水楊酸、茉莉酸甲酯及超聲波對(duì)北沙參愈傷組織生長(zhǎng)及產(chǎn)香豆素的影響

苗曉燕，朱維紅，張?bào)忝?，王 琳

（保定學(xué)院生化系，河北 保定 071000）

水楊酸、茉莉酸甲酯及超聲波對(duì)北沙參愈傷組織生長(zhǎng)及產(chǎn)香豆素的影響

苗曉燕，朱維紅，張?bào)忝?，王 琳

（保定學(xué)院生化系，河北 保定 071000）

研究水楊酸（salicylic acid，SA）、茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）和超聲波對(duì)北沙參愈傷組織生長(zhǎng)的影響，并利用高效液相色譜法測(cè)定了經(jīng)誘導(dǎo)處理后愈傷組織中香豆素（歐前胡素、異歐前胡素及補(bǔ)骨脂素為主要指標(biāo)）含量的變化。結(jié)果表明：SA和MeJA均對(duì)北沙參愈傷組織的生長(zhǎng)具有抑制作用，而一定時(shí)間的低強(qiáng)度超聲波處理則能夠促進(jìn)北沙參愈傷組織生物量的增長(zhǎng)；同時(shí)，結(jié)果表明此3 種誘導(dǎo)因子均能夠不同程度地促進(jìn)香豆素合成，即當(dāng)SA質(zhì)量濃度達(dá)到8 mg/L時(shí)，歐前胡素的含量達(dá)到最大值，為對(duì)照的3.8 倍；SA質(zhì)量濃度為16 mg/L時(shí)，補(bǔ)骨脂素含量達(dá)最大值，為對(duì)照的1.70 倍；當(dāng)SA質(zhì)量濃度在28～30 mg/L之間時(shí)，異歐前胡素的含量達(dá)到最大值，此范圍內(nèi)總香豆素含量也達(dá)最大值，約為對(duì)照的2.33 倍；當(dāng)MeJA濃度達(dá)400 μmol/L時(shí)，補(bǔ)骨脂素和異歐前胡素含量達(dá)到最大值，分別為對(duì)照的6.09 倍和5.53 倍，總香豆素含量也達(dá)最大值14.86 μg/g，為對(duì)照的5.11 倍；當(dāng)超聲波處理30 min時(shí)，愈傷組織中歐前胡素和異歐前胡素的含量達(dá)最大值5.51 μg/g和3.69 μg/g，分別為對(duì)照的5.15 倍和4.20 倍；總香豆素含量也達(dá)最大值11.90 μg/g，為對(duì)照的3.55 倍；而補(bǔ)骨脂素含量則在超聲處理10 min后達(dá)到最大值3.60 μg/g，為對(duì)照的1.50 倍。綜上，比較3 種誘導(dǎo)子對(duì)北沙參愈傷組織誘導(dǎo)處理后香豆素含量的變化發(fā)現(xiàn)，與SA和超聲波相比，MeJA更能夠有效地促進(jìn)北沙參中次生代謝產(chǎn)物——香豆素的合成。

北沙參；香豆素；茉莉酸甲酯；水楊酸；超聲波

北沙參為傘形科植物珊瑚菜（Glehniabo littoralis F.Schmidt ex Miq）的干燥根，別名萊陽(yáng)沙參、萊陽(yáng)參、遼沙參［1］。山東、河北、內(nèi)蒙古、遼寧為其主產(chǎn)區(qū)。北沙參屬養(yǎng)陰藥，有養(yǎng)陰清肺、益胃生津之功效。目前臨床上主要用于治療肺熱燥咳，熱病傷津、勞嗽痰血等病癥。經(jīng)實(shí)驗(yàn)研究表明具有這一藥理學(xué)活性的次生代謝產(chǎn)物的成分主要為香豆素類物質(zhì)［2］，該香豆素類物質(zhì)具有止咳化痰［3］、抗突變［4］、抗菌［5］、抗腫瘤［6］和鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜［7］等作用。

野生北沙參是我國(guó)瀕危植物之一，1999年被列為國(guó)家Ⅱ級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生植物［8］。目前市場(chǎng)上銷售的均為人工栽培的北沙參，但由于近年來(lái)該藥材生產(chǎn)只種不選，自留自用，種子種苗提純和復(fù)壯工作均滯后，導(dǎo)致北沙參的品種退化，質(zhì)量下降和療效降低［9］。北沙參中的香豆素是一類由苯環(huán)與3 個(gè)直鏈碳連在一起為單元（C6～C3）構(gòu)成的化合物，屬于苯丙素類。從生物合成途徑來(lái)看，由莽草酸通過(guò)苯丙氨酸和酪氨酸等芳香氨基酸，經(jīng)脫氨、羥基化、耦合等反應(yīng)步驟形成最終產(chǎn)物［10］。因此，通過(guò)調(diào)節(jié)代謝途徑提高北沙參中香豆素的含量，并獲得優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的北沙參種苗具有重要的理論和實(shí)際意義。

在植物次生代謝過(guò)程中，誘導(dǎo)子如水楊酸（salicylic acid，SA）、茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）、超聲波等能作為一種特定的生化信號(hào)，快速、轉(zhuǎn)移和選擇性地誘導(dǎo)特定基因的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)植物細(xì)胞次生代謝產(chǎn)物的合成［11-13］，目前已在多種藥用植物如丹參［14］、甘草［15］、紫草［16］、三七［17］等誘導(dǎo)中均能夠提高相應(yīng)次生代謝產(chǎn)物的量。而關(guān)于北沙參方面的報(bào)道尚未見(jiàn)到。因此本研究中，主要通過(guò)添加SA、MeJA及超聲波處理3 種途徑，對(duì)北沙參愈傷組織進(jìn)行誘導(dǎo)，以探討對(duì)其愈傷組織生長(zhǎng)及香豆素合成代謝的影響，旨在為北沙參的優(yōu)質(zhì)種苗繁育以及次生代謝產(chǎn)物香豆素的大規(guī)模生產(chǎn)提供一定的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

北沙參愈傷組織［18］保定學(xué)院生化系細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)。

1.2 試劑與儀器

甲醇（色譜純）、萘乙酸（1-naphthaleneacetic acid，NAA）、6-芐氨基嘌呤（6-benzylaminopurine，6-BA） 天津市大茂化學(xué)試劑廠；歐前胡素、異歐前胡素、補(bǔ)骨脂素標(biāo)準(zhǔn)品、SA、MeJA 中國(guó)藥品生物制品檢定所。

B3200S-T超聲清洗器 必能信超聲（上海）有限公司；LC-20AT高效液相色譜儀 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 SA誘導(dǎo)處理北沙參愈傷組織

取一定量的北沙參愈傷組織，接種至添加質(zhì)量濃度為0、4、8、12、16、20、24、28、32 mg/L SA的培養(yǎng)基中（培養(yǎng)基配方：1/2 MS培養(yǎng)基+1.2 mg/L NAA+0.2 mg/L 6-BA+7 g/L瓊脂+20 g/L蔗糖），25 ℃暗培養(yǎng)35 d，每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)3 個(gè)重復(fù)。

1.3.2 MeJA誘導(dǎo)處理北沙參愈傷組織

取一定量的北沙參愈傷組織，接種至分別添加濃度為0、100、200、400、600、800、1 000 μmol/L MeJA的培養(yǎng)基中（培養(yǎng)基配方同上），25 ℃暗培養(yǎng)35 d，每個(gè)濃度設(shè)3 個(gè)重復(fù)。

1.3.3 超聲波誘導(dǎo)處理北沙參愈傷組織

取一定量的北沙參愈傷組織，接入裝有適量無(wú)菌水的三角瓶中，放入超聲波清洗器中超聲處理，處理時(shí)間分別為0、10、20、30、40、50 min，然后再接入上述培養(yǎng)基中，25 ℃暗培養(yǎng)35 d，每個(gè)時(shí)間設(shè)3 個(gè)重復(fù)。

1.3.4 愈傷組織生長(zhǎng)量的測(cè)定

以愈傷組織培養(yǎng)35 d的鮮質(zhì)量和干質(zhì)量表示培養(yǎng)過(guò)程中的愈傷組織生長(zhǎng)量。實(shí)驗(yàn)設(shè)3 次重復(fù)。從培養(yǎng)容器中取出北沙參愈傷組織，洗凈后置于50 ℃烘箱中烘干至恒質(zhì)量，稱量得干質(zhì)量。

愈傷組織生長(zhǎng)量/g=收獲量/g-接種量/g

1.3.5 高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）測(cè)定愈傷組織中香豆素含量

1.3.5.1 色譜條件

色譜柱：Promosil-C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相為甲醇-水（68∶32，V/V），梯度洗脫；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：250 nm；進(jìn)樣量20 μL。

1.3.5.2 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別精密稱取干燥至恒質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)品補(bǔ)骨酯素、歐前胡素、異歐前胡素，置棕色量瓶中加甲醇超聲波溶解后，制成補(bǔ)骨酯素0.117 mg/mL、歐前胡素0.13 mg/mL和異歐前胡素0.11 mg/mL的混合溶液，用0.45 μm濾膜過(guò)濾。將標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液（按0.1 mg/mL計(jì)算）依次稀釋，分別選擇0.1、0.05、0.025、0.005、0.002 5、0.000 1 mg/mL這6 個(gè)質(zhì)量濃度進(jìn)樣，每次精密吸取20 μL注入高效液相色譜儀，在上述色譜條件下檢測(cè)峰面積。以峰面積（mV·min）為縱坐標(biāo)，以進(jìn)樣質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程如下：補(bǔ)骨脂素：y = 206 317 040x+34 718（R2= 0.999 3），歐前胡素：y = 163 010 226x+10 382（R2= 0.999 6），異歐前胡素：y = 82 088 237 x+20 068（R2= 0.999 5）。

1.3.5.3 香豆素含量測(cè)定

準(zhǔn)確稱取1 g經(jīng)不同處理干燥后并研磨成粉末的北沙參愈傷組織，置具塞離心管中，加12 mL乙醚，超聲波處理30 min，4 000 r/min離心30 min，提取2 次，收集上清液，風(fēng)干。用色譜甲醇超聲20 s，溶解后定容至1 mL，12 000 r/min、4 ℃離心15 min，取上清液用0.45 μm濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 香豆素色譜圖

北沙參香豆素（以歐前胡素、異歐前胡素、補(bǔ)骨脂素為主要指標(biāo)）標(biāo)準(zhǔn)品及愈傷組織香豆素HPLC色譜圖如圖1、2所示，圖1中1～3依次為補(bǔ)骨脂素、歐前胡素、異歐前胡素的特征峰，該3 個(gè)特征峰分別在4.5、8.6 min及14.5 min左右出現(xiàn)。

2.2 SA對(duì)北沙參愈傷組織生長(zhǎng)和香豆素含量的影響

由圖3a可知，隨SA質(zhì)量濃度增加，北沙參愈傷組織的干質(zhì)量總體呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)。當(dāng)SA質(zhì)量濃度在0～8 mg/L之間時(shí)，愈傷組織生長(zhǎng)量下降緩慢，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)8～12 mg/L時(shí)，愈傷組織增長(zhǎng)量急劇下降，之后趨于平緩。說(shuō)明SA對(duì)北沙參愈傷組織生物量的增長(zhǎng)具有一定的抑制作用，且隨SA質(zhì)量濃度的增加，這種抑制作用在逐漸增強(qiáng)，這與SA對(duì)紅豆杉細(xì)胞的生長(zhǎng)具有抑制作用相一致［19］，說(shuō)明一定質(zhì)量濃度的SA對(duì)活細(xì)胞具有毒性，且毒性隨質(zhì)量濃度增加逐漸增強(qiáng)。

HPLC結(jié)果分析（圖3b）表明：適宜質(zhì)量濃度的SA對(duì)北沙參愈傷組織中歐前胡素、異歐前胡素和補(bǔ)骨脂素的合成均具有一定的促進(jìn)作用，且隨質(zhì)量濃度升高呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)。當(dāng)SA質(zhì)量濃度達(dá)到8 mg/L時(shí)，歐前胡素的含量達(dá)到最大值4.11 μg/g，為對(duì)照的3.8 倍；SA質(zhì)量濃度在28～30 mg/L之間時(shí)，異歐前胡素的含量達(dá)到最大值；而SA對(duì)補(bǔ)骨脂素的影響較小，即在質(zhì)量濃度為16 mg/L時(shí)達(dá)最大值2.10 μg/g，為對(duì)照的1.70 倍；在SA質(zhì)量濃度為28～30 mg/L之間時(shí)，總香豆素含量達(dá)到最大值，約為對(duì)照的2.33 倍。這一結(jié)果與前人的研究結(jié)果［20-22］相一致，即SA作為誘導(dǎo)子可誘導(dǎo)多種植物次生代謝物合成積累量的增加。分析原因可能是，香豆素次生代謝基礎(chǔ)途徑為苯丙烷代謝途徑，一定質(zhì)量濃度SA可以通過(guò)改變苯丙烷代謝途徑中的關(guān)鍵酶活性，從而提高次生代謝產(chǎn)物的合成積累量［22-23］。

2.3 MeJA對(duì)北沙參愈傷組織生長(zhǎng)和香豆素含量的影響

由圖4a可知，隨MeJA濃度升高，北沙參愈傷組織的干質(zhì)量呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)，且褐化情況逐漸加重，說(shuō)明MeJA對(duì)愈傷組織的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用。HPLC測(cè)定結(jié)果（圖4b）表明，3 種香豆素含量均隨MeJA濃度的提高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，但與愈傷組織的生長(zhǎng)并無(wú)明顯的相關(guān)性。其中補(bǔ)骨脂素和異歐前胡素均在MeJA濃度達(dá)400 μmol/L時(shí)，含量達(dá)到最大值7.13 μg/g和5.07 μg/g，分別為對(duì)照的6.09 倍和5.53 倍；而歐前胡素則在MeJA濃度達(dá)200 μmol/L時(shí)，含量達(dá)到最大值4.03 μg/g，為對(duì)照的4.87 倍；總香豆素的含量則與補(bǔ)骨脂素和歐前胡素合成趨勢(shì)一致，即在MeJA濃度達(dá)400 μmol/L時(shí)含量達(dá)到最大值14.86 μg/g，是對(duì)照的5.11 倍。說(shuō)明MeJA既有抑制北沙參愈傷組織生長(zhǎng)的作用，同時(shí)又具有誘導(dǎo)香豆素合成的作用，但濃度過(guò)高則又會(huì)抑制香豆素的合成，適宜的誘導(dǎo)濃度為400 μmol/L。這與羅建平等［24］進(jìn)行的茉莉酸甲酯誘導(dǎo)懷槐懸浮細(xì)胞合成異黃酮的結(jié)論是一致的。原因可能是MeJA作為小分子物質(zhì)調(diào)節(jié)植物次生代謝過(guò)程中相關(guān)基因的表達(dá)，誘導(dǎo)香豆素的合成［25］。

2.4 超聲波時(shí)間對(duì)北沙參愈傷組織生長(zhǎng)和香豆素含量的影響

由圖5a可知，隨超聲波處理時(shí)間延長(zhǎng)，愈傷組織的干質(zhì)量呈現(xiàn)先升高再下降的趨勢(shì)，即經(jīng)10～40 min時(shí)間內(nèi)超聲波處理，愈傷組織生長(zhǎng)較快，35 d后收獲，經(jīng)40 min處理的愈傷組織增長(zhǎng)量最大為0.32 g，為未經(jīng)處理愈傷組織干質(zhì)量的1.62 倍，且生長(zhǎng)體積較大，結(jié)構(gòu)疏松，顏色較淺。

HPLC測(cè)定結(jié)果（圖5b）表明，超聲波對(duì)歐前胡素和異歐前胡素均有一定的促進(jìn)作用，即當(dāng)超聲波時(shí)間為30 min時(shí)，愈傷組織中歐前胡素和異歐前胡素的含量達(dá)最大值5.51 μg/g和3.69 μg/g，分別為對(duì)照的5.15 倍和4.20 倍。而補(bǔ)骨脂素則在超聲波處理10 min時(shí)達(dá)到最大值3.60 μg/g，為對(duì)照的1.50 倍，之后趨于下降；總香豆素含量達(dá)11.90 μg/g，為對(duì)照的3.55 倍，此變化則與歐前胡素和異歐前胡素含量變化一致。說(shuō)明一定時(shí)間低強(qiáng)度的超聲波處理，能夠促進(jìn)北沙參愈傷組織生長(zhǎng)和香豆素的合成，這可能是由于低強(qiáng)度的超聲波處理使細(xì)胞膜和細(xì)胞器的形態(tài)發(fā)生變化，從而導(dǎo)致細(xì)胞代謝和膜通透性的改變［26-27］，促進(jìn)了愈傷組織的生長(zhǎng)；而且超聲波的機(jī)械刺激強(qiáng)化了生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中的傳質(zhì)和混合，提高了酶活性，使細(xì)胞內(nèi)代謝反應(yīng)更加旺盛，從而提高了代謝產(chǎn)物的合成量［28］。

3 結(jié) 論

利用植物愈傷組織或細(xì)胞懸浮培養(yǎng)可以生產(chǎn)用于預(yù)防和治療疾病的植物次生代謝產(chǎn)物。近年來(lái)，這一領(lǐng)域的發(fā)展極為迅速，已經(jīng)研究了400多種植物，從培養(yǎng)細(xì)胞中分離到600多種次級(jí)代謝產(chǎn)物［29］，通過(guò)添加外源誘導(dǎo)子改變植物次生代謝途徑，是植物提高次生代謝產(chǎn)物的有效方法之一。本實(shí)驗(yàn)研究中考察了SA、MeJA及超聲波3 種誘導(dǎo)因子子對(duì)北沙參愈傷組織生長(zhǎng)及香豆素合成的影響。結(jié)果表明，SA和MeJA對(duì)北沙參愈傷組織的生長(zhǎng)均具有一定的抑制作用；而低強(qiáng)度的超聲波則對(duì)北沙參愈傷組織的生長(zhǎng)具有較明顯的促進(jìn)作用，且隨超聲波時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)生長(zhǎng)快速的特點(diǎn)，但時(shí)間過(guò)長(zhǎng)也會(huì)抑制其生長(zhǎng)量的增加。HPLC測(cè)定香豆素含量結(jié)果表明，SA、MeJA和超聲波對(duì)香豆素均有一定的促進(jìn)作用，當(dāng)SA質(zhì)量濃度在28～30 mg/L之間時(shí)，總香豆素含量達(dá)到最大值，約為對(duì)照的2.33 倍；當(dāng)MeJA濃度達(dá)400 μmol/L時(shí)，總香豆素含量達(dá)到最大值14.86 μg/g，是對(duì)照的5.11 倍；當(dāng)超聲波處理30 min時(shí)，愈傷組織中歐前胡素和異歐前胡素的含量達(dá)最大值5.51 μg/g和3.69 μg/g，分別為處理前的5.15 倍和4.20 倍；而補(bǔ)骨脂素則在10 min超聲處理后達(dá)到最大值3.60 μg/g，為對(duì)照的1.50 倍，總香豆素含量達(dá)11.9 μg/g，為對(duì)照的3.55 倍。綜上，通過(guò)比較3 種誘導(dǎo)子對(duì)北沙參愈傷組織誘導(dǎo)處理后香豆素含量的變化發(fā)現(xiàn)，與SA和超聲波相比，MeJA更能夠有效地促進(jìn)北沙參中次生代謝產(chǎn)物——香豆素的合成。而關(guān)于誘導(dǎo)子調(diào)控北沙參中香豆素合成的機(jī)理，以及如何更有效地協(xié)同利用誘導(dǎo)子促進(jìn)北沙參中香豆素含量的提高，是后續(xù)實(shí)驗(yàn)中需要進(jìn)一步解決的問(wèn)題。

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Effects of Salicylic Acid， Methyl Jasmonate and Ultrasound on the Production of Cumarins and Growth of Radix Glehniae Callus

MIAO Xiaoyan， ZHU Weihong， ZHANG Xiaomei*， WANG Lin
（Department of Biochemistry， Baoding University， Baoding 071000， China）

The effects of methyl jasmonate （MeJA）， salicylic acid （SA） and ultrasonic treatment on the production of cumarins （imperatorin， isoimperatorin and psoraleae as measured by HPLC） and growth of callus tissue of Radix Glehniae were explored. The results showed that SA and MeJA could cause growth inhibition in callus tissue， while low-intensity ultrasound treatment for a certain time had a positive effect on callus vitality. Additionally， the production of cumarin could be promoted to different extents by all three factors. When the concentration of salicylic acid was 8 mg/L， the content of imperatorin reached its maximum level， which was 3.8 times higher than the control， but SA had only a marginal impact on psoralen. When the concentration of salicylic acid increased to 16 mg/L， the production of psoralen reached its maximum level， which was 1.7 times higher than the control. When the concentration of salicylic acid further rose to 28-30 mg/L，the maximum content of isoimperatorin and total cumarins was achieved showing a 2.33-fold increase compared with the control. The MeJA concentration of 400 μmol/L resulted in maximum production of psoralen and isoimperatorin， which was increased by 6.09 and 5.53 times in comparison with the control， respectively； meanwhile the maximum content of total cumarins was observed， which was 5.11 times higher than that of the control. After ultrasound treatment for 30 min，the production of imperatorin， isoimperatorin and total cumarins reached their maximum levels （5.51， 3.69 and 11.90 μg/g），which were 5.15， 4.20 and 3.55 times higher than those of the control， respectively； when ultrasonic treatment lasted 10 min，the maximum production of psoralen was found， which was 1.5 times higher than that of the control. In summary， compared with ultrasonic treatment and SA， MeJA could more effectively promote the production of coumarins in Radix Glehniae.

Radix Glehniae； cumarin； methyl jasmonate； salicylic acid； ultrasound

10.7506/spkx1002-6630-201609034

Q945.1

A

1002-6630（2016）09-0181-05

苗曉燕， 朱維紅， 張?bào)忝罚?等. 水楊酸、茉莉酸甲酯及超聲波對(duì)北沙參愈傷組織生長(zhǎng)及產(chǎn)香豆素的影響［J］. 食品科學(xué)，2016， 37（9）： 181-185. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201609034. http：//www.spkx.net.cn

MIAO Xiaoyan， ZHU Weihong， ZHANG Xiaomei， et al. Effects of salicylic acid， methyl jasmonate and ultrasound on the production of cumarins and growth of Radix Glehniae callus［J］. Food Science， 2016， 37（9）： 181-185. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/spkx1002-6630-201609034. http：//www.spkx.net.cn

2015-06-22

保定學(xué)院重點(diǎn)基金資助項(xiàng)目（2010z03）；河北省教育廳高等學(xué)?？茖W(xué)研究項(xiàng)目（Z2012007）

苗曉燕（1980—），女，副教授，碩士，研究方向?yàn)樯飳W(xué)。E-mail：miaoxiaoyan3205@126.com

*通信作者：張?bào)忝罚?957—），女，教授，本科，研究方向?yàn)樯飳W(xué)。E-mail：zhxm06@163.com