高效液相色譜法測定果凍中阿斯巴甜含量的不確定度評定

王忠一李燕 吳帥

（煙臺市食品藥品檢驗檢測中心，山東煙臺264000）

高效液相色譜法測定果凍中阿斯巴甜含量的不確定度評定

王忠一*李燕 吳帥

（煙臺市食品藥品檢驗檢測中心，山東煙臺264000）

阿斯巴甜屬于人工合成的甜味劑，由于其甜度高，熱量低，故廣泛應(yīng)用于食品生產(chǎn)中。我國GB 2760-2014《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中增加了對阿斯巴甜使用范圍和使用量的規(guī)定，其中在果凍中，阿斯巴甜允許最大使用量為1.0 g/kg，并規(guī)定添加阿斯巴甜的食品應(yīng)標(biāo)明：“阿斯巴甜（含苯丙氨酸）”。本試驗采用高效液相色譜法測定果凍中阿斯巴甜的含量，并參照相關(guān)不確定度評估的方法和文獻(xiàn)，建立數(shù)學(xué)模型，對其不確定度來源進(jìn)行分析、評定，給出不確定度報告。為日常檢測工作中阿斯巴甜的檢測結(jié)果評估和提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度提供參考。

1　方法與材料

1.1儀器與試劑

1260高效液相色譜儀，Agilent公司；CPA225D電子天平，德國賽多利斯公司；CT18RT臺式高速冷凍離心機(jī)，天美生化儀器公司。

阿斯巴甜標(biāo)準(zhǔn)品，Dr.Ehrenstorfer公司；甲醇，色譜純，美國Fisher 公司。

1.2試驗方法

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

阿斯巴甜標(biāo)準(zhǔn)儲備液：稱取0.100 g阿斯巴甜標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL容量瓶中，用蒸餾水溶解并定容至刻度。

阿斯巴甜標(biāo)準(zhǔn)使用液：分別移取2 mL、5 mL、10 mL、25 mL、50 mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液至100 mL 容量瓶中，定容后作為標(biāo)準(zhǔn)使用液。

1.2.2樣品前處理

稱取攪碎的果凍樣品10.000 g，加30 mL水超聲波震蕩提取20 min，定容至50 mL，10 000 r/min離心10 min，取上清液經(jīng)孔徑0.45 μm 濾膜過濾，備用。

1.2.3色譜條件

色譜柱：C18柱，250 mm×4.6 mm，5 μm；流動相：甲醇+水（40+60）；檢測器：二極管陣列檢測器；檢測波長：208 nm；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL。

2　數(shù)學(xué)模型的建立

本試驗中，阿斯巴甜含量計算公式為：

式中：X——試樣中阿斯巴甜含量，g/kg；

c——樣液中阿斯巴甜質(zhì)量濃度，mg/L；

m——取樣量，g；

V——試樣定容體積，mL；

frep——校正因子。

3　不確定度分量來源分析

通過數(shù)學(xué)模型和檢測方法分析，果凍中阿斯巴甜含量測定的不確定度主要影響因素為標(biāo)準(zhǔn)使用液的配制操作、試樣的稱量及定容操作、標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合過程、試樣非均勻性和試樣前處理操作的差異性等。

4　不確定度分量的量化分析

4.1樣液中阿斯巴甜含量測定值c的不確定度

4.1.1阿斯巴甜標(biāo)準(zhǔn)使用液引入的不確定度

4.1.1.1標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)本身引入的不確定度

依據(jù)所用阿斯巴甜標(biāo)準(zhǔn)品證書，標(biāo)準(zhǔn)品本身的不確定度為0.5%，其包含因子為k=2，得出相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：。

4.1.1.2天平的稱量引入的不確定度

依據(jù)所用稱量的電子天平檢定證書，稱量數(shù)值最大允差為±0.1 mg，阿斯巴甜標(biāo)準(zhǔn)品稱取0.100 g，假設(shè)符合矩形分布，，得出標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：；相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：。

4.1.1.3標(biāo)準(zhǔn)溶液配制操作引入的不確定度

a）標(biāo)準(zhǔn)溶液配制操作中玻璃量具引入的不確定度。

配制溶液時，先后使用了2 mL、5 mL、10 mL、25 mL、50 mLA級單標(biāo)線吸量管和100 mLA級容量瓶。依據(jù)JJG 196—2006《常用玻璃量具檢定規(guī)程》的規(guī)定，A級2 mL、5 mL、10 mL、25 mL、50 mL單標(biāo)線吸量管、100 mL 容量瓶的最大允許偏差分別為±0.010 mL、±0.015 mL、±0.020 mL、±0.030 mL、±0.05 mL、0.10 mL，假設(shè)符合矩形分布，，可得相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量，結(jié)果見表1。

表1　標(biāo)準(zhǔn)溶液配制操作中玻璃量具引入的不確定度

標(biāo)準(zhǔn)使用液配制操作中玻璃量具引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

b）標(biāo)準(zhǔn)溶液配制操作過程中試驗環(huán)境溫度變化引入的不確定度。

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制操作過程中，試驗環(huán)境的溫度波動也會產(chǎn)生一定不確定度。依據(jù)JJG 196—2006《常用玻璃量具檢定規(guī)程》的規(guī)定，玻璃量器的檢定應(yīng)在室溫20 ℃下進(jìn)行。試驗過程中試驗室溫度保持在20 ℃±5 ℃，在此溫度變化范圍內(nèi)，水的體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4℃-1遠(yuǎn)大于玻璃的體積膨脹系數(shù)，故忽略溫度對玻璃體積的影響，只考慮水的體積膨脹系數(shù)。假設(shè)溫度變化符合矩形分布，k=，由此計算不確定度，結(jié)果見表2。

表2　標(biāo)準(zhǔn)溶液配制操作過程中試驗環(huán)境溫度變化引入的不確定度

可得標(biāo)準(zhǔn)溶液配制操作中試驗環(huán)境溫度變化引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

則阿斯巴甜標(biāo)準(zhǔn)溶液配制操作過程引入的不確定度為：

4.1.2最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線求得樣液中阿斯巴甜含量過程所引入的不確定度

對5個濃度的阿斯巴甜標(biāo)準(zhǔn)使用液分別重復(fù)測定3次，結(jié)果見表3。

表3　阿斯巴甜標(biāo)準(zhǔn)使用液測定結(jié)果

根據(jù)表3中數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得擬合曲線為A=30.36C+7.99，式中A為峰面積，C為所測溶液中阿斯巴甜濃度，30.36為擬合曲線斜率b，7.99為擬合曲線截距a。

對試樣測定5次，測得峰面積A，由標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的線性回歸方程計算得出樣液中阿斯巴甜濃度分別為117 mg/ L、118 mg/ L、117 mg/ L、116 mg/ L、119 mg/ L，平均值為c樣=117 mg/ L，則可得最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線求得樣液中阿斯巴甜含量過程所引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

式中：SA——標(biāo)準(zhǔn)使用液峰面積殘差的標(biāo)準(zhǔn)偏差；

Sc——標(biāo)準(zhǔn)使用液濃度殘差的平方和；

n——標(biāo)準(zhǔn)使用液的測定次數(shù)，此方法為15次，n=15；

P——樣液的測定次數(shù)，此方法為5次，P=5。

可得最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線求得樣液中阿斯巴甜含量過程所引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：。

由阿斯巴甜標(biāo)準(zhǔn)使用液和擬合曲線的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量可得樣液中阿斯巴甜含量測定值c的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：。

4.2試樣稱量引入的不確定度

依據(jù)所用稱量的電子天平檢定證書，稱量數(shù)值最大允差為±0.1 mg，試樣稱取10 g，假設(shè)符合矩形分布，，可得標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：；相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：。

4.3試樣定容體積引入的不確定度

4.3.1試樣定容量器引入的不確定度

試樣定容使用50 mL容量瓶。依據(jù)JJG 196-2006《常用玻璃量具檢定規(guī)程》的規(guī)定，A 級50 mL容量瓶的最大允差為±0.05 mL。假設(shè)符合矩形分布，，可得標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：；相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：。

4.3.2試樣定容環(huán)境溫度變化引入的不確定度

容量瓶檢定環(huán)境溫度為20 ℃，實驗室環(huán)境溫度在20 ℃±5 ℃波動，水的體積膨脹系數(shù)2.1×10-4℃-1，假設(shè)溫度波動符合矩形分布，，可得標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：；相對不確定度為：。

由4.3.1和4.3.2二項可得試樣最終定容體積的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：。

4.4試樣的非均勻性及試樣前處理操作過程產(chǎn)生的不確定度

用試樣中阿斯巴甜含量測定結(jié)果重復(fù)性和阿斯巴甜加標(biāo)回收率重復(fù)性來量化試樣的非均勻性和試樣前處理操作過程引入的不確定度。

4.4.1試樣中阿斯巴甜含量測定結(jié)果重復(fù)性的不確定度

對試樣進(jìn)行8次平行測定，測定結(jié)果見表4。

表4　試樣中阿斯巴甜含量重復(fù)測定結(jié)果

可得試樣中阿斯巴甜重復(fù)測定所的平均值的標(biāo)

4.4.2阿斯巴甜加標(biāo)回收率的不確定度

在試樣中添加一定量的阿斯巴甜標(biāo)準(zhǔn)儲備液，重復(fù)進(jìn)行6次加標(biāo)回收試驗，測得的阿斯巴甜加標(biāo)回收率見表5。

表5　加標(biāo)回收率重復(fù)測定結(jié)果

由4.4.1和4.4.2可得試樣非均勻性和試樣前處理操作過程引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：。

4.5相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度的合成

由各標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量可得，試樣中阿斯巴甜含量測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：。

4.6擴(kuò)展不確定度的評估

按照一般要求，取包含因子k=2，可得擴(kuò)展不確定度為：U=uc（X）×2=0.01 g/kg。

4.7不確定度報告

被測果凍中阿斯巴甜含量不確定度報告如下：X=（0.58±0.01）g/kg；k=2。

5　討論

通過果凍中阿斯巴甜含量測定不確定度的評定，分析測定結(jié)果的主要影響因素。得出高效液相法測定果凍中阿斯巴甜含量的不確定度主要由阿斯巴甜標(biāo)準(zhǔn)品及標(biāo)準(zhǔn)使用液配制操作、標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合過程、試樣前處理操作等分量引入。在日常檢測過程中，可以通過控制主要不確定度分量的來源對試驗方法和操作進(jìn)行優(yōu)化，從而降低測定的不確定度，提高測定的準(zhǔn)確性。

［1］吳璞強(qiáng)，趙桂霞，張亞楠，等.阿斯巴甜的合成和應(yīng)用研究［J］.中國調(diào)味品，2010，35（1）：30-32.

［2］中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會. GB 2760—2014 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)［S］.北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2014：86-88.

［3］中華人民共和國衛(wèi)生部. GB/T 22254-2008 食品中阿斯巴甜的測定［S］.北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008：1-3.

［4］李皓，陳長武，張培剛，等.HPLC法測定果凍食品中阿斯巴甜含量的研究［J］. 食品科學(xué)，2008，29（8）：520-522.

［5］國家質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督總局. JJF 1059.1—2012 測量不確定度評定與表示［S］.北京：中國計量出版社，2012：1-53.

［6］袁輝，王建玲，遠(yuǎn)輝.超高效液相色譜法測定葡萄酒中檸檬酸含量的不確定度評定［J］.釀酒科技，2014（8）：109-112.

［7］杜淑霞.高效液相色譜法測定含乳飲料中安賽蜜含量的不確定度評定［J］.食品研究與開發(fā)，2010，31（2）：142-145.

［8］國家質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢驗檢疫總局. JJG 196—2006 常用玻璃量器檢定規(guī)程［S］. 北京：中國計量出版社，2006：1-22.

Assessment of the uncertainties in the determination of aspartame content in fruit jelly by UPLC

WANG Zhongyi*LI Yan WU Shuai
（Yantai testing center for food and drug，Shandong Yantai 264000，China）

按照J(rèn)JF 1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》的方法，建立高效液相色譜法測定果凍中阿斯巴甜含量的數(shù)學(xué)模型，分析其中各不確定度分量的來源，并對其分別進(jìn)行量化，最終合成果凍中阿斯巴甜含量測定結(jié)果的不確定度。通過分析得出，引入不確定度的主要分量有標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制操作、標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合過程、試樣前處理操作等。果凍中阿斯巴甜含量測定結(jié)果可表示為（0.58±0.01）g/kg，k=2。

高效液相色譜；果凍；阿斯巴甜；不確定度

According to the approach in Measurement Uncertainty and Results Indication （JJF 1059.1—2012），a mathematical model had been set up to assess the uncertainties in the determination of aspartame content in fruit jelly by high performance liquid chromatography （HPLC）.The source of each uncertainty in the mathematical model was analyzed，quantified and synthesized. Results indicated that main influence factors of the uncertainties in the determination were the preparation of standard solution，standard curve fitting process and sample pretreatment. The content of aspartame in fruit jelly could be shown as（0.58±0.01）g/kg，k=2.

high performance liquid chromatography （HPLC）；fruit jelly；aspartame；uncertainty

TS207.5+1

A

1673-6044（2016）01-0023-04

10.3969/j.issn.1673-6044.2016.01.008

* 王忠一，女，1988年出生，2011年畢業(yè)于西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程專業(yè)，助理工程師。

2016-01-14