基于酶聯(lián)免疫反應(yīng)的玉米細(xì)菌性枯萎病菌快速檢測方法

孔德昭，　彭 娟，　劉麗強(qiáng)，　唐麗娟，　匡 華

（食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇 無錫214122）

基于酶聯(lián)免疫反應(yīng)的玉米細(xì)菌性枯萎病菌快速檢測方法

孔德昭，彭 娟，劉麗強(qiáng)，唐麗娟，匡 華*

（食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇 無錫214122）

通過菌體免疫小鼠獲得高靈敏的高特異性單克隆抗體，并以此為基礎(chǔ)建立一種快速、靈敏的單克隆抗體雙抗體夾心法檢測玉米細(xì)菌性枯萎病菌（Pantoea stewartill subsp.Stewartii）。通過小鼠脾臟融合實(shí)驗(yàn)獲得3株單克隆抗體（12B4、10B1、11C2），并通過雙抗體夾心法篩選配對細(xì)胞株，建立雙抗體夾心法。最低檢測限（LOD）為1.5×104cfu/mL，線性范圍在4.57×105～1.11× 108cfu/mL。該方法對玉米細(xì)菌性枯萎病菌具有很好的特異性，對玉米種子添加回收實(shí)驗(yàn)回收率為85.6%～90.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差低于5.0%。

玉米細(xì)菌性枯萎病菌；單克隆抗體；雙抗體夾心法；玉米

玉米細(xì)菌性枯萎病 （Stewart’s BacterialWilt of Corn）是玉米上的一種毀滅性的病害，我國尚無該病害發(fā)生。其病原菌玉米細(xì)菌性枯萎病菌，學(xué)名Erwinia stewartii Dye，異名Pawoea stewaritii subsp. stewartii［1］。玉米細(xì)菌性枯萎病菌（Pss）屬于腸桿菌科多源菌屬，是一種黃色、不運(yùn)動(dòng)、無內(nèi)生孢子、革蘭氏陰性兼性厭氧桿菌，可以引起玉米細(xì)菌性枯萎病。1897年首次發(fā)現(xiàn)于美國紐約長島，之后傳播到世界其他地區(qū)［3］。目前已知發(fā)生地區(qū)有加拿大、墨西哥、巴西、秘魯、圭亞那、意大利、波蘭、羅馬尼亞、南斯拉夫、泰國、越南、馬來西亞等。作為一種典型的維管束萎蔫病害，玉米在生長的各個(gè)階段均能被玉米細(xì)菌性枯萎病菌進(jìn)行侵染。玉米細(xì)菌性枯萎病菌可以通過帶菌種子遠(yuǎn)距離傳播（種傳）［4］，在病區(qū)則以昆蟲傳播為主，如玉米跳甲等。在國際貿(mào)易中，帶菌昆蟲和病株不易成為傳播途徑，因此帶菌種子是該病遠(yuǎn)距離傳播的主要因素，是傳入無病區(qū)的主要侵染源，病菌存在于種子的內(nèi)、外部。我國目前尚未發(fā)現(xiàn)玉米細(xì)菌性枯萎病的發(fā)生，但傳入風(fēng)險(xiǎn)很高，已經(jīng)列為我國進(jìn)境一類檢疫對象，只有證實(shí)未染菌的玉米產(chǎn)品才可以入境。在1992年農(nóng)業(yè)部頒布的《中華人民共和國進(jìn)境植物檢疫危險(xiǎn)性病、蟲、雜草名錄》中，被列為一類危險(xiǎn)性有害生物。

對玉米細(xì)菌性枯萎病菌的檢測診斷方法包括野外觀察、生理生化鑒定［5］、免疫學(xué)檢測和鑒定［6-7］以及PCR檢測技術(shù)［8-9］，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）技術(shù)［10］和生物傳感技術(shù)［11］也被用來檢測玉米細(xì)菌性枯萎病菌。

但生化檢測技術(shù)耗時(shí)過長，且檢測結(jié)果存在不可靠性。PCR檢測技術(shù)具有很好的靈敏性與準(zhǔn)確性，但由于依賴于昂貴的儀器和專業(yè)的檢測人員，不適用于大量產(chǎn)品的快速檢測。ELISA檢測技術(shù)依賴于高度特異性與靈敏性的抗體，在檢測靈敏度上雖然不如PCR方法，但是由于檢測快速、方便、便宜，因此十分適合于大批量樣品的粗篩檢測。

由于玉米細(xì)菌性枯萎病菌會(huì)對農(nóng)業(yè)帶來的巨大威脅與損失，因此快速準(zhǔn)確的檢測方法顯得尤為重要。因此作者制備了玉米細(xì)菌性枯萎病菌的單克隆抗體并建立了雙抗體夾心ELISA法，為玉米細(xì)菌性枯萎病菌的快速免疫檢測奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

6種植物病原菌菌株來自英國NCPPB中心（National Collection of Plant Pathogenic Bacteria）：玉米細(xì)菌性枯萎病菌（Pantoea stewartiisub sp.stewartii，NCPPB449），丁香假單胞桿菌斑點(diǎn)致病變種（Pseudomonas syringae pv.Maculicola，NCPPB1820），水稻細(xì)菌性谷枯病菌 （Burkholderia glumae，NCPPB 3591，NCPPB2391），水 稻 細(xì) 菌 性 條 斑 病 菌（Xanthomonas oryzae pv.Oryzicola，NCPPB 1585），丁香假單胞菌丁香致病變種 （Pseudomonas syringae pv.syringae，NCPPB2844）。弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑，3，3'，5，5'-；四甲基聯(lián)苯胺（TMB）明膠：Sigma公司；辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗兔/鼠IgG：康成生物工程公司產(chǎn)品；玉米種子：購自超市；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（NBY）：北京路橋公司；其余試劑：均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2主要儀器

MK3酶標(biāo)儀：Thermo scientific；PH050A型培養(yǎng)箱：上海恒一科學(xué)儀器有限公司制造；96孔酶標(biāo)板：無錫國盛實(shí)驗(yàn)器材有限公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1植物病菌培養(yǎng)方法玉米細(xì)菌性枯萎病菌凍存菌株使用LB培養(yǎng)基，pH 7.0，28℃條件下復(fù)蘇1～2 d，在營養(yǎng)瓊脂平板上劃線，28℃培養(yǎng)2～3 d，之后單菌落接種在NBY液體培養(yǎng)基中，pH 7.0，28℃培養(yǎng)2 d。其他菌株首先使用LB培養(yǎng)基復(fù)蘇1～2 d，在營養(yǎng)瓊脂上劃線活化培養(yǎng)2～3 d，然后挑取單菌落接種于M210培養(yǎng)基 （0.8%酶水解干酪素，0.5%蔗糖，0.03%K2HPO4，0.03%MgSO4·7H2O，pH 7.0），37℃培養(yǎng)。

1.3.2玉米細(xì)菌性枯萎病菌單克隆抗體的制備滅活的玉米細(xì)菌性枯萎病菌使用無菌生理鹽水調(diào)節(jié)菌體濃度為1010cfu/mL，取一定體積滅活菌體稀釋到適當(dāng)濃度后與弗氏完全佐劑等體積混合，乳化至形成油包水結(jié)構(gòu)后，皮下多點(diǎn)注射免疫6～8周齡的雌性BALB/c小鼠，劑量為108cfu/只，間隔周期為3周，之后使用弗氏不完全佐劑乳化，第3次免疫時(shí)劑量減半。3次免疫后小鼠尾部采血并利用間接ELISA檢測血清效價(jià)，待效價(jià)達(dá)到要求后，挑選效價(jià)最高的小鼠進(jìn)行腹腔注射沖刺免疫，劑量為1×107cfu/只。沖刺免疫3 d后，將小鼠處死并取脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合。融合過程中細(xì)胞篩選采用間接ELISA方法挑選對玉米細(xì)菌性枯萎病菌具有高親和力的強(qiáng)陽性的孔進(jìn)行亞克隆并凍存。使用最終凍存的細(xì)胞株制備腹水，并采用辛酸飽和硫酸銨法純化得到單克隆抗體。單克隆抗體標(biāo)記HRP采用NaIO4法，詳細(xì)步驟見參考文獻(xiàn)［12］。

1.3.3配對篩選利用雙抗體夾心ELISA法進(jìn)行單抗配對篩選，操作方法如下：將獲得的玉米細(xì)菌性枯萎病菌單抗分別稀釋到6μg/mL包被，封閉，然后加入玉米細(xì)菌性枯萎病菌標(biāo)準(zhǔn)品作為陽性對照（1×108cfu/mL，100μL/孔），加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液作為陰性對照（PBS，100μL/孔），37℃反應(yīng)1 h后，加入HRP標(biāo)記的單抗 （稀釋1 000倍），37℃反應(yīng)1 h，顯色并終止反應(yīng)，檢測后，取陽性孔吸光值與陰性孔吸光值比值≥2.1的配對進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，以確定最靈敏的配對并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線［13］。

1.3.4玉米細(xì)菌性枯萎病菌雙抗體夾心ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立以配對優(yōu)化后的ELISA雙抗體夾心法為基礎(chǔ)，建立玉米細(xì)菌性枯萎病菌雙抗體夾心ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線。將玉米細(xì)菌性枯萎病菌用PBS稀釋成一系列濃度，每個(gè)濃度做3個(gè)重復(fù)，零孔做6個(gè)重復(fù)。以玉米細(xì)菌性枯萎病菌濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的OD450值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)繪制的曲線選取最佳的線性范圍。最低檢測限（LOD）為陰性對照孔平均值與3倍標(biāo)準(zhǔn)差之和在標(biāo)準(zhǔn)曲線中所對應(yīng)的濃度。

1.3.5玉米細(xì)菌性枯萎病菌雙抗體夾心ELISA特異性玉米細(xì)菌性枯萎病菌（NCPPB449），丁香假單胞桿菌斑點(diǎn)致病變種（NCPPB1820），水稻細(xì)菌性谷枯病菌（NCPPB 3591，NCPPB2391），水稻細(xì)菌性條斑病菌（NCPPB 1585），丁香假單胞菌丁香致病變種（NCPPB2844）滅活菌株用PBS稀釋到108cfu/mL，并用建立的ELISA方法檢測，檢測同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線作為對照。

1.3.6實(shí)際樣品檢測取500 g超市購買的玉米種子，使用0.5%的NaOCl浸泡5～15min進(jìn)行表面消毒，然后使用無菌生理鹽水沖洗3次，無菌條件下晾干。表面消毒后的檢驗(yàn)樣品粉碎，適量無菌生理鹽水于4℃條件浸泡過夜。浸泡液轉(zhuǎn)移至離心管中，4 000 r/min下離心10 min，棄去沉淀，上清液轉(zhuǎn)入另外離心管，10 000 r/mim下離心15min，棄去上清液，加2mL生理鹽水使之懸浮，得到懸液［11］。使用國標(biāo)免疫分離方法驗(yàn)證懸液為陰性樣品［14］，即取用的玉米種子未被玉米細(xì)菌性枯萎病菌感染。在懸液中添加不同濃度玉米細(xì)菌性枯萎病菌 （1×106、5× 106、1×107cfu/mL）作為陽性質(zhì)控，使用懸液作為陰性質(zhì)控，每個(gè)濃度做3個(gè)重復(fù)。

2　結(jié)果與分析

2.1玉米細(xì)菌性枯萎病菌單克隆抗體及配對篩選

經(jīng)過融合篩選共獲得3株對玉米細(xì)菌性枯萎病菌強(qiáng)陽性的細(xì)胞株，配對篩選結(jié)果見表1。

表1　玉米細(xì)菌性枯萎病菌單抗配對結(jié)果Table 1　Pairw ise study of Pantoea stewartii subsp.stewartii m Abs

由結(jié)果可以看出，以抗體11C2作為捕獲抗體，以抗體10B1酶標(biāo)抗體作為檢測抗體時(shí)，所建立的雙抗體夾心法對玉米細(xì)菌性枯萎病菌具有較高的靈敏度。進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)表明，該對抗體配對的靈敏度與檢測范圍均為最佳配對。因此選擇11C2-10B1HRP作為最優(yōu)配對并建立雙抗體夾心法。

2.2玉米細(xì)菌性枯萎病菌雙抗體夾心ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

11C2-10B1HRP檢測玉米細(xì)菌性枯萎病菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1　玉米細(xì)菌性枯萎病菌雙抗體夾心ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　Standard curve of sandw ich ELISA for Pantoea stewartiisubsp.stewartii

圖1為玉米細(xì)菌性枯萎病菌雙抗體夾心法的非線性擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線，該方法對玉米細(xì)菌性枯萎病菌檢測的最低檢測限（LOD）為 5×104cfu/mL，定量限（QL）為4.57×105cfu/mL。LOD為0孔平均值加上3倍0孔SD對應(yīng)的菌體濃度。QL為2.1倍的0孔平均值所對應(yīng)的菌體濃度。線性范圍在4.57×105～1.11×108cfu/mL。

2.3玉米細(xì)菌性枯萎病菌雙抗體夾心ELISA特異性

11C2-10B1HRP雙抗體夾心法檢測玉米細(xì)菌性枯萎病菌的特異性見圖2。

圖2　玉米細(xì)菌性枯萎病菌雙抗體夾心ELISA特異性Fig.2　Specificity of monoclonal sandw ich ELISA for Pantoea stewartiisubsp.stewartii

圖2表明，該雙抗體夾心ELISA方法對玉米細(xì)菌性枯萎病菌有很好的特異性，與丁香假單胞桿菌斑點(diǎn)致病變種、水稻細(xì)菌性谷枯病菌、水稻細(xì)菌性條斑病菌、丁香假單胞菌丁香致病變種均沒有交叉反應(yīng)。

2.4玉米細(xì)菌性枯萎病菌雙抗體夾心ELISA對玉米種子的檢測

為檢驗(yàn)所建立雙抗體夾心ELISA方法的可靠性，參考國標(biāo)及文獻(xiàn)，對玉米種子樣品中玉米細(xì)菌性枯萎病菌進(jìn)行定量檢測?；厥章逝c相對標(biāo)準(zhǔn)偏差見表2。在玉米種子樣品的檢測中，對玉米細(xì)菌性枯萎病菌的回收率為85.6%～90.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差低于5.0%。顯示出所建立的雙抗體夾心ELISA方法在實(shí)際樣品檢測中具有較好的準(zhǔn)確性與穩(wěn)定性。

表2　雙抗體夾心ELISA對玉米種子中玉米細(xì)菌性枯萎病菌的檢測結(jié)果（n=3）Table 2　Result from analysis of Pantoea stewartii subsp. stewartii in incurred corn seed by monoclonal sandw ich ELISA（n=3）

3　結(jié)語

玉米細(xì)菌性枯萎病是玉米的一種毀滅性的病害，因此對玉米細(xì)菌性枯萎病菌的快速準(zhǔn)確的檢測顯得尤為必要。本研究中，我們制備了針對玉米細(xì)菌性枯萎病菌的單克隆抗體，并以此為基礎(chǔ)建立了雙抗體夾心ELISA檢測方法。其最低檢測限（LOD）為1.5×104cfu/mL，線性范圍在4.57×105～1.11×108cfu/mL。該方法對玉米細(xì)菌性枯萎病菌具有很好的特異性，對實(shí)際樣品檢測具有很好的準(zhǔn)確性與穩(wěn)定性，對于實(shí)際樣品的快速、準(zhǔn)確檢測具有很好的指導(dǎo)意義。

［1］MERGAERT J，VERDONCK L，KERSTERSK.Transfer of erw inia-ananas（synonym，erw inia-uredovora）and erw inia-stewartii to the genus pantoea emend as pantoea-ananas（serrano 1928）comb-nov and pantoea-stewartii（sm ith 1898）comb-nov，respectively，anddescriptionofpantoea-stewartiisubspindologenessubspnov［J］.InternationalJournalofSystematic Bacteriology，1993，43：162-173.

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科技信息

加拿大批準(zhǔn)一種蛋白酶用于水解蛋白與水解酵母

2016年7月14日加拿大衛(wèi)生部發(fā)布通告，修訂食品酶列表，批準(zhǔn)一種產(chǎn)自嗜熱脂肪地芽孢桿菌（Geobacillus stearothermophilus TP7）的蛋白酶用于水解動(dòng)物、植物與牛奶蛋白以及水解酵母。

目前加拿大衛(wèi)生部已批準(zhǔn)多種有機(jī)體來源的蛋白酶用于食品，這包括水解動(dòng)物、牛奶與植物蛋白。然而尚未批準(zhǔn)嗜熱脂肪地芽孢桿菌TP7。經(jīng)過評估，加拿大衛(wèi)生部認(rèn)為該蛋白酶用于食品是安全的。

［信息來源］食品伙伴網(wǎng).歐盟發(fā)布對孔雀石綠和發(fā)酵大豆提取物的安全性進(jìn)行評估［EB/OL］.（2016-7-15）.http: //news.foodmate.net/2016/07/387696.html

歐盟批準(zhǔn)UV處理的牛奶和反式白藜蘆醇作為新食品

2016年7月19日，歐盟通過歐委會(huì)決議EU 2016/1189，同意修訂EC 258/97指令，將UV處理的牛奶和反式白藜蘆醇作為新食品（原料）投放市場。具體要求為：（1）對新食品UV處理的牛奶給出了詳細(xì)的定義，并設(shè)定了維生素D3在UV處理的牛奶中的最高限量為0.5～3.2μg/100g（全乳）、0.1～1.5μg/100g（半脫脂乳）；標(biāo)簽中應(yīng)標(biāo)明“UV處理”和營養(yǎng)成分中需標(biāo)明“因UV處理產(chǎn)生的維生素D”含量；（2）新食品原料反式白藜蘆醇，作為膳食補(bǔ)充劑（片劑）提供給成年人服用，每天最大服用量不超過150mg；標(biāo)簽中應(yīng)標(biāo)明“反式白藜蘆醇”字樣，并具有“在醫(yī)生監(jiān)督下服用”描述字樣。同時(shí)對反式白藜蘆醇片劑的純度、鉛汞等限量要求做出明確的規(guī)定。

［信息來源］國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.歐盟批準(zhǔn)UV處理的牛奶和反式白藜蘆醇作為新食品 ［EB/OL］.（2016-7-19）.http://jckspaqj.aqsiq.gov.cn/wxts/gwsp/201607/t20160722_470812.htm

Rapid Detecion of Pantoea stewartii subsp.Stewartii Using Enzyme-Linked Immunoassay

KONG Dezhao，PENG Juan， LIU Liqiang，TANG Lijuan，KUANG Hua*
（State Key Lab of Food Science&Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Asensitiveandrapidmonoclonal antibody-basedsandw ichenzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）was established to detect Pantoea stewartill subsp.Stewartii（Pss）. Threemurinehybridomas（12B4/10B1/11C2）wereobtained from the spleen cells fused produce.A pairofmonoclonalantibodies（mAb）wasselected for the sandw ich ELISAmethod.ThemAb 10B1 was conjugated w ith horseradish peroxidase（HRP）as the detection antibody and themAb 11C2was used as the capture antibody.The lim it of detection of thismethod was 1.5×104cfu/m L，and the linear range from 4.57×105to 1.11×108cfu/m L.

Pantoea stewartill subsp.stewartii，monoclonalantibody，sandw ich ELISA，corn

S 432.42

A

1673—1689（2016）09—0958—05

2014-09-17

國家“十二五”科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAC01B07）。

孔德昭（1990—），男，安徽宣城人，食品安全檢測方向博士研究生。E-mail：kdz19900910@163.com

匡華（1981—），女，河南新鄉(xiāng)人，工學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事食品安全方面的研究。E-mail：kuangh@jiangnan.edu.cn