有半胱氨酸和其他氨基酸的復(fù)雜美拉德反應(yīng)體系中，初始美拉德反應(yīng)階段半胱氨酸與其他氨基酸在與還原糖發(fā)生作用時存在競爭性[5-6]：可形成半胱氨酸-Amadori重排物和其他氨基酸-Amadori重排物，以及半胱氨酸因含有巰基官能團(tuán)形成2-糖基噻唑烷-4-羧酸中間體。為了解上述復(fù)雜反應(yīng)體系中半胱氨酸和其他氨基酸在初始美拉德反應(yīng)階段的競爭性，本課題組選用甘氨酸為“其他氨基酸”的代表，選用木糖為“還原糖”的代表，設(shè)計“半胱氨酸-木糖-甘氨酸”模型反應(yīng)體系，擬分析檢測不同反應(yīng)條件下的模型反應(yīng)體系內(nèi)初始美拉德反應(yīng)中間體的含量及其變化。發(fā)現(xiàn)模型體系內(nèi)存在的2-木糖基噻唑烷-4-羧酸、甘氨酸-Amadori、半胱氨酸-Amadori重排物及半胱氨酸、甘氨酸5 個化合物（圖1），極性相似，均具有較強(qiáng)的親水性，在常用的反相色譜（reversed phase liquid chromatography，RPLC）柱上保留很弱，不適于RPLC分離?，F(xiàn)有文獻(xiàn)[5-6]往往采用胺型陽離子交換色譜柱用于美拉德反應(yīng)中間體的分離，但實驗表明，采用這些方法對5個化合物（圖1）僅可實現(xiàn)一定程度地分離，且由于樣品中的糖分子中的羰基與固定相的氨基存在不可逆作用，色譜柱的穩(wěn)定性較差、使用壽命較短。

圖1 半胱氨酸（a）、2-木糖基噻唑烷-4-羧酸（b）、甘氨酸（cc）、甘氨酸-Amadori（d）和半胱氨酸-Amadori（ee）的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of cysteine (a), 2-xylulosylthiazolidine-4-carboxylic acid (b), glycine (c), glycine-Amadori (d), and cysteine-Amadori (e)

親水作用色譜（hydrophilic interaction liquid chromatography，HILIC）是近年發(fā)展的替代反相色譜用于強(qiáng)極性及親水性化合物分離的另一色譜模式。李玉珍等[7]利用Merck ZIC-HILIC色譜柱分離檢測保健食品中L-亮氨酸等3 種支鏈氨基酸的含量；張璐等[8]利用HILIC色譜分離檢測飲料中的4-甲基咪唑及其異構(gòu)體2-甲基咪唑。由于HILIC的特性，其應(yīng)用在各行業(yè)越來越廣泛[8-13]，但親水作用色譜在美拉德反應(yīng)中間體的分離檢測應(yīng)用報道還較少。

本實驗采用Xbridge BEH Amide及Atlantis HILIC Silica兩親水色譜柱，對半胱氨酸-Amadori重排物、2-木糖基噻唑烷-4-羧酸、甘氨酸-Amadori及半胱氨酸、甘氨酸5 種物質(zhì)的分離進(jìn)行研究。比較了兩親水柱的分離差異，考察了流動相中有機(jī)相比例、緩沖鹽濃度、pH值、柱溫等因素的影響，找到了較佳的分離條件。研究結(jié)果可為美拉德反應(yīng)動力學(xué)及美拉德反應(yīng)制備肉香味的機(jī)理研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

L-半胱氨酸、D-（+）-木糖、甘氨酸、L-半胱氨酸鹽酸鹽一水合物（均為生化試劑）、二水合磷酸二氫鈉、甲酸銨、甲酸、氫氧化銨、氫氧化鈉（均為分析純） 國藥集團(tuán)北京化學(xué)試劑有限公司；三油酸甘油酯（99%） 百靈威科技有限公司；乙腈（色譜純）迪馬科技有限公司；AG 50W-X4H-型陽離子交換樹脂美國Bio-Rad公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1100高效液相色譜儀 美國Agilent公司；SEDEX75蒸發(fā)光散射檢測器 法國Sedere公司；XWK-Ⅲ無油空氣泵 天津市華生分析儀器廠；BS-100A自動液相色譜分離層析儀 上海青浦滬西儀器廠；PHSJ-5型pH計 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；ALPHA 2-4 LSC冷凍干燥機(jī) 德國Christ公司；OSB-200油浴型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 日本Eyela公司；DF-101型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 河南鞏義市予華儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 初始Maillard反應(yīng)中間體的制備

按照如下方法制備反應(yīng)產(chǎn)物，然后陽離子交換樹脂處理，冷凍干燥得產(chǎn)品。陽離子交換樹脂利用自動液相色譜分離層析儀進(jìn)行，層析柱Φ1.6 cm×40 cm，紫外檢測波長220 nm。上樣后，先用去離子水淋洗，再用0.3 mol/L氨水洗脫，根據(jù)紫外檢測信號收集流分。

1.3.1.1 2-木糖基噻唑烷-4-羧酸

在裝有溫度計、回流冷凝管的150 mL三口燒瓶中，加入L-半胱氨酸鹽酸鹽一水合物3.5 g（0.02 mol）、D-（+）木糖3.3 g（0.022 mol）、磷酸氫二鈉7.2 g（0.02 mol）、水2.5 mL，放入集熱式恒溫加熱磁力攪拌器的水槽中，50 ℃反應(yīng)1 h得產(chǎn)物A，一次性全部上樣，陽離子交換樹脂柱處理，得2-木糖基噻唑烷-4-羧酸0.5 g，高效液相色譜分析相對峰面積為100%。

1.3.1.2 半胱氨酸-Amadori

按1.3.1.1節(jié)方法得產(chǎn)物A，然后用NaOH溶液調(diào)pH值至5，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除水得乳白色黏稠液體，再放入集熱式恒溫加熱磁力攪拌器的水槽中，70 ℃反應(yīng)3 h，得黃褐色黏稠液體，加水5 mL，一次性全部上樣，陽離子交換樹脂柱處理，得半胱氨酸-Amadori 0.3 g，高效液相色譜分析相對峰面積為95%～100%。

1.3.1.3 甘氨酸-Amadori

在裝有溫度計、回流冷凝管的250 mL四口燒瓶中，加入D-（+）-木糖40 g、甘氨酸5 g、焦亞硫酸鈉8 g、水8 mL，放入集熱式恒溫加熱磁力攪拌器的水槽中，90 ℃反應(yīng)20 min，得黑褐色黏稠液體，加水100 mL，每次上樣50 mL，陽離子交換樹脂柱處理，兩次共得甘氨酸-Amadori 4 g，高效液相色譜分析相對峰面積為100%。

1.3.2 樣品處理及高效液相色譜分離

按物質(zhì)的量比大約1∶1將L-半胱氨酸、2-木糖基噻唑烷-4-羧酸、甘氨酸、甘氨酸-Amadori、半胱氨酸-Amadori 5個化合物混合，用乙腈-水（50∶50，V/V）稀釋，配制成0.1 mmol/L樣品溶液。

Waters Xbridge BEH Amide（4.6 mm×150 mm，3.5 μ m）色譜柱和A t l a n t i s H I L I C S i l i c a（4.6 mm×150 mm，3 μm）色譜柱；進(jìn)樣量3 μL；蒸發(fā)光散射檢測器檢測，蒸發(fā)管溫度40 ℃，霧化氣（空氣）壓力3.5 bar，增益值5。

通過調(diào)節(jié)流動相中有機(jī)相（乙腈）的比例、緩沖鹽（甲酸銨溶液）濃度、pH值、柱溫、流速等色譜參數(shù)，研究各因素對分離的影響及尋找較佳的分離條件。

按式（1）、（2）計算容量因子（k）和分離度（RS）：

式中：tR為樣品的保留時間/min；t0為死時間（進(jìn)樣三油酸甘油酯得到）/min。

式中：tR1、tR2分別為前后相鄰兩個峰的保留時間/min；W1、W2為該兩色譜峰的峰寬。

2 結(jié)果與分析

2.1 BEH Amide色譜柱上的分離條件

2.1.1 流動相中有機(jī)相比例的確定

柱溫25 ℃，流動相為A（30 mmol/L甲酸銨溶液，pH 6）和B（乙腈），流速0.5 mL/min，所得色譜圖見圖2。

圖2 BEH Amide色譜柱上改變流動相中有機(jī)相比例所得色譜圖Fig.2 Chromatograms on the BEH Amide column when different ratios of the organic phase (CH3CN) were used in the mobile phase

圖2中5種物質(zhì)的出峰順序用標(biāo)準(zhǔn)品比對法確定。由圖2A可知，其他3 個化合物之間均實現(xiàn)分離，化合物c、d即甘氨酸與甘氨酸-Amadori共流出。圖2B中，其他3 個化合物之間的分離度較小，化合物c、d出現(xiàn)分離趨勢，因此考慮運(yùn)用梯度洗脫調(diào)節(jié)流動相中有機(jī)相比例。其他條件不變，梯度洗脫程序為：0～5 min，80%～60% B；5～15 min，60% B（梯度1），結(jié)果如圖2C所示，可知，5 個化合物均得到分離，但未實現(xiàn)基線分離。改變梯度洗脫程序為：0～5 min，95%～75% B；5～25 min，75%～65% B；25～30 min，65%～95% B（梯度2），如圖2D所示，化合物a、c之間及d、e之間分離度變大，但化合物b、c、d之間即2-木糖基噻唑烷-4-羧酸、甘氨酸和甘氨酸-Amadori之間仍未實現(xiàn)基線分離，因此繼續(xù)探討流動相中緩沖鹽濃度、pH值、柱溫等其他因素的影響。

2.1.2 流動相中緩沖鹽濃度的影響

洗脫程序為梯度2，柱溫及流速同2.1.1節(jié)，甲酸銨濃度由30 mmol/L改變?yōu)?0、10 mmol/L。所得色譜圖見圖3，分離參數(shù)的結(jié)果見表1。

圖3 BEH Amide色譜柱上改變流動相A中甲酸銨濃度所得色譜圖Fig.3 Chromatograms on the BEH Amide column at different concentrations of ammonium formate in mobile phase A

表1 BEH Amide柱上改變甲酸銨濃度所得容量因子及分離度Table 1 Capacity factors and resolution factors at varyingconcentrations of ammonium formate in the mobile phase on theBEH Amide column

由表1可知，甲酸銨濃度由30 mmol/L增大為50 mmol/L時，5 個化合物的容量因子均增大，化合物b的容量因子大于化合物d，從而b、c、d 3 個化合物出峰先后順序發(fā)生變化，化合物c、d間與化合物b、e間的分離度增大，但化合物d、b即甘氨酸-Amadori和2-木糖基噻唑烷-4-羧酸間的分離度（Rd,b）僅為0.55。當(dāng)甲酸銨濃度由30 mmol/L減小為10 mmol/L時，5 個化合物的容量因子均減小，化合物b的容量因子小于化合物c，從而b、c、d 3 個化合物出峰先后順序也發(fā)生了變化；但與甲酸銨濃度30 mmol/L的條件相比，b、c、d 3化合物之間的分離度均大于1.5，實現(xiàn)了基線分離，因此甲酸銨濃度為10 mmol/L較好。

2.1.3 流動相pH值的影響

洗脫程序為梯度2，柱溫及流速同2.1.1節(jié)，甲酸銨濃度為10 mmol/L，A流動相的pH值由6分別改變?yōu)?、8，所得色譜圖見圖4，分離參數(shù)的結(jié)果見表2。

由表2可知，pH值由6減小為3時，5 個化合物的容量因子均增大，化合物b的容量因子大于d，從而b、c、d 3 個化合物的出峰先后順序發(fā)生變化，與pH 6條件下的結(jié)果相比，其他3 個化合物間的分離度增大，但化合物d、b即甘氨酸-Amadori和2-木糖基噻唑烷-4-羧酸間的分離度（Rd,b）僅為0.47。pH值由6增大為8時，5 個化合物的容量因子均小幅減小，b、c、d 3 個化合物的出峰順序與pH 6時相同，5 個化合物之間的分離度變化不一致，但仍全部實現(xiàn)較好的分離。考慮到pH 6為甲酸銨溶液的自然pH值，為此選擇pH 6作為較佳分離條件。

圖4 BEH Amide色譜柱上改變流動相A pH值所得色譜圖Fig.4 Chromatograms on the BEH Amide column at different pH values of mobile phase A

表2 BEH Amide柱上改變pH值所得容量因子及分離度Table 2 Capacity factors and resolution factors at different pH valuesof the mobile phase on the BEH Amide column

2.1.4 柱溫的影響

洗脫程序為梯度2，柱溫及流速同2.1.1節(jié)，甲酸銨濃度為10 mmol/L，流動相A為pH 6，柱溫由25 ℃分別改變?yōu)?5、70 ℃，所得分離參數(shù)的結(jié)果見表3。

表3 BEH Amide柱上改變柱溫所得容量因子及分離度Table 3 Capacity factors and resolution factors at different columntemperatures on the BEH Amide column

由表3可知，隨著柱溫升高，5 個化合物的容量因子均呈逐漸增大，但出峰先后順序未發(fā)生變化；除b、c即2-木糖基噻唑烷-4-羧酸和甘氨酸之間的分離度（Rb,c）逐漸增大外，其他化合物之間的分離度（Ra,b、Rc,d、Rd,e）均逐漸減小。在3 種柱溫條件下，5 個化合物均處于基線分離，但考慮到色譜柱使用壽命，選擇柱溫為25 ℃較好。

2.2 Atlantis HILIC Silica柱的分離條件

2.2.1 流動相中有機(jī)相比例的確定

參考BEH Amide柱的分離結(jié)果，對于Atlantis HILIC Silica柱直接采用梯度洗脫條件調(diào)節(jié)流動相中的有機(jī)相比例。

圖5 Atlantis HILIC Silica色譜柱上改變流動相中有機(jī)相比例所得色譜圖Fig.5 Chromatograms on the Atlantis HILIC Silica column when different ratios of the organic phase (CH3CN) were used in the mobile phase

柱溫70 ℃，流速0.5 mL/min，流動相：A（10 mmol/L甲酸銨溶液，pH 6）和B（乙腈），洗脫程序為：0～15 min，95%～75% B；15～25 min，75%～60% B；25～30 min，60%～95% B（梯度3），如圖5A所示，可知化合物c、e實現(xiàn)基線分離，但化合物a、d共流出，化合物b與（a,d）僅部分分離。柱溫70 ℃，其他條件同上，改變洗脫程序為：0～5 min，95%～75% B；5～15 min，75%～70% B；15～20 min，70%～95% B（梯度4），如圖5B所示，此時的分離狀況優(yōu)于梯度3條件，化合物b、a之間的分離增大，化合物a、d之間達(dá)到基線分離，但化合物d、e之間僅部分分離，因此需繼續(xù)探討其他因素的影響。

2.2.2 流動相緩沖鹽濃度的影響

洗脫程序為梯度4，柱溫及流速2.2.1節(jié)，甲酸銨濃度由10 mmol/L改變?yōu)?0、50 mmol/L。所得色譜圖見圖6，分離參數(shù)的結(jié)果見表4。

圖6 Atlantis HILIC Silica色譜柱上改變流動相A中甲酸銨濃度所得色譜圖Fig.6 Chromatograms on the Atlantis HILIC Silica column at different concentrations of ammonium formate in mobile phase A

表4 Atlantis HILIC Silica柱上改變甲酸銨濃度所得容量因子及分離度Table 4 Capacity factors and resolution factors when theconcentrations of ammonium formate in the mobile phase were changedon the Atlantis HILIC Silica column

由表4可知，甲酸銨濃度由10 mmol/L增加為30 mmol/L時，5 個化合物的容量因子均不同程度增大，化合物出峰先后順序不變；化合物b、a即2-木糖基噻唑烷-4-羧酸和半胱氨酸共流出，分離度（Rb,a）為0；化合物e、d即半胱氨酸-Amadori和甘氨酸-Amadori間的分離度（Re,d）略增大，為0.88，仍為部分分離。當(dāng)甲酸銨濃度由10 mmol/L增大為50 mmol/L時，5 個化合物的容量因子也均增大，但化合物a、b出峰先后順序發(fā)生變化，化合物a、b之間，及e、d之間分離度（Ra,b、Re,d）分別減為0.83、0.75。綜上，甲酸銨濃度選擇10 mmol/L較好。

2.2.3 流動相pH值的影響

洗脫程序為梯度4，柱溫及流速同2.2.1節(jié)，甲酸銨濃度為10 mmol/L，流動相A的pH值由6分別改為3、8，所得色譜圖見圖7，分離參數(shù)結(jié)果見表5。

圖7 Atlantis HILIC Silica色譜柱上改變流動相A pH值所得色譜圖Fig.7 Chromatograms on the Atlantis HILIC Silica column at different pH values of mobile phase A

表5 Atlantis HILIC Silica柱上改變pH值所得容量因子及分離度Table 5 Capacity factors and resolution factors at different pH valuesof the mobile phase on the Atlantis HILIC Silica column

由表5可知，pH值由6變?yōu)?時，化合物a、b的容量因子增大，而化合物c、d、e的容量因子減小，但5 個化合物的出峰順序沒發(fā)生變化；化合物b、a間的分離度（Rb,a）增大為3.64，但化合物a、e間的分離度（Ra,e）減小為0.48，化合物d、c間的分離度（Rd,c）減小為1.49。pH值由6變?yōu)?時，5 個化合物的容量因子均不同程度減小，5 個化合物的出峰順序也沒發(fā)生變化，化合物b、a的分離度（Rb,a）增大為2.76，即化合物2-木糖基噻唑烷-4-羧酸和半胱氨酸實現(xiàn)基線分離，而其他化合物之間的分離無明顯改善。綜合以上分析及考慮到pH 6為甲酸銨溶液的自然pH值，選擇pH 6作為較合適分離條件。

2.2.4 柱溫的影響

洗脫程序為梯度4，流速同2.2.1節(jié)，甲酸銨濃度為10 mmol/L，流動相A的pH值為6，柱溫由70 ℃分別改變?yōu)?5、45 ℃，所得分離參數(shù)結(jié)果見表6。

表6 Atlantis HILIC Silica柱上改變柱溫所得容量因子及分離度Table 6 Capacity factors and resolution factors at different columntemperatures on the Atlantis HILIC Silica column

由表6可知，隨著柱溫降低，5 個化合物的容量因子均呈稍增大趨勢或變化不大，出峰先后順序未發(fā)生改變。當(dāng)柱溫由70 ℃降為25 ℃時，b、a兩化合物之間的分離度（Rb,a）減小為0.77，化合物e、d間的分離度（Re,d）為0，即半胱氨酸-Amadori和甘氨酸-Amadori共流出。當(dāng)柱溫由70 ℃降為45 ℃時，化合物b和a、e和d間的分離度（Rb,a、Re,d）分別減小為1.26、0.55。總體而言，柱溫為70 ℃時分離較好。

2.3 兩柱分離結(jié)果的比較

圖8 較佳條件下流速為0.5 mL/min時BEH Amide色譜柱（A）與Atlantics HILIC Silica色譜柱（B）分離色譜圖Fig.8 Chromatograms on the BEH Amide and the Atlantis HILIC Silica column under the optimum conditions with a flow rate of 0.5 mL/min

根據(jù)以上優(yōu)化過程，分別得到兩柱的較佳分離條件，BEH Amide色譜柱：柱溫25 ℃，流動相流速0.5 mL/min，流動相為A：10 mmol/L甲酸銨溶液（pH 6），B：乙腈，梯度洗脫程序2。Atlantis HILIC Silica色譜柱：柱溫70 ℃，流動相流速0.5 mL/min，進(jìn)樣量3 μL，流動相為A：10 mmol/L甲酸銨溶液（pH 6），B：乙腈，梯度洗脫程序4。所得色譜圖見圖8。

2.4 調(diào)節(jié)流速及最終分離條件的確定

流速一般不影響色譜分離選擇性，但會影響分離時間和色譜柱效。增大流速，將會使分離時間縮短，從而提高分離效率?？紤]到流動相流速為0.5 mL/min時，所用分離時間較長，故固定上述的其他較佳條件，采用1 mL/min的流速進(jìn)行分離實驗，采用BEH Amide色譜柱和Atlantis HILIC Silica色譜柱所得色譜圖見圖9。

圖9 較佳條件下流速為1 mL/min時BEH Amide色譜柱（A）與Atlantics HILIC Silica色譜柱（B）分離色譜圖Fig.9 Chromatograms on the BEH Amide and the Atlantis HILIC Silica column under the optimum conditions with a flow rate of 1 mL/min

由圖8、9可知，采用1 mL/min兩色譜柱的分離時間可分別由30 min縮短為20 min、20 min縮短為15 min。但對于Atlantis HILIC Silica色譜柱，流速為1 mL/min的條件下，化合物e、d間分離度減小，基線發(fā)生明顯漂移。

綜合以上實驗結(jié)果，認(rèn)為采用BEH Amide色譜柱較好，故最終較佳分離條件為：柱溫25 ℃，流動相流速1 mL/min，流動相為A：10 mmol/L甲酸銨溶液（pH 6），B：乙腈，梯度洗脫程序2。

3 討論與結(jié)論

親水作用色譜設(shè)計用于分離各種強(qiáng)極性的親水化合物，尤其適用于在高比例有機(jī)相、高溫及高pH值條件下，進(jìn)行碳水化合物等親水性化合物的分離。本實驗所用BEH Amide色譜柱，其鍵合相為基于亞乙基橋雜化（BEH）顆粒的三鍵鍵合酰胺基；Atlantis HILIC Silica色譜柱，鍵合相為未經(jīng)鍵合的高純硅膠顆粒，對極性、堿性、水溶性分析物的保留極佳。兩種色譜柱近年來受到廣泛應(yīng)用，如BEH Amide色譜柱常用于分離糖類、雙氰胺等[14-17]，Atlantis HILIC Silica色譜柱用于分離測定酰胺類化合物、甜菜堿、L-羥脯氨酸等[11,18-19]。

美拉德反應(yīng)中氨基酸、多肽及其與糖反應(yīng)形成的Amadori重排物等都是親水性物質(zhì)，適于親水作用色譜分離。但這些化合物在紫外檢測時吸收很弱，因而采用較為通用的蒸發(fā)光散射檢測器檢測。實驗發(fā)現(xiàn)，半胱氨酸（a）、2-木糖基噻唑烷-4-羧酸（b）、甘氨酸（c）、甘氨酸-Amadori（d）和半胱氨-Amadori酸（e）5 種物質(zhì)，在BEH Amide色譜柱和Atlantis HILIC Silica色譜柱上具有不同的分離選擇性。在BEH Amide色譜柱上，b、c、d 3 個化合物之間較難分離，在所嘗試的條件下它們之間往往分離度較小或共流出，是分離的關(guān)鍵所在。在Atlantis HILIC Silica色譜柱上，a與b、e與d這兩對化合物較難分離，在所嘗試的條件下它們往往分離度較小或共流出，是分離的關(guān)鍵所在。

親水作用色譜模式下，影響化合物保留的主要因素包括流動相中的有機(jī)相比例、流動相的緩沖鹽濃度及pH值、柱溫等[20-21]。

3.1 流動相中有機(jī)相比例的影響

在HILIC色譜模式中通常以高比例有機(jī)溶劑（常為乙腈）為流動相[17]，通過逐漸增大水的比例調(diào)節(jié)流動相的極性，依次洗脫出極性不同的溶質(zhì)。該色譜模式中，化合物的保留隨其極性的增大而增強(qiáng)，流動相中有機(jī)相的含量是控制分離的主要因素[17]。實驗發(fā)現(xiàn)，流動相中乙腈比例及其變化對化合物保留的影響較大，進(jìn)而影響分離選擇性及分離度。例如，BEH Amide色譜柱，等度洗脫時，流動相A-B體積比由25∶75調(diào)節(jié)為35∶65，乙腈的比例減?。ㄋ啾壤龃螅鲃酉嗟南疵撃芰υ鰪?qiáng)，5 個化合物保留時間均縮短，而分離選擇性有所改善，c、d這對原共流出峰出現(xiàn)了分離趨勢（圖2）。

對于兩色譜柱，通過降低起始流動相中水相的比例（為5%），有利于溶質(zhì)與固定相作用，然后采用梯度洗脫，逐步增大水相的比例，使流動相的洗脫能力逐步增強(qiáng)，有利于提高b、c、d 3 個化合物或a、b及e、d這兩對化合物之間的分離選擇性，獲得較高的分離度。Schlichtherle-Cerny等[22]用TSK-Gel Amide色譜柱在流動相為乙酸銨緩沖溶液（pH 5.5）和乙腈，其中流動相中乙腈的含量為由90%逐漸變?yōu)?0%，流動相的極性由弱到強(qiáng)，從而逐步分離亮氨酸、絲氨酸等氨基酸和一些親水性二肽、三肽，除絲氨酸和谷氨酰胺外，其他氨基酸和大部分肽類均實現(xiàn)基線分離。

3.2 流動相中緩沖鹽濃度的影響

流動相中加入緩沖鹽可以降低帶電荷溶質(zhì)與固定相之間的靜電作用，調(diào)節(jié)物質(zhì)的保留及峰形，流動相中不加緩沖鹽時易出現(xiàn)峰拖尾現(xiàn)象[17]。此外，緩沖鹽濃度還將影響可電離的溶質(zhì)的保留。半胱氨酸（a）、2-木糖基噻唑烷-4-羧酸（b）、甘氨酸（c）、甘氨酸-Amadori（d）和半胱氨酸-Amadori（e）5 種物質(zhì)均為兩性物質(zhì)，pH值不變，僅增大甲酸銨的濃度時（由10 mmol/L增大到30、50 mmol/L），將有利于5 種物質(zhì)的帶電荷的解離形式的穩(wěn)定性，從而增大了溶質(zhì)與固定相的作用，因而表現(xiàn)為各物質(zhì)的容量因子增大，保留增強(qiáng)。Guo Yong等[23]也曾發(fā)現(xiàn)使用Atlantis HILIC Silica色譜柱分離胞嘧啶時，當(dāng)乙酸銨濃度由5 mmol/L增大到20 mmol/L時，胞嘧啶的保留增強(qiáng)。但本實驗中增大流動相中緩沖鹽濃度時，對b、c、d 3 個化合物或a、b及e、d這兩對化合物之間的分離選擇性改善不明顯甚至變差，兩色譜柱均是在甲酸銨濃度低（10 mmol/L）時，對于5 個化合物的分離結(jié)果更好。

3.3 流動相pH值的影響

流動相的pH值是重要的色譜參數(shù)，影響固定相及溶質(zhì)的電荷狀態(tài)，而溶質(zhì)在不同電荷狀態(tài)下在固定相上的保留不同，溶質(zhì)帶電荷時親水性更強(qiáng)，在HILIC中保留增強(qiáng)[17]。本研究發(fā)現(xiàn)流動相pH值對幾種溶質(zhì)的分離有較大影響，而pH值對每種物質(zhì)的保留的影響不僅與物質(zhì)本身還與固定相種類有很大關(guān)系。在BEH Amide色譜柱上，流動相pH值較高時（pH 6、8），容量因子均小幅減小，物質(zhì)的保留減弱；流動相pH值較高時，還表現(xiàn)為有利于b、c分離但不利于c、d 分離（表2）。Atlantis HILIC Silica色譜柱，pH值較高時，半胱氨酸、2-木糖基噻唑烷-4-羧酸和半胱氨酸-Amadori的容量因子減小，而甘氨酸和甘氨酸-Amadori的容量因子先增大再減?。涣鲃酉鄍H值較低時（pH 3）有利于a、b和d、e而不利于d、c和a、e的分離（表5）。Guo Yong等[23]發(fā)現(xiàn)在Atlantis HILIC Silica色譜柱上，流動相pH值由3.3增至4.0時，胞嘧啶的保留增強(qiáng)，由4.0增至4.8時，其保留減弱，由4.8增至6.5時，保留增強(qiáng)。以上發(fā)現(xiàn)的pH值的影響，可能是由于不同pH值條件下，BEH Amide色譜固定相的酰胺基或HILIC Silica色譜固定相的硅醇羥基以帶電荷或非電荷形式存在的比例不同，5 個化合物以酸性、堿性形式存在的比例不同，從而影響了分離的選擇性。

3.4 柱溫的影響

溫度不僅影響流動相黏度及化合物的擴(kuò)散系數(shù)而且影響其在流動相與固定相之間的焓變（ΔH），通常隨溫度升高化合物的保留減弱[17]。表6中，隨溫度升高，對于Atlantis HILIC Silica色譜柱，5 個化合物的容量因子減小或基本不變；表4中，對于BEH Amide色譜柱，5 個化合物的容量因子則增大。這可能仍與5 個化合物在不同溫度條件下以酸性、堿性解離形式存在的比例不同，及BEH Amide固定相的酰胺基或Atlantis HILIC Silica色譜固定相的硅醇羥基以帶電荷或非電荷形式存在的比例不同等復(fù)雜情況有關(guān)。

從分離度看，溫度對Atlantis HILIC Silica色譜柱的分離影響較大，較高溫度條件下，其對5 個化合物的分離更好（表6），這可能與溫度升高流動相黏度降低及化合物的擴(kuò)散系數(shù)增大，從而柱效提高有關(guān)。Hao Zhigang等[21]使用Hypersil silica色譜柱研究了溫度等對甘氨酸和其二肽、三肽及對應(yīng)的3種Amadori化合物的分離的影響，發(fā)現(xiàn)在其他條件合適的情況下，高溫條件能夠使6 個化合物分離度更大且峰形更好。

3.5 流速的影響

按照所用色譜柱的內(nèi)徑，較佳流速應(yīng)在1 mL/min左右，但因所用流動相中含水和緩沖鹽，黏度較大，為了有利于傳質(zhì)及兩相分配平衡，開始時選擇0.5 mL/min進(jìn)行實驗。對于BEH Amide色譜柱，在較佳的其他條件下，將流速提高到1 mL/min時，分離結(jié)果好且分離時間縮短（圖8、9）。而對于Atlantis HILIC Silica色譜柱，由于其較佳的柱溫高（70 ℃），流速提高到1 mL/min時，分離穩(wěn)定性不好，梯度洗脫時隨著流動相中水相的比例增大出現(xiàn)基線漂移，分離選擇性變差。

綜合以上討論知，對于氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、糖等食品基本組分的分離，親水作用色譜模式代替常用的正、反相色譜，在食品科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用具有廣闊的前景。由于所涉及的半胱氨酸、甘氨酸、2-木糖基噻唑烷-4-羧酸、半胱氨酸-Amadori、甘氨酸-Amadori化合物，均為兩性物質(zhì)，在不同pH值、緩沖鹽濃度、有機(jī)相比例、及不同溫度條件下，其酸性、堿性解離形式及中性形式的存在比例不同，分離機(jī)理極其復(fù)雜，在不同條件下分離結(jié)果往往存在多變性。對比兩色譜柱的分離結(jié)果，分離半胱氨酸、甘氨酸及其Amadori重排產(chǎn)物等美拉德反應(yīng)初始中間物時，選擇BEH Amide色譜柱更合適。

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Separation of Amino Acids and Their Initial Maillard Reaction Intermediates by Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography

CAO Changchun, LIANG Jingjing, WANG Meng, HOU Li, XIE Jianchun*, SUN Baoguo
(Beijing Laboratory for Food Quality and Safety, Beijing Key Laboratory of Flavor Chemistry, Beijing Engineering and Technology Research Center of Food Additives, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China)

An Xbridge BEH Amide column and an Atlantis HILIC Silica column, which work on hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC), were used to separate cysteine, glycine, and their initial Maillard reaction intermediates with xylose including 2-xylulosylthiazolidine-4-carboxylic acid, glycine-Amadori, and cysteine-Amadori. The effects of the ratio of the organic phase (CH3CN), the concentration of ammonium formate (the buffer salt), the pH value and flow rate of the mobile phase, and column temperature on capacity factor and resolution factor were investigated. Then optimum separation conditions for the Xbridge BEH Amide column and the Atlantis HILIC Silica column were established, respectively. Using the BEH Amide column, the resolution factors achieved for the five compounds all exceeded 2.28. The results showed that the BEH Amide column was more suitable for the chromatographic separation.

hydrophilic interaction liquid chromatography; cysteine; 2-xylulosylthiazolidine-4-carboxylic acid; glycine; glycine-Amadori; cysteine-Amadori; separation

10.7506/spkx1002-6630-201602011

TQ656.1

A

1002-6630（2016）02-0063-09

曹長春, 梁晶晶, 王蒙, 等. 親水色譜柱對氨基酸及其美拉德反應(yīng)初始中間體的分離[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(2): 63-71. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201602011. http://www.spkx.net.cn

CAO Changchun, LIANG Jingjing, WANG Meng, et al. Separation of amino acids and their initial Maillard reaction intermediates by hydrophilic interaction liquid chromatography[J]. Food Science, 2016, 37(2): 63-71. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201602011. http://www.spkx.net.cn

2015-06-30

國家自然科學(xué)基金面上項目（31371838；31171755）；北京市教委科技發(fā)展計劃重點項目（KZ20101001011）；“十二五”國家科技支撐計劃項目（2011BAD23B01）

曹長春（1990—），女，碩士研究生，研究方向為食品風(fēng)味化學(xué)。E-mail：skyccchun@163.com

*通信作者：謝建春（1967—），女，教授，博士，研究方向為食品風(fēng)味化學(xué)、熱反應(yīng)肉味香精。E-mail：xjchun@th.btbu.edu.cn