優(yōu)化黑曲霉檸檬酸生產(chǎn)菌株原生質(zhì)體形成條件及表達(dá)系統(tǒng)的建立

殷　嫻，　龐冬洽，　韓瑞枝，　李江華，　劉　龍， 堵國(guó)成， 陳　堅(jiān)*

（1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫214122）

優(yōu)化黑曲霉檸檬酸生產(chǎn)菌株原生質(zhì)體形成條件及表達(dá)系統(tǒng)的建立

殷嫻1，2，龐冬洽2，韓瑞枝2，李江華1，2，劉龍1，2， 堵國(guó)成1，2， 陳堅(jiān)*1，2

（1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫214122）

優(yōu)化了黑曲霉檸檬酸生產(chǎn)菌株的原生質(zhì)體形成條件并建立基因表達(dá)系統(tǒng)。利用酶解法制備原生質(zhì)體，最優(yōu)的酶解液配比為5mg/mL溶壁酶、0.2 U/mL幾丁質(zhì)酶和460 U/mL葡萄糖醛酸酶。最優(yōu)的滲透壓穩(wěn)定劑為0.7mol/L KCl，菌絲層厚度50μm，菌體量為0.003 g/mL。在培養(yǎng)基中添加1 mmol/LMn2+有助于減少原生質(zhì)體形成所需的酶量，在培養(yǎng)基中添加葡萄糖醛酸酶有助于得到獨(dú)立的孢子進(jìn)行萌發(fā)，從而促進(jìn)原生質(zhì)體的形成。利用共轉(zhuǎn)化的方式，可以同時(shí)將兩個(gè)表達(dá)框整合到基因組上并實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)。

黑曲霉；檸檬酸；原生質(zhì)體；共轉(zhuǎn)化

黑曲霉 （Aspergillus niger）是重要的工業(yè)生產(chǎn)菌，作為生物反應(yīng)器廣泛應(yīng)用于酶、抗生素、有機(jī)酸等物質(zhì)的生產(chǎn)。隨著黑曲霉基因組測(cè)序工作的完成以及對(duì)黑曲霉基因組表達(dá)譜進(jìn)行挖掘，黑曲霉的代謝網(wǎng)絡(luò)模型不斷得到完善，黑曲霉高產(chǎn)檸檬酸機(jī)制和高效分泌蛋白質(zhì)的機(jī)制得到更深層次的闡述［1-2］，通過(guò)分子改造對(duì)黑曲霉的代謝進(jìn)行調(diào)控來(lái)實(shí)現(xiàn)目的產(chǎn)物的積累已經(jīng)有諸多成功的報(bào)道［3-5］。但是，這些報(bào)道所使用的菌株均非檸檬酸生產(chǎn)菌株，目前還沒(méi)有對(duì)檸檬酸生產(chǎn)菌株進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化來(lái)積累目標(biāo)產(chǎn)物的報(bào)道。不同株系的黑曲霉基因組差別巨大［1］，基因表達(dá)的差異造成其形態(tài)差異明顯，細(xì)胞壁成分也有所不同。因此，需要建立黑曲霉檸檬酸生產(chǎn)菌株的表達(dá)系統(tǒng)。

絲狀真菌的轉(zhuǎn)化方法主要有4種：電轉(zhuǎn)化法、農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法和PEG介導(dǎo)法。電擊轉(zhuǎn)化法是以原生質(zhì)體或者完整的細(xì)胞為受體的轉(zhuǎn)化方法。利用短暫的電場(chǎng)脈沖作用，使生物膜的類脂分子層發(fā)生瞬時(shí)混亂，膜通透性瞬時(shí)增大，使DNA進(jìn)入細(xì)胞。由于質(zhì)膜的可修復(fù)性，外加電場(chǎng)造成的膜穿孔在一定時(shí)間內(nèi)可自動(dòng)修復(fù)，使細(xì)胞恢復(fù)到正常的生理狀態(tài)，但該方法對(duì)黑曲霉的轉(zhuǎn)化效率極低［6］。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是根瘤農(nóng)桿菌A.tumefaciens通過(guò)類似結(jié)合的過(guò)程把Ti質(zhì)粒中的T-DNA轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞基因組中。在產(chǎn)酶黑曲霉中，該轉(zhuǎn)化方法獲得成功的應(yīng)用［7］，但對(duì)產(chǎn)酸黑曲霉轉(zhuǎn)化效率很低?；驑尫ㄗ鳛橐环N萬(wàn)能基因轉(zhuǎn)化法，可以直接將外源DNA導(dǎo)入可再生的細(xì)胞，但缺點(diǎn)是價(jià)格昂貴、嵌合體不易排除、不易選擇轉(zhuǎn)化體、轉(zhuǎn)化頻率低以及轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞再生困難，目前尚無(wú)在黑曲霉中應(yīng)用的報(bào)道。PEG介導(dǎo)法是目前在黑曲霉中應(yīng)用最廣泛的方法，轉(zhuǎn)化材料為原生質(zhì)體。原生質(zhì)體作為受體細(xì)胞具有群體數(shù)量大、容易獲得純合性的轉(zhuǎn)化子等優(yōu)點(diǎn)，但原生質(zhì)體具有培養(yǎng)難度大、再生頻率低和周期長(zhǎng)等缺點(diǎn)。該方法已經(jīng)在野生菌株 A.niger N400［8-9］、N402［3，5］中應(yīng)用。在來(lái)源于N402的pyrG缺陷型菌株AB4.1［10］、野生型菌株CAD4［11］、NW185的pyrA缺陷型菌株NW186［4］以及糖化酶生產(chǎn)菌株BO-1［12］中獲得應(yīng)用。野生型菌株和產(chǎn)酶菌株可以控制真菌形態(tài)，使其長(zhǎng)成長(zhǎng)絲狀菌絲，易于制備原生質(zhì)體，而本研究使用的黑曲霉檸檬酸生產(chǎn)菌株H915-1未能通過(guò)培養(yǎng)基優(yōu)化得到長(zhǎng)絲狀菌體，而始終以粗短菌絲存在，故而原生質(zhì)體制備非常困難。

作者對(duì)黑曲霉檸檬酸生產(chǎn)菌株H915-1的原生質(zhì)體形成條件進(jìn)行了優(yōu)化，從酶解液成分與配比、酶解作用條件和菌體生長(zhǎng)條件三方面入手，系統(tǒng)探索了PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體法，建立了遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，提供了始終只能以粗短菌絲存在的黑曲霉的原生質(zhì)體制備的方法，為進(jìn)一步改造黑曲霉工業(yè)生產(chǎn)菌株奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1菌株和質(zhì)粒黑曲霉H915-1：江蘇國(guó)信協(xié)聯(lián)能源有限公司檸檬酸生產(chǎn)菌株；構(gòu)巢曲霉：南京師范大學(xué)陸玲教授惠贈(zèng)；pUC18和pMD19：TaKaRa公司；E.coli JM109：Stratagene公司；pRS303：作者所在實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

1）LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨 10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L；pH 7.0，固體培養(yǎng)基添加1.5 g/ dL的瓊脂粉。篩選培養(yǎng)基需加入100μg/mL氨芐青霉素或硫酸卡那霉素。

2）LB孢子萌發(fā)培養(yǎng)基：胰蛋白胨 10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 5 g/L；pH 5.0。

3）ME培養(yǎng)基：麥芽提取物 30 g/L，胰蛋白胨5 g/L。

4）上層培養(yǎng)基：麥芽提取物 30 g/L，胰蛋白胨5 g/L，1.2mol/L山梨醇，1 g/dL的瓊脂。

5）下層培養(yǎng)基：麥芽提取物 30 g/L，胰蛋白胨5 g/L，1.2mol/L山梨醇，1.5 g/dL的瓊脂，加入相應(yīng)抗生素。

以上培養(yǎng)基均為121℃滅菌15min。

6）MC緩沖液：50 mmol/L CaCl2，20 mmol/L Mes/NaOH，pH 5.8。

7）STC緩沖液：1.2 mol/L山梨醇，50 mmol/LCaCl2，10mmol/L Tris，pH 7.5。

8）PEG緩沖液：25%PEG 6000，50mmol/LCaCl2，10mmol/L Tris，pH 7.5。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1黑曲霉和構(gòu)巢曲霉基因組的提取在茄子瓶中用ME斜面培養(yǎng)黑曲霉H915-1或構(gòu)巢曲霉，35℃倒置培養(yǎng)5～7 d至長(zhǎng)出濃密孢子，加入5 mL 0.1%Tween-20，用接種鏟刮取孢子，用mirocloth過(guò)濾除去菌絲體，孢子液經(jīng)稀釋后用血球計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。按3×105CFU/mL接種孢子至ME液體培養(yǎng)基，35℃、200 r/min培養(yǎng)2 d，用mirocloth收集菌球，并擠壓干水分。按照DNeasy Plant Mini Kit說(shuō)明書提取絲狀真菌基因組。

1.2.2表達(dá)載體的構(gòu)建

1）pMHT載體的構(gòu)建：mbf啟動(dòng)子通過(guò)引物mbf-F和mbf-R-hph從黑曲霉基因組中克隆得到，hph基因通過(guò)引物mbf-F-hph和hph-R-trpC以pRS303為模板得到，trp終止子通過(guò)引物hph-F-trpC和trp-R從構(gòu)巢曲霉基因組中克隆得到，通過(guò)融合PCR構(gòu)建Pmbf-hph-Ttrp表達(dá)框，并連接到pMD19上得到pMHT。轉(zhuǎn)化黑曲霉的抗性表達(dá)框?yàn)橥ㄟ^(guò)引物mbf-F和trp-R，以pMHT為模板擴(kuò)增得到3 300 bp的片段。

2）pGGT載體的構(gòu)建：gpdA啟動(dòng)子通過(guò)引物gpd-F和gpd-R從構(gòu)巢曲霉基因組中克隆得到，序列的5'和3'端分別加入Sma I和Bam HI位點(diǎn)，sGFP參照文獻(xiàn)由全序列合成得到［13］，序列5'和3'端分別加入Bam HI和Pst I位點(diǎn)，trp終止子通過(guò)trp-F和trp-R以pMHT為模板擴(kuò)增得到，序列的5'和3'端分別加入Pst I和Hin d III位點(diǎn)。PgpdA-sGFP-Ttrp表達(dá)框通過(guò)酶切連接構(gòu)建。Ttrp由Hin dⅢ和 PstⅠ酶切，sGFP由 PstⅠ和 Bam HI酶切，PgpdA由XmaⅠ和Bam HI酶切，3個(gè)片段依次連接到pUC18上，得到pGGT。轉(zhuǎn)化黑曲霉的GFP表達(dá)框?yàn)橥ㄟ^(guò)引物gpd-F和trp-R，以pGGT為模板擴(kuò)增得到3 800 bp的片段。

利用引物hph-F1和hph-R1鑒定hph整合的轉(zhuǎn)化子，利用引物GFP-F1和GFP-R1鑒定sGFP整合的轉(zhuǎn)化子。

載體構(gòu)建和鑒定重組子整合所用到的引物見表1。

表1　引物序列Table 1　Primer sequences

1.2.3黑曲霉H915-1原生質(zhì)體的制備按3×105CFU/mL的濃度接種孢子至ME液體培養(yǎng)基，30℃、200 r/min培養(yǎng)過(guò)夜。用mirocloth收集菌球，并用無(wú)菌水清洗菌球。稱取一定量的酶，并用含不同滲透壓穩(wěn)定劑的MC溶解，用無(wú)菌濾膜過(guò)濾除菌。稱取一定量菌球加入到酶解液中，37℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)2～4 h，4℃、2 000 r/min離心10 min，棄上清液，加入相同體積預(yù)冷的STC，4℃、1 000 r/min離心10 min，棄上清液，洗滌2次，加入100μL STC，混勻得到原生質(zhì)體懸液，可直接用于轉(zhuǎn)化。

1.2.4原生質(zhì)體再生將原生質(zhì)體懸液在顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)A，用STC溶液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，涂布于上層培養(yǎng)基上。35℃培養(yǎng)1～2 d至單菌落出現(xiàn)，進(jìn)行計(jì)數(shù)B。為消除菌絲體片段形成菌落造成的誤差，等量稀釋的原生質(zhì)體涂布于ME固體培養(yǎng)基，菌落計(jì)數(shù)C。再生率計(jì)算公式：原生質(zhì)體再生率=［（B-C）/A］×100%。

1.2.5PEG介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化黑曲霉原生質(zhì)體100μL黑曲霉原生質(zhì)體中加入1μg質(zhì)粒和330μL PEG緩沖液，冰上放置20 min，加入2 mL PEG，室溫放置10min，依次加入4mL STC和4mL于48℃預(yù)熱的上層培養(yǎng)基，鋪板于含有180 mg/L潮霉素的下層培養(yǎng)基上。平板在33℃倒置培養(yǎng)3～7 d，直至出現(xiàn)菌落，挑取單菌落傳代。

2　結(jié)果與討論

2.1原生質(zhì)體制備條件的優(yōu)化

2.1.1黑曲霉H915-1細(xì)胞壁消化的酶復(fù)合液成分比例的優(yōu)化黑曲霉的細(xì)胞壁成分主要是葡聚糖和幾丁質(zhì)［1，14］，此外，β-葡萄糖醛酸酶的酶活作用影響原生質(zhì)體形成效率［14］。不同株系的黑曲霉細(xì)胞壁成分略有差別，黑曲霉CBS 513.88只用溶壁酶一種成分即可消化得到黑曲霉原生質(zhì)體，黑曲霉K10僅需使用蝸牛酶即可獲得原生質(zhì)體，找到合適的細(xì)胞壁裂解酶的配比是制作原生質(zhì)體的基礎(chǔ)［15］。對(duì)酶復(fù)合液的成分和比例進(jìn)行了優(yōu)化。對(duì)于黑曲霉H915-1，單獨(dú)使用蝸牛酶和溶壁酶都無(wú)法獲得原生質(zhì)體，當(dāng)使用復(fù)合酶液均可以得到原生質(zhì)體，但效果不同。當(dāng)使用溶壁酶、幾丁質(zhì)酶和葡萄糖醛酸酶時(shí)，相較于其它種類的酶解液得到的原生質(zhì)體數(shù)最多，進(jìn)一步優(yōu)化該酶解液中各酶濃度，發(fā)現(xiàn)5 mg/mL溶壁酶、0.2 U/mL幾丁質(zhì)酶和460 U/mL葡萄糖醛酸酶時(shí)，得到的原生質(zhì)體數(shù)目最多，為6.7×105個(gè)/mL，見表2。對(duì)于H915-1，溶壁酶破壞葡聚糖，幾丁質(zhì)酶降解幾丁質(zhì)，β-葡萄糖醛酸酶促進(jìn)破壞細(xì)胞間的粘附作用，這3種酶共同作用得到最優(yōu)的原生質(zhì)體酶解條件。消化酶的濃度需要嚴(yán)格的界定，任意一種酶的過(guò)量都會(huì)造成原生質(zhì)體濃度下降。一方面，由于原生質(zhì)體是從細(xì)胞壁間隙擠出，需要配合間隙大?。ㄓ上富钚钥刂疲?、胞內(nèi)外滲透壓差和轉(zhuǎn)速來(lái)完成原生質(zhì)體的形成和釋放；另一方面，消化酶對(duì)細(xì)胞膜具有破壞作用，過(guò)量的酶會(huì)造成細(xì)胞的損傷，這也可能與消化酶并非純酶有關(guān)，商品化的酶雖然經(jīng)過(guò)純化但依然含有大量雜質(zhì)。

表2　原生質(zhì)體形成的酶復(fù)合液的優(yōu)化Table 2　Im provement of A.niger protoplasting w ith different digest enzyme

2.1.2酶解作用條件的優(yōu)化滲透壓穩(wěn)定劑的種類對(duì)原生質(zhì)體形成有重要影響，不僅可以保護(hù)原生質(zhì)體減慢膨脹破裂的速度，而且其中的離子可能會(huì)對(duì)酶起激活作用。絲狀真菌原生質(zhì)體形成所需的滲透壓穩(wěn)定劑包括無(wú)機(jī)鹽類的 KCl、NH4Cl、MgSO4、（NH4）2SO4［16］等，有機(jī)物穩(wěn)定劑為山梨醇和甘露醇。Arati Das的研究認(rèn)為，黑曲霉原生質(zhì)體形成的最適滲透壓穩(wěn)定劑是MgCl2［17］，Charissa de Bekker則以山梨醇為滲透壓穩(wěn)定劑來(lái)制備黑曲霉原生質(zhì)體［17］。有機(jī)物穩(wěn)定劑可以提高原生質(zhì)體制備時(shí)離心收集的回收率，因此盡可能選用有機(jī)物穩(wěn)定劑提供滲透壓。選擇了原生質(zhì)體制備常用的滲透壓穩(wěn)定劑，由圖1（a）可知，H915-1在0.9 mol/L KCl中易形成原生質(zhì)體，在0.4 mol/LMgSO4和0.8 mol/L山梨醇溶液中，菌絲體很少被消化，只有極少量原生質(zhì)體形成，而且不同的消化酶成分在這兩種滲透壓穩(wěn)定劑下都很難促使原生質(zhì)體生成，只有以KCl為滲透壓穩(wěn)定劑時(shí)，原生質(zhì)體大量形成。細(xì)胞壁本身帶負(fù)電荷，具有吸附陽(yáng)離子的功能［19］，可能細(xì)胞壁成分的差異造成了陽(yáng)離子吸附量的差異，對(duì)酶解液的酶活有影響，從而找到合適的滲透壓穩(wěn)定劑是原生質(zhì)體制備的關(guān)鍵因素之一。

KCl的濃度與原生質(zhì)體形成相關(guān)，只有胞外滲透壓略低于胞內(nèi)滲透壓引起黑曲霉細(xì)胞膨脹，才會(huì)從被酶解的細(xì)胞壁間隙“排”出原生質(zhì)體，當(dāng)原生質(zhì)體滲出到一定程度，適當(dāng)程度的振動(dòng)使原生質(zhì)體脫離菌絲，形成游離的原生質(zhì)體。滲透壓穩(wěn)定劑濃度越低，原生質(zhì)體產(chǎn)生的速度越快，但其膨脹速度也快，最終破裂，因此低滲溶液的原生質(zhì)體穩(wěn)定性差，為此需要確認(rèn)最佳的滲透壓穩(wěn)定劑濃度，由圖1（b）可知最適的KCl濃度為0.7mol/L，可以得到9×105個(gè)/mL原生質(zhì)體，0.9 mol/L KCl得到的原生質(zhì)體數(shù)略低，而在0.5 mol/L KCl中消化后的得到的原生質(zhì)體比0.7 mol/L KCl減少了2/3，說(shuō)明低滲溶液嚴(yán)重影響了原生質(zhì)體的形成和穩(wěn)定性。

菌體量是制備原生質(zhì)體的關(guān)鍵因素，過(guò)量的菌體意味著酶的底物增加，會(huì)造成被酶解的細(xì)胞壁間隙變小，菌絲消化不徹底會(huì)導(dǎo)致原生質(zhì)體制備失敗；而菌體量不足會(huì)造成原生質(zhì)體數(shù)量的減少。如圖1（c）所示，在5 mL酶解液中，制備H915-1原生質(zhì)體的最適菌體量為15 mg，增加菌體量會(huì)導(dǎo)致原生質(zhì)體量急劇減少，20 mg的菌體量是15 mg菌體量產(chǎn)生的原生質(zhì)體量的1/5。

溫度對(duì)原生質(zhì)體形成的影響在于酶液在不同溫度下的酶活及酶的穩(wěn)定性不同，而原生質(zhì)體形成需要用到3種酶，葡萄糖醛酸酶和幾丁質(zhì)酶的最適溫度為37℃，但幾丁質(zhì)酶在37℃的穩(wěn)定性較差，因此需要考察它們?cè)诓煌瑴囟认碌膮f(xié)同作用，由圖1（d）可見，37℃是比較適合的酶作用溫度。

圖1　酶解作用條件的優(yōu)化Fig.1　Optim ization of digestion conditions for protoplasting

酶解時(shí)間對(duì)獲得原生質(zhì)體的影響在于需要盡可能完全消化掉菌絲體，但維持時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，以減少低滲及酶的作用造成的原生質(zhì)體破裂及活力下降。酶解1 h，菌絲體即被消化成原生質(zhì)體。酶解2 h時(shí)，原生質(zhì)體被釋放到酶解液中，且獲得的原生質(zhì)體活性較好，存活率為95%以上。酶解3 h時(shí)，原生質(zhì)體存活率下降至85%，見圖2。

圖2　黑曲霉原生質(zhì)體的形成和釋放Fig.2　A.niger protoplasts formed from mycelium

2.1.3菌體生長(zhǎng)條件的優(yōu)化菌絲體的菌齡對(duì)原生質(zhì)體形成有重要影響。在20mLME培養(yǎng)基中接種107個(gè)孢子，30℃、200 r/min培養(yǎng)不同時(shí)間。由圖3可知，孢子由分散的狀態(tài)逐漸粘附到固形顆粒上；8 h時(shí)，固形顆粒上粘附了大量的孢子，且固形顆粒也相互粘連在一起，此時(shí)孢子吸脹；12 h時(shí)，孢子剛萌發(fā)出菌絲，形成菌球；16 h的菌球更大，菌絲層剛好完全包裹住固形顆粒及孢子；20 h的菌絲層更厚，菌球形狀更規(guī)則，趨于圓形。

制備原生質(zhì)體需要幼嫩的菌絲，孢子萌發(fā)初期的菌絲體更容易被降解。但隨著培養(yǎng)時(shí)間的縮短，菌絲可能無(wú)法完全包裹住菌球，造成ME固形物裸露于酶解液中，被酶解為小碎片。其混雜于原生質(zhì)體中，不僅影響酶液降解菌絲體，并且無(wú)法與原生質(zhì)體分離，影響后續(xù)化學(xué)轉(zhuǎn)化；相反，隨著菌齡增加，菌球更大，表層疏散的菌絲體被消化后，開始消化內(nèi)部連接較為緊密的菌絲體，見圖3。此時(shí)，由于負(fù)責(zé)降解細(xì)胞間的粘連作用的葡萄糖醛酸酶只能作用于表層菌絲，因此形成大量未分散的原生質(zhì)體團(tuán)，且粘連在固形顆粒上，為使原生質(zhì)體團(tuán)分散，只能延長(zhǎng)酶解時(shí)間，而酶解時(shí)間的延長(zhǎng)造成早期形成的原生質(zhì)體的損失，為此需要確定黑曲霉在ME中培養(yǎng)的時(shí)間，即菌絲層厚度對(duì)原生質(zhì)體形成的影響。由圖4可知，30℃、200 r/min培養(yǎng)16 h得到的原生質(zhì)體最多，此時(shí)的菌絲層厚度為50μm左右。

圖3　黑曲霉H915-1在ME培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)Fig.3　Grow th of A.niger H 915-1 in ME medium

圖4　培養(yǎng)時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體形成的影響Fig.4　Effect of culture time on protoplasting

為減少制備原生質(zhì)體的成本，需要盡可能減少幾丁質(zhì)酶的用量。通過(guò)在菌體生長(zhǎng)階段添加Mn2+，考察最終將等量菌體在相同時(shí)間內(nèi)完全消化成原生質(zhì)體所需的幾丁質(zhì)酶的用量，見表3。在不添加Mn2+時(shí)，幾丁質(zhì)酶濃度需要0.2 U/mL；添加Mn2+至1mg/mL和10 mg/mL，幾丁質(zhì)酶用量可以減少1/2。Mn2+對(duì)黑曲霉合成檸檬酸有重要影響［19］，同時(shí)也反映了它對(duì)黑曲霉細(xì)胞壁合成、孢子形成和次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成有重要影響［20］。在缺乏Mn2+時(shí)，細(xì)胞壁含有更高含量的幾丁質(zhì)，而本研究中添加Mn2+顯著減少了制備原生質(zhì)體所需的幾丁質(zhì)酶的用量。

表3　培養(yǎng)基中添加M nCl2對(duì)原生質(zhì)體形成的影響Table 3　M nCl2addition in ME medium facilitated A. niger protoplasting

黑曲霉在孢子萌發(fā)前首先進(jìn)行聚集，因此黑曲霉是以菌絲聚集體的形式存在于液體培養(yǎng)基中。為增加菌體與酶解液的接觸面積，促進(jìn)消化，期望孢子以單體形式萌發(fā)，而不形成菌球。葡萄糖醛酸酶具有減少原生質(zhì)體間粘附的作用［6］，在LB孢子萌發(fā)培養(yǎng)基中添加460 U/mL葡萄糖醛酸酶，獲得了分散生長(zhǎng)的孢子，見圖5。以萌發(fā)的孢子取代菌球進(jìn)行酶解，完全消化菌絲體的時(shí)間從2 h縮短至1.5 h，獲得的原生質(zhì)體量提升了20%。獲得分散的孢子還可以在其它方面進(jìn)行應(yīng)用，比如利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行轉(zhuǎn)化后篩選已經(jīng)在動(dòng)物細(xì)胞中獲得廣泛的應(yīng)用［21］，利用GFP為標(biāo)記基因，不需要繁雜的抗性篩選，直接用流式細(xì)胞儀即可篩選陽(yáng)性克隆，而且由于篩選的是單個(gè)細(xì)胞，因此可以避免嵌合體的產(chǎn)生。但這個(gè)方法需要獲得單個(gè)的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞，本研究提供了獲得獨(dú)立的萌發(fā)孢子的方法，為后續(xù)研究提供技術(shù)支撐。

圖5　葡萄糖醛酸酶作用下孢子的萌發(fā)Fig.5　Conidia grew separated inmediaw ith glucuronidase

2.2sGFP在黑曲霉H 915-1中的整合表達(dá)

利用PEG介導(dǎo)法，將線性化的sGFP表達(dá)框和hph表達(dá)框（圖6a）進(jìn)行共轉(zhuǎn)化（片段比例為10∶1），共得到31個(gè)轉(zhuǎn)化子有持續(xù)的潮霉素抗性，提取轉(zhuǎn)化子的基因組進(jìn)行PCR鑒定，所有的潮霉素抗性轉(zhuǎn)化子均能擴(kuò)增到hph條帶（圖6b），為整合表達(dá)hph的轉(zhuǎn)化子。其中有18個(gè)轉(zhuǎn)化子的基因組可以擴(kuò)增出sGFP條帶（圖6c），為整合hph和sGFP兩個(gè)片段的轉(zhuǎn)化子，片段共整合的概率為58%，圖7為轉(zhuǎn)化子表達(dá)GFP在藍(lán)光激發(fā)光下的熒光。在高等生物中，主要利用非同源末端連接進(jìn)行外源片段對(duì)基因組的整合［22-23］，利用該方式，可以同時(shí)使多個(gè)片段整合到基因組上，是目前改造高等生物包括真菌最常用的方式。本研究針對(duì)菌絲粗短的黑曲霉檸檬酸生產(chǎn)菌株建立了高效的原生質(zhì)體制備方法并建立了PEG介導(dǎo)的共轉(zhuǎn)化方法，為后續(xù)改造此類黑曲霉奠定了基礎(chǔ)。

圖6　共轉(zhuǎn)化表達(dá)框示意圖及轉(zhuǎn)化子基因組的PCR鑒定Fig.6　Structures of cassettes for co-transformation and PCR am plification for gene insertion in genomes of transformants

圖7　黑曲霉菌絲體表達(dá)sGFP在激發(fā)光下產(chǎn)生綠色熒光Fig.7　sGFP expression in A.niger hyphae

3　結(jié)語(yǔ)

黑曲霉是重要的工業(yè)生產(chǎn)菌，作為絲狀真菌，對(duì)其進(jìn)行遺傳改造最有效的方法是PEG-介導(dǎo)的原生質(zhì)體法，實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵是制備有活力的原生質(zhì)體，但一般需要對(duì)長(zhǎng)絲狀菌絲體進(jìn)行消化來(lái)進(jìn)行原生質(zhì)體的制備，而檸檬酸生產(chǎn)菌H915-1在培養(yǎng)基中始終以短粗菌絲存在，故需要建立其適用的原生質(zhì)體制備方法并建立遺傳轉(zhuǎn)化方法。本文對(duì)酶解液成分與配比、酶解作用條件和菌體生長(zhǎng)條件三方面進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化，確定了原生質(zhì)體制備的最優(yōu)條件。此外，鑒于Mn2+對(duì)黑曲霉細(xì)胞壁合成、孢子形成和次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成有重要影響，本文通過(guò)在菌體生長(zhǎng)時(shí)添加Mn2+可以減少原生質(zhì)體形成所需的酶量，并通過(guò)葡萄糖醛酸酶的添加獲得了獨(dú)立萌發(fā)的孢子，對(duì)其進(jìn)行處理可以進(jìn)一步促進(jìn)原生質(zhì)體的形成。最終以PEG介導(dǎo)法實(shí)現(xiàn)了兩個(gè)表達(dá)框的共轉(zhuǎn)化，且基因在黑曲霉中可以進(jìn)行穩(wěn)定的表達(dá)。該方法的建立為代謝改造黑曲霉檸檬酸工業(yè)生產(chǎn)菌株奠定基礎(chǔ)。

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Protop lasting Im provement of Industrial Citrate-Producing Aspergillus niger for DNA Transformation

YIN Xian1，2，PANG Dongqia2，HAN Ruizhi2，LIJianghua1，2，LIU Long1，2，DU Guocheng1，2，CHEN Jian1，2
（1.Key Laboratory of Industrial Biotechnology，M inistry of Education，Jiangnan University，Wuxi214122，China；2.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi214122，China）

Thisarticleaimedtooptim izeprotoplast formationconditionsof industrial citrate-producing Aspergillus niger to establish genetic transformation system.As protoplasts were formed by enzyme digestion，components of enzyme m ixtures，digestion conditions and hyphae grow th conditionswere studied.The optimized enzymem ixture contained 5mg/m L lysing enzyme，0.2 U/m L chitinase and 460 U/m L glucuronidase.The best conditions for protoplasting were using 0.7 M KCl as osmotic stabilizer，thickness of pellets hyphae for 50μm，cellweight of 0.003 g/m L. Furthermore，addition ofMn2+in culturemedium helped reduce the chitinase concentration necessary for protoplasting.In addition，glucuronidase in culturemedium facilitated conidia separation during germination，further improved protoplast formation.Finally，two cassetteswere inserted into genomesimultaneously.

Aspergillus niger，citric acid，protoplast，co-transformation

Q 93

A

1673—1689（2016）09—0963—08

2015-01-14

江蘇省研究生創(chuàng)新工程項(xiàng)目（CXZZ11_0477）；江南大學(xué)博士研究生科學(xué)研究基金（JUDCF11008）。

殷 嫻（1982—），女，江蘇無(wú)錫人，發(fā)酵工程博士研究生。E-mail：yinxianshirley@yahoo.com.cn

陳堅(jiān)（1962—），男，江蘇揚(yáng)州人，工學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事食品生物技術(shù)和生化工程方面的研究。E-mail：jchen@jiangnan.edu.cn