人體線粒體N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶在釀酒酵母中的表達(dá)

韓寶仙，　高曉冬，　中西秀樹(shù)

（江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122）

人體線粒體N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶在釀酒酵母中的表達(dá)

韓寶仙，高曉冬*，中西秀樹(shù)

（江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122）

O-GlcNAc是一種廣泛存在于蛋白質(zhì)絲/蘇氨酸殘基上的動(dòng)態(tài)可逆的蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式，廣泛分布在細(xì)胞漿和細(xì)胞核中，參與調(diào)節(jié)多種細(xì)胞途徑。蛋白質(zhì)的O-GlcNAc糖基化與許多疾病密切相關(guān)，如糖尿病、神經(jīng)退行性疾病和癌癥等。在體內(nèi)，O-GlcNAc動(dòng)態(tài)修飾由N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶（OGT）和N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（OGA）協(xié)同完成。OGT具有3種異構(gòu)體，分別是ncOGT、mOGT和sOGT。目前對(duì)于mOGT的功能和調(diào)節(jié)機(jī)制尚未清楚。作者在釀酒酵母細(xì)胞中表達(dá)了人源的mOGT，發(fā)現(xiàn)mOGT抑制酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)。在釀酒酵母細(xì)胞中mOGT具有O-GlcNAc糖基化活性，當(dāng)其活性位點(diǎn)突變后，O-GlcNAc糖基化活性明顯降低，但其同樣能抑制酵母細(xì)胞生長(zhǎng)。作者在釀酒酵母細(xì)胞中構(gòu)建了研究mOGT的系統(tǒng)?？梢岳迷撊嗽椿慕湍负Y選和mOGT相互作用的蛋白質(zhì)和基因，也可以用來(lái)篩選抑制mOGT活性的藥物，進(jìn)而研究mOGT的功能與調(diào)節(jié)機(jī)制。

O-GlcNAc糖基化；人源化；釀酒酵母；線粒體N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶（mOGT）

Hart于1984年發(fā)現(xiàn)了蛋白質(zhì)的O-GlcNAc糖基化現(xiàn)象［1］。O-GlcNAc糖基化是O-GlcNAc基團(tuán)通過(guò)β-O-連糖苷鍵連接到蛋白質(zhì)的絲氨酸或蘇氨酸上的一種蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式。這種糖基化方式存在于所有高等真核生物中，與其他的蛋白質(zhì)糖基化不同，蛋白質(zhì)的 O-GlcNAc糖基化同時(shí)存在于胞核和胞漿中。目前己發(fā)現(xiàn)的O-GlcNAc修飾蛋白有近千種，而且其數(shù)量還在不斷增加［2-3］。O-GlcNAc糖基化與磷酸化一樣，是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過(guò)程，不斷伴隨著 O-GlcNAc的添加和移除［4］。如圖1所示，OGlcNAc糖基化只需要兩個(gè)酶的參與：β-N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶（OGT）［5］和β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（OGA）［6］，其中 OGT負(fù)責(zé)O-GlcNAc的添加，OGA負(fù)責(zé)O-GlcNAc的移除。打破 O-GlcNAc糖基化的動(dòng)態(tài)平衡，會(huì)誘發(fā)很多疾病，如糖尿病、神經(jīng)性退性疾病、心血管疾病等［7］。

圖1　O-糖基化修飾的方式［17］Fig.1　M odification mode of O-G lcNAcylation［17］

OGT幾乎存在于所有的組織中，在小鼠和人的體內(nèi)存在著至少 4種不同的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物及蛋白質(zhì)亞型。如圖2所示，OGT具有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域：一個(gè)是含有12個(gè)34肽重復(fù)序列（TPR）的N端結(jié)構(gòu)域，另一個(gè)是具有糖基轉(zhuǎn)移活性的C端結(jié)構(gòu)域，C端結(jié)構(gòu)域由2個(gè)保守的催化結(jié)構(gòu)域（catalytic domain，C D）C D I、C DⅡ和1個(gè)磷酸肌醇結(jié)合區(qū)域 （PPO）組成［8］。TPR結(jié)構(gòu)域主要參與調(diào)節(jié) OGT與底物蛋白的結(jié)合，能夠與不同的蛋白質(zhì)相互作用［9］。同時(shí)，TPR結(jié)構(gòu)域?qū)GT的活性存在一定程度的影響。OGT具有 3種異構(gòu)體，分別是 ncOGT（Nucleocytoplasmic OGT），mOGT（Mitochondrial OGT），sOGT（Shorter OGT），這3種異構(gòu)體的 C端結(jié)構(gòu)域是相同的，不同在于含有不同數(shù)目的TPR重復(fù)序列，它們分別就有12，9，2個(gè)TPR結(jié)構(gòu)域。ncOGT，sOGT定位在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，mOGT（Mitochondrial OGT）定位在線粒體內(nèi)膜上［10］。

圖2　OGT的結(jié)構(gòu)示意［8］Fig.2　Schematic diagram of O-GlcNAc transferase（OGT）［8］

基因組測(cè)序表明，人類與釀酒酵母存在著高度的基因保守性，尤其是那些和基本細(xì)胞代謝及分裂有關(guān)的基因［11-13］。許多與人類疾病相關(guān)的蛋白在酵母中均能找到與其氨基酸序列相似的蛋白質(zhì)［14-15］。正是由于基本大分子及細(xì)胞生理機(jī)制上都存在著保守性，在酵母細(xì)胞中表達(dá)出的人源性蛋白可以很好地保持原有功能，而且一些人類細(xì)胞的生理過(guò)程在酵母細(xì)胞中也能得以模擬。酵母細(xì)胞較之哺乳動(dòng)物細(xì)胞的突出優(yōu)點(diǎn)就是其基因組的柔韌性和易操作性，而且酵母細(xì)胞能為靶蛋白提供一個(gè)空白的表達(dá)背景，避開(kāi)了哺乳動(dòng)物各種復(fù)雜的生理過(guò)程對(duì)靶蛋白研究的干擾。利用酵母系統(tǒng)能很好的研究人類蛋白的功能及調(diào)節(jié)機(jī)制，可以從人的cDNA文庫(kù)中進(jìn)行高通量的相關(guān)基因的篩選。酵母是低等真核生物，其細(xì)胞中不存在OGT。目前對(duì)于mOGT的研究很少，它的功能及調(diào)節(jié)機(jī)制未知，本研究在釀酒酵母細(xì)胞中表達(dá)了人源的mOGT，通過(guò)釀酒酵母來(lái)研究mOGT的功能和調(diào)節(jié)機(jī)制。

1　材料與方法

1.1菌株與質(zhì)粒

釀酒酵母菌株Saccharomyces cerevisiaeYPH499，mOGT表達(dá)用質(zhì)粒 pRS424GAL1pr及引物相關(guān)信息見(jiàn)表1。

表1　該研究所用的菌株、質(zhì)粒和引物Table 1　Lists of strains，p lasm ids and primers used in this study

1.2試劑

限制性內(nèi)切酶、DNA T4連接酶及KOD DNA聚合酶：TaKaRa公司 （大連）；PCR產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒小量抽提試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、脫脂奶粉：上海生工；ClarityTM Western ECL Substrate顯色劑、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒：碧云天生物技術(shù)研究所；Mouse anti-HA一抗、Goat anti-mouse IGg-HRP二抗：北京全式金生物技術(shù)有限公司；O-Linked N-Acetylglucosamine Antibody（RL2）抗體：賽默飛世爾科技 （中國(guó)）有限公司；PVDF膜：美國(guó)伯樂(lè)公司；無(wú)水甲醇、無(wú)水乙醇等其他試劑：進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3主要儀器

電子天平、pH計(jì)：梅特勒-托利多儀器公司（上海）；恒溫培養(yǎng)箱、無(wú)菌操作臺(tái)：上海三發(fā)科學(xué)儀器公司；電泳儀：北京六一儀器廠；壓力蒸汽滅菌器（立式）：上海申安器械廠；恒溫?fù)u瓶柜：太倉(cāng)強(qiáng)樂(lè)設(shè)備廠；PCR儀、移液槍：Eppendorf公司；凝膠成像系統(tǒng)：美國(guó)Bio-Rad公司；SDS-PAGE凝膠電泳儀：美國(guó)伯樂(lè)公司；半干電轉(zhuǎn)儀：美國(guó)伯樂(lè)公司；紫外分光光度計(jì)、ImageQuantTMLAS 400mini：美國(guó)GE；熒光倒置顯微鏡：日本尼康公司。

1.4培養(yǎng)基及其他溶液配制

1.4.1LB培養(yǎng)基胰蛋白胨10 g/L，酵母抽提物5 g/L，氯化鈉10 g/L，瓊脂粉20 g/L（固體培養(yǎng)基）。

1.4.2YPAD培養(yǎng)基酵母抽提物20 g/L，蛋白胨10 g/L，腺嘌呤30 mg/L，瓊脂粉20 g/L（固體培養(yǎng)基），葡萄糖20 g/L。

1.4.3SD培養(yǎng)基YNB 6.7 g/L，缺陷型粉末2 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂粉20 g/L（固體培養(yǎng)基）。SG培養(yǎng)基是用半乳糖代替葡萄糖。

1.4.48 mol/L尿素480.48 g尿素，8.766 g NaCl，25mmol/L（pH 8.0），加去離子水定容至1 L。

1.4.5TBST溶液5 mol/L NaCl 30 mL，1 mol/L Tris·HCl（pH 8.0）10 mL，Tween20 500 uL，加去離子水定容至1 L。

1.4.65%脫脂牛奶稱取5g脫脂奶粉，用TBST定容至100mL。

1.4.7轉(zhuǎn)膜緩沖溶液稱取甘氨酸14.4 g，Tris·HCl 3.03，量取無(wú)水甲醇200mL，加去離子水定容至1 L。

1.5實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1細(xì)胞生長(zhǎng)分析將質(zhì)粒 pRS424-GALpr，pRS424-GALpr-mOGT轉(zhuǎn)化至 YPH499細(xì)胞中，在SD色氨酸缺陷平板上篩選陽(yáng)性克隆。將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子在以葡萄糖為碳源的色氨酸缺陷培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜，至 OD660為1.0，不同的轉(zhuǎn)化子取相同數(shù)量的細(xì)胞，分別以10倍梯度稀釋細(xì)胞，在以葡萄糖和半乳糖為碳源的色氨酸缺陷平板上點(diǎn)板，分別在 30℃和37℃培養(yǎng)細(xì)胞，觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。

1.5.2蛋白質(zhì)提取將不同細(xì)胞接種在 5mL以葡萄糖為碳源的SD色氨酸培養(yǎng)基上，于37℃培養(yǎng)至OD660為1.0，收集細(xì)胞轉(zhuǎn)移至25mL以葡萄糖為碳源的SD色氨酸培養(yǎng)基上，于37℃培養(yǎng)至OD660為1.0，收集細(xì)胞轉(zhuǎn)移至30mL以半乳糖為碳源的SG色氨酸培養(yǎng)基中，起始OD660為0.4，37℃培養(yǎng)至OD660為0.8～1.0。不同轉(zhuǎn)化子收集相同數(shù)量的細(xì)胞，用PBS洗細(xì)胞2次，加8 mol/L尿素緩沖溶液和蛋白酶抑制劑PMSF，加玻璃珠振蕩破碎細(xì)胞，15 000 g離心10min，上清液即為所提取蛋白質(zhì)。用 BCA試劑盒測(cè)蛋白質(zhì)濃度。

1.5.3蛋白質(zhì)免疫印跡電泳：取 100 ug蛋白質(zhì)樣品上樣跑電泳，濃縮膠電壓 80 V，40 min，分離膠電壓100 V，90min；轉(zhuǎn)膜：采用半干式轉(zhuǎn)膜方式，電壓25 V，電流1.0 A，時(shí)間30min；封閉：5 g/dL的脫脂奶粉封閉3 h；孵育抗體：一抗1∶3 000，4℃過(guò)夜；二抗1∶5 000室溫1 h；顯色：ECL顯色液 A和 B混勻，涂于膜上，用ImageQuant LAS4000mini顯色。

2　結(jié)果與討論

2.1mOGT活性表達(dá)及其對(duì)釀酒酵母細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

作者從人的cDNA文庫(kù)中克隆得到mOGT，并將其連接到酵母細(xì)胞表達(dá)載體pRS424-GALpr上，得到pRS424-GALpr-mOGT。在釀酒酵母YPH499細(xì)胞內(nèi)表達(dá)pRS424-GALpr-mOGT，研究在釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)mOGT的活性及mOGT對(duì)釀酒酵母細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。如圖3（a）所示，在以半乳糖為碳源的色氨酸液體培養(yǎng)基上誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h后，可檢測(cè)到細(xì)胞內(nèi)多種蛋白質(zhì)被mOGT糖基化。由此可知，在釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)mOGT具有O-GlcNAc糖基化活性，能夠糖基化釀酒酵母細(xì)胞的多種蛋白質(zhì)。如圖3（b）所示，在以葡萄糖為碳源的色氨酸缺陷培養(yǎng)基上，無(wú)半乳糖mOGT不表達(dá)，pRS424-GALpr-mOGT轉(zhuǎn)化子和對(duì)照pRS424-GALpr轉(zhuǎn)化子生長(zhǎng)情況相同，對(duì)釀酒酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)無(wú)影響。在以半乳糖為碳源的色氨酸缺陷培養(yǎng)基上，半乳糖誘導(dǎo)mOGT表達(dá)，無(wú)論是在30℃還是37℃下，mOGT的表達(dá)都會(huì)抑制釀酒酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)。這種抑制作用，可能正是因?yàn)閙OGT糖基化酵母細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)而影響它們的結(jié)構(gòu)與功能，從而影響釀酒酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)。

圖3　mOGT活性表達(dá)及其對(duì)釀酒酵母細(xì)胞生長(zhǎng)的影響Fig.3　mOGT shows the O-GlcNAcylation activity in yeast cell and inhibits the grow th of yeast

2.2H382A-mOGT突變子構(gòu)建、表達(dá)及活性分析

Michael［16］等研究發(fā)現(xiàn)，His498為OGT的催化活性位點(diǎn)，當(dāng)His498位點(diǎn)突變?yōu)锳la后，OGT活性降低至少95%，該位點(diǎn)對(duì)應(yīng)于mOGT的His 382位點(diǎn)。本研究旨在探究酵母細(xì)胞中當(dāng)mOGT的活性位點(diǎn)His 382突變?yōu)锳la后，突變的mOGT是否具有活性。利用融合PCR的方法，將mOGT的1144（C），1145（A），1146（T）位的堿基突變?yōu)镚CT，即將mOGT 382位的組氨酸（His）突變?yōu)楸彼幔ˋla）。將空質(zhì)粒pRS424-GALpr，pRS424-GALpr-mOGT-3HA，pRS424-GALpr-H382A-mOGT-3HA分別轉(zhuǎn)化至釀酒酵母YPH499細(xì)胞內(nèi)，得到的轉(zhuǎn)化子經(jīng)半乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h后，用anti-HA抗體檢測(cè)mOGT及突變體的表達(dá)情況，用O-Linked N-Acetylglucosamine Antibody（RL2）檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)糖基化情況，Actin作為內(nèi)參蛋白質(zhì)。如圖4（a）所示，當(dāng)mOGT的His 382位點(diǎn)突變?yōu)锳la后，對(duì)于mOGT的表達(dá)水平與穩(wěn)定性無(wú)影響。但是，如圖4（b）所示，表達(dá)H382A-mOGT的細(xì)胞內(nèi)被糖基化的蛋白質(zhì)明顯比表達(dá)野生型mOGT的被糖基化的蛋白質(zhì)少。由此可知，當(dāng)mOGT的活性位點(diǎn)His 382突變?yōu)锳la后，H382A-mOGT活性較野生型mOGT活性明顯降低。

圖4　H382A-mOGT在酵母細(xì)胞中活性明顯降低Fig.4　H382A-mOGT mutant protein shows decreased activity in yeast cells

2.3H382A-mOGT對(duì)釀酒酵母細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

本研究已發(fā)現(xiàn)H382A-mOGT的O-GlcNAc糖基化活性明顯降低，是否對(duì)于釀酒酵母細(xì)胞的抑制作用也明顯減弱？為探究H382A-mOGT對(duì)釀酒酵母細(xì)胞生長(zhǎng)的的影響，將質(zhì)粒pRS424-GALprmOGT、pRS424-GALpr-H382A-mOGT分別轉(zhuǎn)化至釀酒酵母YPH499細(xì)胞內(nèi)，觀察突變體對(duì)釀酒酵母細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。在以葡萄糖為碳源的色氨酸缺陷平板上，mOGT及H382A-mOGT未表達(dá)，突變體與野生型生長(zhǎng)狀況相同，均不抑制釀酒酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)。在以半乳糖為碳源的色氨酸缺陷平板上，經(jīng)半乳糖誘導(dǎo)后，mOGT、H382A-mOGT均表達(dá)，結(jié)果是H382A-mOGT同野生型的mOGT相同，都能抑制釀酒酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)，且抑制作用強(qiáng)度完全相同。這說(shuō)明mOGT的O-GlcNAc糖基化活性可能不是抑制釀酒酵母細(xì)胞生長(zhǎng)的主要原因，而mOGT的TPR結(jié)構(gòu)域與細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)相互作用，從而影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能，是抑制釀酒酵母細(xì)胞生長(zhǎng)的主要原因。

圖5　H382A-mOGT突變體同樣抑制釀酒酵母細(xì)胞生長(zhǎng)Fig.5　H382A-mOGT protein still inhibit the cell grow th of yeast

3　結(jié)語(yǔ)

在釀酒酵母細(xì)胞中表達(dá)了人源的mOGT，研究發(fā)現(xiàn)，在釀酒酵母細(xì)胞中mOGT具有O-GlcNAc糖基化活性，能夠糖基化釀酒酵母細(xì)胞的蛋白質(zhì)?？梢岳迷撊嗽刺腔湍?，通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)的方法來(lái)確定酵母細(xì)胞被糖基化的蛋白質(zhì)及位點(diǎn)，進(jìn)而研究在人體細(xì)胞內(nèi)被mOGT糖基化的蛋白質(zhì)，因此可通過(guò)該人源化酵母來(lái)研究mOGT的功能和調(diào)節(jié)機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，mOGT的TPR結(jié)構(gòu)域與細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)相互作用是抑制釀酒酵母細(xì)胞生長(zhǎng)的主要原因，可以通過(guò)該現(xiàn)象來(lái)研究與TPR結(jié)構(gòu)域相互作用的蛋白質(zhì)，進(jìn)而研究這些蛋白質(zhì)對(duì)于mOGT的生理功能的影響，可進(jìn)一步研究mOGT的調(diào)節(jié)機(jī)制。

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科技信息

歐盟批準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因大豆用于食物或動(dòng)物飼料

歐盟委員會(huì)宣布，已批準(zhǔn)進(jìn)口美國(guó)孟山都公司研發(fā)的Roundup Ready 2 Xtend轉(zhuǎn)基因大豆，同時(shí)還宣布批準(zhǔn)德國(guó)拜耳作物科學(xué)公司（Bayer CropScience）的1款轉(zhuǎn)基因大豆產(chǎn)品。在獲得歐盟批準(zhǔn)后，這2款轉(zhuǎn)基因大豆將被允許在食物或動(dòng)物飼料中使用，但不得用于種植。歐盟委員會(huì)在聲明中表示：“這些轉(zhuǎn)基因作物所生產(chǎn)的任何產(chǎn)品都將受制于歐盟嚴(yán)格的標(biāo)簽和可追溯性規(guī)定。”

［信息來(lái)源］國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.加拿大批準(zhǔn)蘋(píng)果酸氫鈉作為被膜劑用于部分食品［EB/OL］.（2016-7-25）. http://jckspaqj.aqsiq.gov.cn/wxts/gwbz/201607/t20160725_470884.htm

Expression of A Human M itochondrial N-acetylglucosam ine Transferase in Saccharomyces cerevisiae

HAN Baoxian，GAO Xiaodong*，NAKANISHIHideki
（School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi214122，China）

N-acetylglucosam ine（O-GlcNAc）modification on protein serines/threonines is a dynam ic，inducible and abundant post-translational modification，which is found on numerous cytoplasmand nucleus proteins，regulating many cellular process.It has demonstrated that O-GlcNAc plays important roles in some human diseases，such as diabetes and neurodegenerative. O-GlcNAcylation cycle is regulated by O-GlcNAc transferase（OGT）and O-GlcNAcase（OGA）in vivo.There are three isoforms of OGT have been found inmammalian cell.They are nucleoplasm ic OGT（ncOGT），m itochondrial OGT（mOGT）and shorter OGT（sOGT）.We have expressed mOGT in yeast cellsw ith a final goal to study its biological function.A certain number of yeast proteins were clearly revealed in mOGT overexpressed cells，demonstrating the activity ofmOGT in yeastcells.Furthermore，itwas found that humanmOGT protein inhibited the cell grow th of yeast.This humanized yeaststrain can beused for studying thebiological function and the regulationmechanism of humanmOGT.

O-GlcNAcmodification，humanization，Saccharomycescerevisiae，m itochondrial O-GlcNAc transferase（mOGT）

Q 786

A

1673—1689（2016）09—0987—06

2015-01-07

教育部科學(xué)技術(shù)研究重大項(xiàng)目（313027）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)項(xiàng)目（JUSRP311A02）。

高曉冬（1965—），男，浙江桐鄉(xiāng)人，農(nóng)學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事細(xì)胞糖生物學(xué)方面的研究。E-mail：xdgao@jiangnan.edu.cn