不對稱合成苯乳酸的酮酸還原酶基因克隆和表達

張玲玲，　許國超，　倪　曄*

（1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122；2.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫214122）

不對稱合成苯乳酸的酮酸還原酶基因克隆和表達

張玲玲1，2，許國超1，2，倪曄*1，2

（1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122；2.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫214122）

采用分子克隆手段從基因組數(shù)據(jù)庫中獲得5個可以不對稱還原苯丙酮酸合成手性苯乳酸的酮酸還原酶，并在大腸桿菌BL21（DE3）中成功表達。比較5個重組酮酸還原酶的酶活、轉(zhuǎn)化率、ee值等指標，來源于干酪乳桿菌的酮酸還原酶Lc KAR表現(xiàn)出最高的比活力和選擇性。純酶Lc KAR的比活力為0.32 U/mg，在不對稱還原反應(yīng)中遵循Prelog規(guī)則，產(chǎn)物為（R）-苯乳酸，且ee＞99%。對重組大腸桿菌BL21（DE3）/pET28a-LcKAR的培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進行優(yōu)化，最適培養(yǎng)條件為種齡6 h，接種體積分數(shù)為3%，誘導(dǎo)劑IPTG濃度為0.6 mmol/L，誘導(dǎo)時間為5 h，經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后Lc KAR的發(fā)酵酶活達到2.17×103U/L。

苯乳酸；酮酸還原酶；生物催化；不對稱還原；發(fā)酵優(yōu)化

苯乳酸（Phenyllactic acid，PLA），又名2-羥基-3苯基丙酸，是一類非常重要的化合物，在醫(yī)藥及生物防腐劑等方面具有非常廣泛的應(yīng)用。苯乳酸具有與其衍生物丹參素（β-3，4一二羥基苯基乳酸鈉）相同的藥理功能，可以調(diào)節(jié)人體內(nèi)的類固醇的水平和抗血小板聚集的活性。苯乳酸也是合成許多藥物的重要中間物，比如：降血糖藥恩格列酮（Englitazone）、非蛋白氨基酸施德?。⊿tatine）、抗艾滋病毒制劑、新型驅(qū)腸蟲藥PFl022A等［1］。此外，近年來發(fā)現(xiàn)苯乳酸可作為新型的生物防腐劑，且具有非常廣泛的抗菌譜，對革蘭氏陽性菌（如金黃色葡萄球菌、單核增生性李斯特菌）、革蘭氏陰性菌（如大腸桿菌、沙門氏菌）和真核微生物（如曲霉青霉）等均有抑制作用。

利用生物法合成苯乳酸的研究一直是國內(nèi)外研究的熱點，可分為發(fā)酵法和生物催化法。早在1986年，Kamata M等［2］人開始利用Brevibacterium lactofermentum發(fā)酵制備（R）-PLA，產(chǎn)物質(zhì)量濃度為1.94 g/L；2004年，李德茂等［3］采用菌株Staphylococcus haemolyticus T0l發(fā)酵制備 （R）-PLA，產(chǎn)量為1.59 g/L。2013年，郁書懷等［4］通過菌株 Pediococcus pentosaceus發(fā)酵生產(chǎn)苯乳酸，產(chǎn)物質(zhì)量濃度僅為0.91 g/L（5.5 mmol/L）；通過發(fā)酵法生產(chǎn)苯乳酸的產(chǎn)物水平低，不能達到工業(yè)應(yīng)用的要求。生物催化法主要是利用還原酶將前手性的苯丙酮酸（Phenylpyruvic acid，PPA）不對稱還原生成苯乳酸。2000年，Lavermicoccca P等［1］發(fā)現(xiàn) Lactobacillus plantarum菌株能用于不對稱合成（R）-PLA，產(chǎn)物質(zhì)量濃度為0.056 g/L；2011年，鄭兆娟等［5］人采用菌株Bacillus coagulans還原PPA制備苯乳酸，產(chǎn)物質(zhì)量濃度可達到37.3 g/L，2013年，通過定點突變的方法對來源于Lactobacillus bulgaricus的羰基還原酶進行改造，1.5 h內(nèi)可將50 mmol/L苯丙酮酸還原為苯乳酸，且立體選擇性ee＞99%［6］。因此，開發(fā)高效不對稱合成苯乳酸的催化劑具有重要的應(yīng)用前景。

不對稱合成苯乳酸的還原酶廣泛地存在于大自然界中，我們可以從環(huán)境中篩選出高活力、高轉(zhuǎn)化率的還原酶產(chǎn)生菌株。然而，目標酶在野生菌中的表達量較低，進而導(dǎo)致底物的上載量無法達到工業(yè)應(yīng)用的要求。伴隨著基因數(shù)據(jù)庫資源的不斷增加和蛋白質(zhì)工程改造技術(shù)的發(fā)展，獲得高效生物催化劑的時間逐漸縮短［7］。

作者通過對基因數(shù)據(jù)庫篩選，獲得5個酮酸還原酶基因 ，分別 來源于Escherichia coli、Saccharomyces cerevisiae、Lactobacillusplantarum、Kluyveromyces sp.、Lactobacillus casei，將它們在E.coli BL21（DE3）中重組表達，篩選得到能高效不對稱合成光學(xué)純苯乳酸的酮酸還原酶，并對其培養(yǎng)基組成及發(fā)酵產(chǎn)酶的條件進行了優(yōu)化。

1　材料與方法

1.1菌株、質(zhì)粒與試劑

所用的菌株和質(zhì)粒詳見表1。Ezup柱式細菌/酵母基因組提取試劑盒：上海生工生物有限公司；苯乳酸（PLA）：Sigma公司；苯丙酮酸（PPA）：上海笛柏化學(xué)品技術(shù)有限公司；氧化型 （NAD+）和還原型（NADH）煙酰胺腺嘌呤二核苷酸：上海玉博生物有限公司；其余試劑和藥品均為國產(chǎn)或進口分析純。

表1　本研究所用菌株和質(zhì)粒Table 1　Strains and p lasm ids used in this study

1.2酮酸還原酶的克隆與表達

使用Ezup柱式細菌/酵母基因組提取試劑盒分別提取 E.coli、L.casei、L.plantarum、S.cerevisiae，Kluveromyces sp.的基因組。以表2所列的引物進行PCR擴增目的基因，經(jīng)Nde I和Xho I雙酶切后連接至載體pET24a或pET28a，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3）。將重組子接種于含50μg/mL卡那青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜。次日以2%的接種體積分數(shù)轉(zhuǎn)入新鮮的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD660約為0.6時，加入終濃度為0.6 mmol/L的IPTG，30℃誘導(dǎo)5 h。然后，4℃、8 000 r/min離心收集菌體，生理鹽水洗滌兩次后加入10mL磷酸鉀緩沖液（100mmol/L，pH 7.0），超聲破碎，離心取上清液即為粗酶液。根據(jù)方法1.3測定酶活力，并進行SDS-PAGE分析。

表2　本研究中所用引物Table 2　Primers used in this study

1.3酮酸還原酶活力的測定

酮酸還原酶的活性測定方法：總反應(yīng)體系為250μL，包括磷酸鉀緩沖液 （KPB，100mmol/L，pH 7.0），0.5 mmol/L NADH，5 mmol/L PPA，混勻后于30℃保溫2 min，加入適量的酶液，檢測NADH在340 nm處吸收值的變化。酶活力單位（U）定義為：在上述條件下，每分鐘催化氧化1μmol NADH所需要的酶量。酶活力計算公式：

其中，EW為1 min內(nèi)340 nm處吸光值的變化；V為反應(yīng)液的總體積 （mL）；6 220為摩爾消光系數(shù)（L/（mol·cm））；l為光程距離（cm）。

蛋白質(zhì)含量測定采用Bradford法，以小牛血清白蛋白BSA為標準品［8］。

1.4水相中不對稱合成2-羥基-3-苯基丙酸

于10 mL KPB（100 mmol/L，pH 6.0）中加入適量的菌體，0.05 mmol/L NADH和10 g/L PPA，在30℃、200 r/min反應(yīng)12 h。取一部分混合液8 000 r/min離心5 min，除去菌體等不溶物質(zhì)，按照方法1.5進行HPLC分析；將另一部分混合液于8 000 r/min離心10 min，充分去除雜質(zhì)，上清液用3倍體積的乙酸乙酯萃取3次，加入過量的無水硫酸鎂過夜干燥，將處理后的樣品高速離心后按照方法1.6進行對映選擇性分析。

1.5HPLC分析苯丙酮酸和苯乳酸

采用反相HPLC分析底物及產(chǎn)物，色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18（150 mm×4.6 mm，5μm），流動相成分：0.5 g/L三氟乙酸/水（A）和0.5 g/L三氟乙酸/甲醇（B）混合液。梯度洗脫程序為：0～20 min 10%～100%B；20～25 min保持100%B；柱溫：30℃；流速1 mL/min。苯丙酮酸的檢測波長為290 nm，保留時間17.5min，苯乳酸的檢測波長為210 nm，保留時間9.5min。

1.6HPLC分析苯乳酸的手性

通過正相HPLC分析苯乳酸的手性，采用配有Chiralcel OJ-H（0.46 mm×250 mm×5μm）色譜柱的Agilent 1100 HPLC，流動相為正己烷/異丙醇/三氟乙酸（95/5/0.05），1.0mL/min流速，檢測器波長為210 nm，30℃柱溫，（R）-PLA保留時間32.8 min，（S）-PLA保留時間35.5min。

2　結(jié)果與討論

2.1不同來源的酮酸還原酶的克隆表達

以Bacillus coagulans（GenBankNO：ZP-04430752）［9］、Bacillus coagulans（GenBank NO：ZP-04430367.1）［9］、Saccharomyces cerevisiae（GenBank NO：NM-001183405）［10］的3個乳酸脫氫酶為探針，在基因數(shù)據(jù)庫中進行同源性比對，克隆表達與探針同源性在（60%～80%）的基因序列，它們分別來自于E.coli、Saccharomycescerevisiae、Lactobacillus plantarum、Kluyveromyces sp.、Lactobacillus casei的還原酶基因。測序結(jié)果與 GenBank中登記的Lp KAR（NC_004567.2，951 bp）、Ec KAR（EU895958，1233 bp）、Sc KAR（DAA07141，1031 bp）、Kl KAR（CBL74568.1，1475 bp）、Lc KAR（AEA57175，936 bp）的大小一致。將構(gòu)建好的重組菌經(jīng)誘導(dǎo)表達后，通過SDS-PAGE分析各蛋白質(zhì)的表達效果，結(jié)果見圖1。酮酸還原酶Lc KAR和Sc KAR表達量明顯較其它還原酶多，但大部分Sc KAR為不可溶蛋白質(zhì)，這可能是因為Sc KAR來源于真核微生物，而絕大部分Lc KAR以可溶蛋白質(zhì)的形式表達。其余3種酮酸還原酶Lp KAR、Ec KAR、Kl KAR的蛋白質(zhì)表達量較少（低于Sc KAR表達量的50%）。

圖1　重組酮酸還原酶Lp KAR、Ec KAR、Sc KAR、Kl KAR、Lc KAR的SDS-PAGE電泳圖譜Fig.1　SDS-PAGE analysis of recombinant expression of Lp KAR，Lc KAR，Sc KAR，Kl KAR and Ec KAR

2.2水相中不對稱合成2-羥基-3-苯基丙酸

按照實驗1.4的方法不對稱還原PPA，反應(yīng)12 h后分析轉(zhuǎn)化率及對映選擇性。來源于L.casei的重組酮酸還原酶Lc KAR表現(xiàn)出對PPA較高的比活力，純酶活力為0.32 U/mg，且對映選擇性大于99%，是理想的后續(xù)研究對象。來源于酵母菌的兩個酮酸還原酶Sc KAR和Kl KAR傾向于不對稱合成（S）-PLA，而其余的菌株傾向于不對稱合成 （R）-PLA，在不對稱還原過程中遵循Prelog規(guī)則。雖然Kl KAR活性不高（約0.11 U/mg），但對映選擇性較高（＞99%ee）。與此相反，來源于L.plantarum的酮酸還原酶Lp KAR雖然具有較高的活性（0.31 U/mg），但對映選擇性較低（10.7%ee）。

2.3酮酸還原酶序列分析

對分別來源于Lactobacillus plantarum（Lp KAR，PDBID：3EVT_A），Lactobacilluscasei（Lc KAR，AEA57175），Pediococcuspentosaceus（Pp LDH，ABJ67935）［11］，Pediococcusacidilactici（Pa LDH，ABJ67935）［12］，Lactobaciiius bulgaricus（Lb LDH，PDB ID：1J4A）［13］的酮酸還原酶的序列進行一致性分析。結(jié)果顯示，Lc KAR與Lp CR，Pp LDH，Pa LDH，Lb LDH的氨基酸序列同源性分別為 43.37%、19.77%、21.93%、19.13%。然后使用ESPript工具對上述5個酮酸還原酶的氨基酸序列進行比對，見圖2。發(fā)現(xiàn)Lc KAR，Lp CR，Pp LDH，Pa LDH，Lb LDH屬于酮酸還原酶家族，NADH依賴型。且保守序列Arg234是羧基或羰基底物的結(jié)合位點，可促進NADH與其相鄰的輔酶結(jié)合位點結(jié)合，保守序列Val77和Gly78是底物結(jié)合位點［14］。有研究表明，第52位和第299位氨基酸通常位于底物結(jié)合位點，這兩個位點的長鏈氨基酸突變?yōu)槎替湴被峥梢源蟠笤黾拥孜锏霓D(zhuǎn)化效率［6］。

2.4E.coli BL21（DE3）/pET28a-Lc KAR發(fā)酵產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

2.4.1發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化培養(yǎng)基的成分大致可分為碳源、氮源、無機鹽、生長因子等，對微生物生長的不同階段的新陳代謝及異源蛋白質(zhì)的表達提供原料。碳源是為微生物提供能源，組成細胞成分的碳架。氮源是構(gòu)成菌體細胞物質(zhì)，并為微生物提供能源及合成含氮代謝產(chǎn)物。無機鹽為微生物生長提供必需的礦質(zhì)元素，這些元素可以參與酶的合成，構(gòu)成酶活性基團，激活酶活性，維持細胞滲透壓等。因此培養(yǎng)基的組成和配比合適與否，對微生物的生長發(fā)育、異源蛋白的表達都會產(chǎn)生很大的影響。考慮到生產(chǎn)發(fā)酵成本，作者在LB培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，根據(jù)大腸桿菌生長發(fā)酵特性，選擇了常用的、廉價的有機和無機碳氮源，通過搖瓶水平對培養(yǎng)基的組成進行了優(yōu)化，實驗設(shè)計見表3。

圖2　α-酮酸脫氫酶的氨基酸序列對比Fig.2　Am ino acid sequence alignments of various 2-hydroxyacid dehydrogenases

表3　發(fā)酵培養(yǎng)基成分的優(yōu)化Table 3　Optim ization of fermentation media

培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果見圖3。對比1號、2號培養(yǎng)基可以看出，1號進口培養(yǎng)基的LcKAR的酶活力較高，細胞量低于國產(chǎn)培養(yǎng)基，進口培養(yǎng)基的豐富營養(yǎng)有利于外源蛋白質(zhì)的表達，但是其成本較高。對比3、4號培養(yǎng)基，加入甘油比加入葡萄糖的培養(yǎng)中Lc KAR的活力更高，細胞量更多，這可能是因為與甘油相比，葡萄糖更易利用，導(dǎo)致細胞快速生長，但外源蛋白質(zhì)的表達受到延滯，而甘油不僅可為微生物的生長提供碳源，還可以為外源蛋白質(zhì)的合成提供重要的碳原料等。對比2號、6號發(fā)現(xiàn)，加入蛋白胨的培養(yǎng)基比加入比玉米漿的培養(yǎng)基的Lc KAR的活力較高，但細胞量較少，這可能是因為動物來源的氮源比植物來源的氮源營養(yǎng)更豐富，有利于外源蛋白質(zhì)的分泌和表達，玉米漿是玉米淀粉生產(chǎn)的副產(chǎn)物，滅菌后有大量不溶物雜質(zhì)，導(dǎo)致離心后測定濕菌重增加。相比3號，5號檸檬酸的加入不利于菌體的生長和Lc KAR的表達。從生產(chǎn)成本和效益上考慮最終選擇的發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為：國產(chǎn)蛋白胨10 g/L，國產(chǎn)酵母粉8 g/L，氯化鈉10 g/L，甘油3 g/L，K2HPO44 g/L，（NH4）2SO43 g/L。

圖3　不同培養(yǎng)基中E.coli BL21（DE3）/pET28a-LcKAR的生長和產(chǎn)酶對比Fig.3　Comparison of the grow th and enzyme production in differentmedium

2.4.2誘導(dǎo)溫度及誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時機、誘導(dǎo)時間的優(yōu)化發(fā)酵條件會影響菌體的生長和產(chǎn)酶，研究了誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時間、誘導(dǎo)時機、誘導(dǎo)劑的濃度對菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的影響，結(jié)果見圖4。當誘導(dǎo)溫度從16℃上升至30℃時，酶活力逐漸增大，30℃時達到最大，當誘導(dǎo)溫度繼續(xù)上升時活性反而下降；0.5～1.5 h時開始誘導(dǎo)，酶活力不斷增加，在1.5 h（OD660約為0.6）時開始誘導(dǎo)的酶活力最高，此后隨著誘導(dǎo)開始時間延長，酶活力逐漸下降。Lc KAR的酶活力隨誘導(dǎo)時間也呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢，當誘導(dǎo)時間為5 h時酶活力達到最高。當IPTG濃度從0.2 mmol/L上升至0.6 mmol/L時，Lc KAR的酶活力逐漸增加，在IPTG為0.6mmol/L時達到最高，然后隨著IPTG的濃度的增加而降低。因此，最佳誘導(dǎo)溫度為30℃，誘導(dǎo)開始時間為1.5 h，IPTG濃度為0.6 mmol/L，誘導(dǎo)時間為5 h，在上述條件下Lc KAR酶活力為1.42×103U/L。

圖4　誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時機、誘導(dǎo)時間和IPTG濃度對大腸桿菌重組表達Lc KAR酶活的影響Fig.4　Effect of inducing tem perature，inducing occasion，inducing time and IPTG concentration on the activity of recombinant Lc KAR

2.4.3種齡的優(yōu)化為確定最佳種齡，研究了E.coli BL21（DE3）/pET28a-LcKAR的生長曲線，見圖5（a）。培養(yǎng)時間5～8 h，即為對數(shù)生長中后期。為了進一步確定最佳種齡，分別于種齡為2、3、4、5、6、7、8、9 h時轉(zhuǎn)接，1.5 h后加入終濃度為0.6 mmol/L IPTG誘導(dǎo)5 h。由圖5（b）可知，隨著種齡的增加，Lc KAR的酶活力逐漸增大，當種齡為6 h時酶活力最大，為1.92×103U/L。當種齡繼續(xù)增加時，酶活力逐漸下降。這可能是因為種齡過小，菌種還處在延緩期，轉(zhuǎn)接之后菌體早期生長緩慢。而當種齡過大，有些菌體可能已經(jīng)開始衰亡，因此選擇最佳種齡為6 h，此時期的菌體生長活力強，移種到發(fā)酵罐后能迅速生長以縮短延滯期，且具有穩(wěn)定的生產(chǎn)能力，外源蛋白質(zhì)的合成持續(xù)穩(wěn)定高產(chǎn)。

2.4.4接種體積分數(shù)的優(yōu)化接種體積分數(shù)的大小決定了生產(chǎn)菌株在發(fā)酵罐中生長繁殖的速度。采用較大的接種體積分數(shù)可以縮短發(fā)酵罐中菌體適應(yīng)培養(yǎng)基的時間，迅速生長到對數(shù)生長期。而接種體積分數(shù)過小，除了延長發(fā)酵周期外，往往還會引起其它不正常情況。因此接種體積分數(shù)對發(fā)酵產(chǎn)酶影響很大。采用種齡6 h和0.6 mmol/L IPTG，誘導(dǎo)時機1.5 h，誘導(dǎo)時間5 h，考察不同的接種體積分數(shù)對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響，見圖6。當接種體積分數(shù)為3%時，酶活力最高為1.96×103U/L，當接種體積分數(shù)低于或高于3%時，酮酸還原酶Lc KAR的活力都有所下降。因此確定最佳接種體積分數(shù)為3%。

圖5　E.coli BL21（DE3）/pET28a-LcKAR生長曲線及不同種齡對Lc KAR的產(chǎn)酶的影響Fig.5　Grow th curve of E.coli BL21（DE3）/pET28a-LcKAR　and Effect of seed ages on Lc KAR production

圖6　不同接種體積分數(shù)對Lc KAR的產(chǎn)酶的影響Fig.6　Effect of inoculation ratio on Lc KAR production

2.4.5E.coli BL21（DE3）/pET28a-LcKAR于3 L發(fā)酵罐中的發(fā)酵培養(yǎng)將種齡為6 h的E.coli BL21（DE3）/pET28a-LcKAR，以3%的接種體積分數(shù)接種于3 L發(fā)酵罐 （含1 L上述優(yōu)化的培養(yǎng)基），在上述優(yōu)化的條件下進行培養(yǎng)，每小時取樣檢測其活力與OD660的變化情況，結(jié)果見圖7。產(chǎn)酶與細胞生長是偶聯(lián)型的關(guān)系，Lc KAR的表達量隨著發(fā)酵時間的延長不斷升高，在發(fā)酵時間為8 h時酶活力達到最大，發(fā)酵酶活為 2.17×103U/L，約是Staphylococcus haemolyticus T0l［3］的58.5倍，是來源于Bacillus coagulans［4］還原酶的2.5倍。但隨時間的延長，Lc KAR的酶活力逐漸下降，這可能是因為在對數(shù)后期和平穩(wěn)期時細胞內(nèi)蛋白酶的積累，導(dǎo)致異源表達的Lc KAR的產(chǎn)量下降。

圖7　3 L發(fā)酵罐中菌體濃度和Lc KAR酶活的時間進程曲線Fig.7　Time course of cell density and Lc KAR activity in a 3 L bioreactor

3　結(jié)語

從基因數(shù)據(jù)庫中成功克隆表達了5個能不對稱還原苯丙酮酸合成苯乳酸的酮酸還原酶，并篩選得到來源于Lactobacillus casei的還原酶Lc KAR，其具有較高催化活性和對映選擇性（ee＞99%）。對重組表達LcKAR發(fā)酵條件進行了優(yōu)化，誘導(dǎo)溫度30℃，IPTG濃度0.6mmol/L，誘導(dǎo)時間5 h。采用上述條件在3 L罐中發(fā)酵，發(fā)酵酶活達到2.17×103U/L。本研究為生物催化法制備光學(xué)純苯乳酸提供了新的工具酶，為進一步利用該酶生產(chǎn)苯乳酸提供了理論支持。

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［14］UWE D，KARSTEN N，M ICHAEL K，et al.Crystal structure of a ternary complex of D-2-hydroxyisocaproate dehydrogenase from Lactobacillus casei NAD+and 2-oxoisocaproate at1.9?resolution［J］.Journal of M olecular Biolology，1997，267（35）：640-660.

科技信息

澳新擬允許植物甾醇添加于部分早餐中

2016年7月28日，據(jù)澳新食品標準局（FSANZ）消息，澳新食品標準局發(fā)布通知公告20-16，擬批準A1134號申請，修訂澳新食品標準法典部分要求，允許新資源食品植物甾醇添加于部分控制的谷物早餐中，其中“部分控制”是指單獨包裝的部分，或容易分割的部分。具體使用條件如下：谷物早餐的總纖維含量不低于3 g/50 g；早餐麥片中含有的總糖不超過30 g/100 g；總植物甾醇含量不低于0.8 g，不超過2 g。

［信息來源］廈門WTO工作站.澳新擬允許植物甾醇添加于部分早餐中 ［EB/OL］.（2016-8-1）.http://www.xmtbt-sps. gov.cn/detail.asp？id=52182

Cloning and Expression of Ketoacid Reductase for Asymmetric Synthesis of Phenyllactic Acid

ZHANG Lingling1，2， XU Guochao1，2， NIYe*1，2
（1.School of Biotechnology，JiangnanUniversity，Wuxi 214122，China；2.Key Laboratory of Industrial Biotechnology，M inistry of Education，Jiangnan University，Wuxi214122，China）

Phenyllactic acid was one of themost important compounds w ith w ide application in pharmaceuticals and biological preservatives.Five ketoacid reductases capable of asymmetric reduction of phenylpyruvic acid（PPA）into phenyllactic acid（PLA）were obtained from genome databases，and were heterogeneously over-expressed in E.coli BL21（DE3）.Among 5 enzymes，the recombinant ketoacid reductase from Lactobacillus casei（Lc KAR）displayed the best biocatalytic performance，w iththehighest specificactivityof 0.32U/mgof purifiedenzymeand enantioselectivity of＞99%.This Lc KAR obeys Prelog rule in the asymmetric reduction of PPA into（R）-PLA.The fermentationmedium composition and culture conditionsof recombinant E.coli BL21（DE3）/pET28a-Lc KAR were optim ized to be seed age of 6 h，3%inoculation，induced w ith 0.6 mmol/L IPTG at30℃for 5 h.Under above optimal conditions，the Lc KAR production could reach2.17 kU/L in a 3 L bioreactor.

phenyllactic acid，ketoacid reductase，biocatalysis，asymmetric reduction，fermentation optimization

Q 93

A

1673—1689（2016）09—0950—08

2014-11-12

國家自然科學(xué)基金項目（21276112）；國家973計劃項目（2011CB710800）；教育部新世紀優(yōu)秀人才計劃項目（NCET-11-0658）。

倪曄（1975—），女，江蘇無錫人，理學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事生物催化和酶工程方面研究。E-mail：yni@jiangnan.edu.cn