CXCL14和EGFR在胃癌組織中的表達及其臨床意義*

楊雪何滔時麗芳鄭淑芳

·臨床研究與應用·

CXCL14和EGFR在胃癌組織中的表達及其臨床意義*

楊雪①何滔②時麗芳②鄭淑芳②

目的：探討趨化因子CXCL14和表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）在胃癌中的表達及與臨床病理特征間的關系。方法：收集2014年3月至2015年12月武警后勤學院附屬醫(yī)院手術(shù)切除胃癌標本121例及其癌旁非腫瘤胃黏膜62例和異體非腫瘤胃黏膜60例，采用免疫組織化學法分別檢測CXCL14和EGFR的表達。結(jié)果：胃癌組織中CXCL14和EGFR陽性表達率分別為80.17%和48.76%，均顯著高于癌旁非腫瘤胃黏膜和異體非腫瘤胃黏膜，差異均具有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）；CXCL14表達與胃癌浸潤深度、分化程度和臨床分期有關，差異均具有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；EGFR表達與胃癌分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期有關，差異均具有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。Spearman相關分析顯示，胃癌中CXCL14的表達與EGFR呈正相關（rs=0.195，P＜0.05）。結(jié)論：在胃癌中CXCL14異常表達可能與胃癌的發(fā)生發(fā)展有關，與EGFR表達呈正相關，推測二者在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中有一定協(xié)同作用。

胃癌CXCL14EGFR免疫組織化學

胃癌是消化道常見的惡性腫瘤之一。近年來在傳統(tǒng)綜合治療的基礎上，個體化治療和靶向治療更加被重視，尤其是依據(jù)HER-2檢測赫賽汀在胃癌治療中的應用提示深入探究、發(fā)現(xiàn)與胃癌發(fā)生發(fā)展相關的新生物學靶點具有重要的臨床意義。

趨化因子CXCL14是新近發(fā)現(xiàn)的趨化因子家族的新成員，與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關系只在肺癌等少數(shù)惡性腫瘤中有研究報道［1］。表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）是表皮生長因子受體，已有較多研究發(fā)現(xiàn)其與配體結(jié)合與腫瘤細胞的增殖、浸潤轉(zhuǎn)移相關［2］。Hata［3］研究發(fā)現(xiàn)CXCL14與EGFR間存在通路聯(lián)系，但國內(nèi)鮮有報道。本研究采用免疫組織化學法檢測CXCL14和EGFR在胃癌中的表達，探討二者表達與胃癌臨床病理特征的關系及二者間的相關性，為進一步實驗研究提供思路。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1標本資料收集武警后勤學院附屬醫(yī)院2014年3月至2015年12月胃癌切除石蠟包埋組織標本，包括121例胃癌及其62例距腫瘤邊緣5 cm以上的癌旁非腫瘤胃黏膜組織，另收集胃炎胃鏡活檢胃黏膜標本60例。以上標本經(jīng)石蠟切片、H&E染色后由兩位資深病理醫(yī)生確認診斷。所有胃癌患者術(shù)前未接受化療、放療及免疫治療等。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準。

1.1.2試劑試劑主要為兔抗人CXCL14多克隆抗體（一抗）購自美國ProteintechTM公司，稀釋濃度1：400；鼠抗人EGFR單克隆抗體（一抗）購自美國Origene公司稀釋濃度為1：200；辣根過氧化物酶標記的通用型二抗、清封閉液封閉用血清和DAB試劑盒均購自福州邁新生物技術(shù)有限公司，抗原修復儀及修復液購自丹麥Dako公司。

1.2方法

1.2.1免疫組織化學檢測所有標本均經(jīng)10%中性緩沖福爾馬林液固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片5張，1張用于H&E染色，其余4張黏附于涂膠載玻片上備做免疫組織化學染色。免疫組織化學采用SP法，常規(guī)烤片、脫蠟水化，修復儀修復，3%過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶，血清封閉非特異性抗原表位（EGFR無需羊血清封閉），一抗4℃冰箱過夜，之后二抗37℃孵育20 min，DAB顯色，蘇木素復染，脫水、透明、封片。以PBS代替一抗為陰性對照，以試劑公司提供的陽性切片為陽性對照，同批次染色。

1.2.2結(jié)果判斷標準CXCL14和EGFR陽性均呈黃色或棕黃色細顆粒狀，CXCL14蛋白定位于胞漿，EGFR定位于細胞膜和（或）細胞質(zhì)。結(jié)果判定采用半定量記分法。按細胞著色程度評分：0分為無著色、1分為淺黃色、2分為棕黃色、3分為棕褐色；再按陽性細胞所占百分比評分，每張切片選擇腫瘤區(qū)域依白細胞計數(shù)法隨機連續(xù)選擇10個高倍視野（10×40），每個視野計數(shù)100個細胞，陽性細胞數(shù)以10個高倍視野的平均值判定：＜5%為0分、6%～25%為1分、26%～50%為2分、51%～75%為3分、＞75%為4分。最后以兩者乘積判定結(jié)果≥4分定為陽性，＜4分定為陰性［4］。

1.3統(tǒng)計學分析

采用SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計學分析。CXCL14和EGFR蛋白表達陽性例數(shù)為計數(shù)資料，采用χ2檢驗進行多組間及組間兩兩比較，Spearman方法分析二者表達的相關性。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1CXCL14的表達情況

CXCL14在胃癌及其癌旁非腫瘤胃黏膜、異體非腫瘤胃黏膜組織中的陽性表達率分別為80.17%（97/ 121）、61.29%（38/62）、51.67%（31/60），差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，表1）；兩兩組間比較，胃癌組顯著高于其癌旁非腫瘤胃黏膜組和異體非腫瘤胃黏膜組，差異均具有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）；癌旁非腫瘤胃黏膜組與異體非腫瘤胃黏膜組間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.2EGFR的表達情況

EGFR在胃癌及其癌旁非腫瘤胃黏膜、異體非腫瘤胃黏膜組織中的陽性表達率分別為48.76%（59/ 121）、30.65%（19/62）、21.67%（13/60），差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，表1）；兩兩組間比較，胃癌組顯著高于癌旁非腫瘤胃黏膜組和異體非腫瘤胃黏膜組，差異均具有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）；癌旁非腫瘤胃黏膜組與異體非腫瘤胃黏膜組間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.3CXCL14和EGFR的表達與胃癌臨床病理特征的關系

胃癌組織中CXCL14的表達與胃癌浸潤深度、分化程度和臨床分期有關，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，表2），在癌組織浸潤至漿膜組中CXCL14的表達明顯高于浸潤至黏膜下層和肌層組（均P＜0.05），低分化胃癌組明顯高于高中分化組（P＜0.05），TNM分期Ⅲ+Ⅳ期組高于Ⅰ+Ⅱ期組（P＜0.05）。CXCL14的表達與胃癌患者年齡、性別、腫瘤大小、部位和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關（均P＞0.05）。

胃癌組織中EGFR的表達與胃癌分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期有關，差異均具有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05，表2），低分化胃癌組EGFR的表達明顯高于高中分化組（P＜0.01），有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（P＜0.05），TNM分期Ⅲ+Ⅳ期顯著高于Ⅰ+Ⅱ期組（P＜0.01）。但與患者年齡、性別、腫瘤大小、部位和浸潤深度無關（均P＞0.05）。

2.4胃癌組織中CXCL14和EGFR表達水平間的相關性

經(jīng)Spearman分析得到，胃癌組織中CXCL14和EGFR的表達呈正相關（rs=0.195，P=0.032）。

表1　胃癌及其癌旁非腫瘤胃黏膜、異體非腫瘤胃黏膜組織中CXCL14和EGFR的表達Table 1CXCL14 and EGFR expression in three groups

表2　CXCL14、EGFR的表達與胃癌臨床病理特征的關系（n）Table 2Relationship of CXCL14 and EGFR expression in gastric cancer with clinicopathological features（n）

圖1　CXCL14在胃癌和癌旁非腫瘤胃黏膜中的表達（SP×400）Figure 1Positive expression of CXCL14 in gastric cancer and adjacent non-tumor gastric mucosa（SP×400）

圖2　EGFR在胃癌和癌旁非腫瘤胃黏膜中的表達（SP×400）Figure 2Positive expression of EGFR in gastric cancer and adjacent non-tumor gastric mucosa（SP×400）

3 討論

趨化因子是器官形成和免疫防御過程中細胞遷移的重要調(diào)控因子，在炎癥形成時，與其相應受體結(jié)合調(diào)控免疫細胞的遷移，也存在調(diào)控腫瘤細胞遷移的可能。鄭淑芳等［5］發(fā)現(xiàn)趨化因子CXCL12在胃癌組織中的表達高于正常黏膜，其機制可能是趨化因子可與腫瘤細胞表面的特異受體結(jié)合而促進腫瘤細胞的增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移?；谮吇蜃釉谀[瘤發(fā)生發(fā)展過程中的重要作用［6］，作為該家族新成員的CXCL14將引起人們的熱切關注［7］。

本實驗結(jié)果顯示，CXCL14在胃癌組織中的陽性表達率為80.17%，分別高于其癌旁非腫瘤胃黏膜（61.29%）和異體非腫瘤胃黏膜組織（51.67%），這與Yanagie等［8］的實驗結(jié)果相一致，但與Hu等［9］的研究結(jié)果不同。另外，本實驗結(jié)果CXCL14的過表達與胃癌浸潤深度、分化程度和臨床分期均有關（P＜0.05），與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關（P＞0.05）。在癌組織浸潤至漿膜組中CXCL14的表達明顯高于浸潤至黏膜下層和肌層組（均P＜0.05），低分化胃癌組明顯高于高中分化組（P＜0.05），TNM分期Ⅲ+Ⅳ期組高于Ⅰ+Ⅱ期組（P＜0.05）。CXCL14的過表達與胃癌細胞的增殖浸潤有關。Wente等［10］的研究發(fā)現(xiàn)CXCL14僅增強胰腺癌細胞的浸潤性，而不影響其遷移。分析可能機制為胃癌細胞通過自分泌CXCL14的方式來刺激自身的增殖和浸潤。在頭頸部鱗癌（HNSCC）中CXCL14 mRNA表達下調(diào)，相應蛋白表達減少［11］，也有研究指出在某些腫瘤中CXCL14表達上調(diào)，如乳腺導管原位癌［12］、結(jié)直腸癌［13］、前列腺癌［14］及骨肉瘤［15］等。對于上述結(jié)果間的差異有待于加大樣本量和對不同腫瘤進行更深入研究。

EGFR屬于酪氨酸激酶Ⅰ型受體家族，廣泛表達于胃癌、肺癌、乳腺癌及結(jié)直腸癌等腫瘤細胞，與表皮生長因子等配體結(jié)合抑制腫瘤細胞凋亡，促進腫瘤細胞增殖、血管生成、黏附、侵襲和轉(zhuǎn)移。本實驗結(jié)果顯示，胃癌組織中EGFR的陽性表達率為48.76%，顯著高于癌旁非腫瘤胃黏膜和異體非腫瘤胃黏膜組織，其過表達與胃癌分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期有關（P＜0.05），這與Paliga等［16］的研究結(jié)果一致。此外，低分化胃癌組EGFR的表達明顯高于高中分化組（P＜0.01），有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（P＜0.05），TNM分期Ⅲ+Ⅳ期顯著高于Ⅰ+Ⅱ期組（P＜0.01）。上述研究提示EGFR參與促進胃癌發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程。

Hata［3］研究提出HNSCC細胞經(jīng)EGF處理后其CXCL14 mRNA及蛋白表達下調(diào)，又經(jīng)EGFR抑制劑吉非替尼處理后癌細胞中CXCL14 mRNA及蛋白表達上調(diào)，提示CXCL14的表達可能與EGF/EGFR信號通路有關。近期有研究提出經(jīng)EGFR通路下游信號分子（PI3K、MEK、ERK）的抑制劑處理各類型HNSCC細胞株后，癌細胞中CXCL14的表達水平發(fā)生變化，提示EGF/EGFR信號通路下游分子可能會通過自身的磷酸化來調(diào)控CXCL14的轉(zhuǎn)錄和表達，位于信號通路上游的EGFR調(diào)控整體信號的轉(zhuǎn)導，或CXCL14直接參與信號通路［17］。本實驗結(jié)果顯示，CXCL14與EGFR在胃癌組織中的表達存在相關性，二者呈正相關（P＜0.05），推測二者在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中可能存在某種協(xié)同作用，或CXCL14可能參與EGF/EGFR及其下游信號通路的信號轉(zhuǎn)導而影響胃癌進展。此外，該研究經(jīng)同種抑制劑處理HNSCC細胞株前后，各類型細胞株中CXCL14表達存在差異，這也提示CXCL14在不同類型細胞中的相關作用機制存在差異。

本研究與個別研究報道CXCL14在不同腫瘤中的表達和作用存在差異。因此，繼續(xù)深入研究明確CXCL14在腫瘤中的作用及機制，探討CXCL14參與的信號通路以及發(fā)現(xiàn)其特異受體是目前研究的關鍵。此外，CXCL14蛋白具有5個特殊的氨基酸序列［18］，即Val-Ser-Arg-Tyr-Arg，可被泛素-26S蛋白酶體快速降解，這說明對CXCL14的調(diào)控還存在轉(zhuǎn)錄后水平，而這一水平的相關機制尚不清晰，且胃癌中研究較少。因此，進一步深入研究有重要的臨床意義，可能為腫瘤治療的新靶點提供依據(jù)。

［1］Takiguchi S，Korenaga N，Inoue K，et al.Involvement of CXCL14 in osteolytic bone metastasis from lung cancer［J］.Int J Oncol，2014，44（4）:1316-1324.

［2］Li J，Tian Y.Targeting the epidermal growth factor receptor and the type 1 insulin-like growth factor receptor in cancer therapy［J］.J Clin Exper Medi，2016，15（8）:823-824.［李軍，田野.以表皮生長因子受體和胰島素樣生長因子-1受體為靶點的腫瘤治療研究［J］.臨床和實驗醫(yī)學雜志，2016，15（8）:823-824.］.

［3］Hata R.A new strategy to find targets for anticancer therapy:chemokine CXCL14/BRAK is a multifunctional tumor suppressor for head and neck squamous cell carcinoma［J］.ISRN Otolaryngol，2012，2012: 797619.

［4］Feng X，Liu C，Zhong DS，et al.Influence of immunohistochemistry scoring criteria in detecting EGFR mutations［J］.Chin J Lung Cancer，2015，18（12）:740-744.［馮鑫，劉暢，鐘殿勝，等.免疫組化染色評分對EGFR突變檢測的影響［J］.中國肺癌雜志，2015，18（12）；740-744.］

［5］Zheng SF，Shi LF，Yu J.Expression of SNCG and CXCR4 mRNAs in gastric adenocarcinoma and its clinical significance［J］.Chin J Clin Oncol，2014，41（17）:1094-1097.［鄭淑芳，時麗芳，于健.胃癌組織中SNCG和CXCR4mRNA的表達及臨床意義［J］.中國腫瘤臨床，2014，41（17）:1094-1097.］

［6］Wang HY，Huang YG，Li YF.The effects of chemotactic factor in tumor cell biological behavior［J］.Med Recapit，2014，20（17）:3128-3130.［王皓穎，黃尤光，李云峰.趨化因子對腫瘤細胞生物學行為的影響［J］.醫(yī)學綜述，2014，20（17）:3128-3180.］

［7］Lu J，Chatterjee M，Schmid H，et al.CXCL14 as an emerging immune and inflammatory modulator［J］.J Inflamm（Lond），2016，13（1）:1-8.

［8］Yanagie H，Hisa T，Ono M，et al.Chemokine and chemokine receptor related to cancer metastasis［J］.Gan To Kagaku Ryoho，2010，37（11）:2052-2057.

［9］Hu C，Lin F，Zhu G，et al.Abnormal hypermethylation of promoter region downregulates chemokine CXC ligand 14 expression in gastric cancer［J］.Int J Oncol，2013，43（5）:1487-1494.

［10］Wente MN，Mayer C，Gaida MM，et al.CXCL14 expression and potential function in pancreatic cancer［J］.Cancer Lett，2008，259（2）: 209-217.

［11］Sato K，Ozawa S，Izukuri K，et al.Expression of tumour-suppressing chemokine BRAK/CXCL14 reduces cell migration rate of HSC-3 tongue carcinoma cells and stimulates attachment to collagen and formation of elongated focal adhesions in vitro［J］.Cell Biol Int，2010，34（5）:513-522.

［12］Rohilla M，Bal A，Singh G，et al.Phenotypic and functional characterization of ductal carcinoma in situ-associated myoepithelial cells［J］. Clin Breast Cancer，2015，15（5）:335-342.

［13］Zeng J，Yang X，Cheng L，et al.Chemokine CXCL14 is associated with prognosis in patients with colorectal carcinoma after curative resection［J］.J Transl Med，2012，11（1）:1-16.

［14］Williams KA，Lee M，Hu Y，et al.A systems genetics approach identifies CXCL14，ITGAX，and LPCAT2 as novel aggressive prostate cancer susceptibility genes［J］.PLoS Genet，2015，11（5）:e1005127.

［15］Lu J，Song G，Tang Q，et al.IRX1 hypomethylation promotes osteosarcoma metastasis via induction of CXCL14/NF-kappaB signaling［J］.J Clin Invest，2015，125（5）:1839-1856.

［16］Paliga A，Marginean H，Tessier-Cloutier B，et al.The prognostic Significance of c-MET and EGFR overexpression in resected gastric adenocarcinomas［J］.Am J Clin Oncol，2015，10（6）:1-9.

［17］Kondo T，Ozawa S，Ikoma T，et al.Expression of the chemokine CXCL14 and cetuximab-dependent tumour suppression in head and neck squamous cell carcinoma［J］.Oncogenesis，2016，435（7）:e240.

［18］Peterson FC，Thorpe JA，Harder AG，et al.Structural determinants involved in the regulation of CXCL14/BRAK expression by the 26 S proteasome［J］.J Mol Biol，2006，363（4）:813-822.

（2016-07-05收稿）

（2016-09-01修回）

（編輯：楊紅欣校對：孫喜佳）

楊雪專業(yè)方向為腫瘤病理學。

E-mail：1026826497@qq.com

Expression and clinical significance of CXCL14 and EGFR in human gastric cancer

Xue YANG1，Tao HE2，Lifang SHI2，Shufang ZHENG2
Correspondence to:Shufang ZHENG；E-mail:zhengshf@126.com

1Postgraduate Training Basement of Jinzhou Medical University，The Affiliated Hospital of Logistics University of Chinese Armed Police Forces（PAP），Tianjin 300162，China；2Department of Pathology，Affiliated Hospital of Logistics University of Chinese People's Armed Police Forces（PAP），Tianjin 300162，China

This work was supported by the General Project of the Municipal Application Foundation and Cutting-edge Technology of Tianjin（No. 11JCYBJC13000）

Objective:To investigate the expression of C-X-C chemokine ligand-14（CXCL14）and epidermal growth factor receptor（EGFR）in human gastric cancer and to analyze the relationship of CXCL14 with clinicopathological features.Methods:The expression of CXCL14 and EGFR was detected by Immunohistochemical SP method in 121 cases of gastric cancer tissue，62 cases of the adjacent nontumor gastric mucosa，and 60 cases of allogeneic non-tumor gastric mucosa.Results:The positive rates of CXCL14 and EGFR expression were 80.17%and 48.76%in gastric cancer，respectively，and both were significantly higher in the adjacent non-tumor gastric mucosa and allogeneic non-tumor gastric mucosa.The differences were significant（P＜0.01）.Overexpression of CXCL14 was closely correlated with the depth of cancer invasion，differentiation，and clinical stage，and the differences were significant（P＜0.05）.Overexpression of EGFR was correlated with cancer differentiation，lymph node metastasis，and clinical stage.The differences were significant（P＜0.05）.Based on the Spearman correlation analysis，the expression of CXCL14 and EGFR in gastric cancer was positively correlated（rs= 0.195，P＜0.05）.Conclusion:Abnormal CXCL14 expression in gastric cancer may be associated with the occurrence and development of gastric cancer.CXCL14 expression is positively correlated with EGFR expression，suggesting that the two have a synergistic effect in gastric cancer development.

gastric cancer，CXCL14，EGFR，immunohistochemistry

10.3969/j.issn.1000-8179.2016.19.786

①錦州醫(yī)科大學武警后勤學院附屬醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地（天津市300162）；②武警后勤學院附屬醫(yī)院病理科

*本文課題受天津市應用基礎及前沿技術(shù)研究計劃面上項目（編號：11JCYBJC13000）資助

鄭淑芳zhengshf@126.com